粉砂moluccana(l)Willd。标准化的干的叶子:机械Antinociceptive属性提取和化学标记

文摘

寻求开发一种新的镇痛植物学期刊,讨论提取(SDE)粉砂moluccana(l)Willd。叶子是在扩大开发(5公斤)。SDE的标准化在3% w / w与类黄酮2′′-O-rhamnosylswertisin。SDE的批次进行评估与他们的物理、生化的,药理特性。结果表明扩大端过程的再现性,口服服用后,减少carrageenan-induced机械hypernociception ID₅₀% 443毫克/公斤。类似的结果与动物注射完全弗氏佐剂(CFA),剖析造成抑制的48±4%。SDE是有效预防前列腺素E2 (PGE2)全身机械hypernociception(抑制26±10%,33±3%,250和500毫克/公斤,分别)。Swertisin和2′′-O-rhamnosylswertisin隔绝的提取是有效地抑制hypernociceptive角叉菜胶引起的响应(70±2%和50±5%,职责)。此外,2′′-O-rhamnosylswertisin能够显著抑制机械敏感引起的CFA或PGE2,压抑的25±3%和94±6%,分别。这些结果表明,相关数据的影响,至少在某种程度上,这些黄酮类化合物的存在。

1。介绍

粉砂moluccana(l)Willd。,大戟科,俗称“桐树树”或“印度核桃”,其他的名字,是一个土生土长的植物到马来西亚,波利尼西亚,和南太平洋诸岛,广泛分布在整个热带地区。它是一个中型的树,高10米,长得在巴西南部和东南部的南里奥格兰德(圣保罗)。用于民间医药治疗发烧、炎症、哮喘、肝炎、头痛、胃溃疡等。它的种子是用作治疗风湿病的和作为肥料1,2]。先前的研究已经表明,二氯甲烷分数获得的叶子和树皮答:moluccana提出了抗病毒活性(3),以及抗菌效果金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌(4]。这种植物的叶子的甲醇提取物表现出降血脂药的影响(5]。

答:moluccana介绍了巴西在1980年代作为装饰性的树,是一个重要的石油来源用于制革厂[6]。有大面积在圣卡塔琳娜州州(巴西)有超过6000棵树,可以为医药行业提供足够的原料,和文化的驯化物种已经开始了。我们的研究小组所做的研究已经证明了树的性能在某些类型的切割和发现,发展,要求三到四个月发芽。这些研究的目的是保证蔬菜原料来源没有干涉树的生长,从而确保可持续发展的高潮的生物多样性管理草药(7]。这些结果与之前的研究结果相一致,观察到它可以承受高和低pH值,可怜的土壤,斜坡,年降雨量6.4到42.9 dm (6]。

以前我们的研究小组进行的实验研究也表明,hydroalcoholic提取的答:moluccana叶子和己烷部分展览antinociceptive效果,抑制acetic-acid-induced腹部盘绕在老鼠8]。这个活动可能与存在的2′′-O-rhamnosylswertisin,黄酮C配糖体,导致92±4%抑制当评估在相同的模型9]。然而,一个更友好的技术提取需要开发,以使工业生产的中草药产品,必须获得大规模、标准化与化学标记,稳定,安全,和证明在临床前和临床疗效的研究,为进一步的监管机构的许可营销和目的,在专利(7]。

因此,这项工作的目的是获得一个可再生的讨论中提取(SDE)按比例增长,标准化与化学标记,类黄酮2′′-O-rhamnosylswertisin (MW = 592 g),主要的化合物的选择提取证明答:moluccana树叶和评估antinociceptive效应的技术产品,钻,和两个纯化物质,2′′-O-rhamnosylswertisin swertisin,在不同实验模型小鼠的疼痛。

2。材料和方法

2.1。收集的植物材料

的叶子答:moluccanaWilld。在Tijucas收集2007年7月,在圣卡塔琳娜州,巴西,和被教授Ademir里斯(植物学部门/ UFSC,弗洛,SC,巴西)。凭证标本是沉积在巴博萨罗德里格斯标本(伊塔雅伊、SC、巴西)号码VC球场001。

2.2。准备标准化干提取

三批干提取准备Centroflora (Botucatu、SP、巴西)中试规模(5公斤)使用萃取条件优化在之前由我们组工作。70公斤的干草药药物浸渍了5天的反应堆,没有搅拌,以700 L (70: 30 (v / v)乙醇:水在室温下的解决方案。解决方案是经过,通过滤光轮(40毫米),那么通过简而言之用滤纸过滤。解决方案集中在Bernauer集中器在70°C下真空(400毫米汞柱),获得大约40%的总固体。集中是混合了约25% (w / w总固体量集中)的胶体二氧化硅和干工业喷雾干燥器(赫亚尼罗、Søborg、丹麦)的入口温度165 - 180°C和70 - 80°C的出口温度。

干提取进行了分析:形态学方面通过扫描电子显微镜(SEM)放大60 x,颜色、味道、气味、水分、pH值(10%解决方案在水中),水溶解度(浓度为10%),和体积密度,根据描述的方法在美国药典(10]。

提取是标准化的高效液相色谱法(HPLC),基于标记的内容,2′′-O-rhamnosylswertisin,使用下面描述的方法。

2.2.1。分离、鉴定和纯度测定Swertisin和2 -O-Rhamnosylswertisin

磨碎的风干的叶子答:moluccana(600克)在室温下与甲醇提取了7天。解决方案被蒸发在真空获得甲醇粗提物(收益率为8.5%)。净化过程(色谱column-CC)进行了粗甲醇提取使用硅胶60(70 - 230目)和提高二氯甲烷浓度的甲醇洗脱给九个分数(I-IX)。分数I和II是分组,报硅胶CC筛选了与二氯甲烷和甲醇的混合物在step-gradient模式中,收益率swertisin(1)(图1)的形式黄色,非晶粉末(20毫克),议员242.6到243.4°C。化学结构经核磁共振-¹H和¹³如前所报道,C (11,12]。同样,分数III和IV分组,报硅胶CC筛选了的二氯甲烷和甲醇作为洗脱液,与极性增加,其次是闪光色谱筛选了与二氯甲烷和甲醇的混合物(8:3)收益率2′′-O-rhamnosylswertisin(2)(图1)的形式黄色粉末(490毫克)。化学结构经核磁共振-¹H和¹³C之前报道(11,13]。

Swertisin (1)是一种无定形粉末,议员242.6 - -243.4°C。证实了孤立的复合使用力量ac - 300核磁共振光谱仪器、操作在300 MHz¹H和75.5 MHz¹³使用CD C和₃OD作为溶剂。¹H NMR: 3.15 - -3.90 (m, 6 H,相关),3.94 (3 H, s,哟₃),4.40 (1 h, m, H1′′), 6.63 (1 h, s, H3), 6.71 (1 h, s, H8), 6.90 (2 h d,H5 H3′′), 7.80 (2 h d,H2′,类推′)。¹³C NMR: 55.9(哟₃),63.3 (C6′′), 71.4 (C4′′), 72.1 (C1′′), 74.6 (C3′′), 80.9 (C2′′), 83.2 (C5′′), 96.9 (C3), 101.4 (C8), 101.5 (C10), 111.8 (C6), 116.8 (C3′, C5′), 121.8 (C1′), 128.7 (C2′, C6′), 157.5 (C5), 161.6 (C4′), 162.5 (C9), 164.4 (C1), 164.5 (C7)和182.8 (C4)。

2′′-O-rhamnosylswertisin (2)一个非晶粉末,议员260.5 - -261.0°C。核磁共振光谱法(CD₃OD)。¹H NMR: 0.65 (3 H, d,,代替′′′),3.10 - -3.90 (m, 6 h,相关,5 h rham) 3.96 (3 h, s,哟₃),4.55 (1 h, m, H1′′), 5.11 (1 h, m, H1′′′), 6.67 (1 h, s, H3), 6.76 (1 h, s, H8), 6.93 (2 h d,H5 H3′′), 7.89 (2 h d,H2′,类推′)。¹³C NMR: 18.0 (C6′′′), 55.9(哟₃),62.4 (C6′′), 64.4 (C5′′′), 70.0 (C4′′), 72.1 (C2′′′), 72.2 (C3′′′), 72.5 (C4′′′), 73.6 (C1′′), 76.9 (C3′′), 79.0 (C2′′), 81.8 (C5′′), 102.3 (C3), 103.1 (C1′′′), 103.7 (C8), 103.9 (C10), 111.1 (C6), 117.8 (C3′, C5′), 121.9 (C1′), 129.7 (C2′, C6′), 159.2 (C5), 159.5 (C4′), 165.5 (C9), 165.0 (C1), 167.0 (C7)和184.0 (C4)。

MS分析质/ MS系统:SCL-10AVP系统控制器(日本岛津公司),LC-10ADVP溶剂输送系统和一个FCV-10ALVP阀(日本岛津公司集团,日本京都)与Micromass Quattro LC质谱仪(水域Corp .,米尔福德,MA)串联)化合物添加到溶剂流的注入0.6 mL / min,分裂1:3,乙腈:50毫米醋酸铵(90:10,v / v)。这是通过一个女士带进ESI源和测量在负离子模式下。雾化是通过使用氮气的压力50 L / h。毛细管温度设定在350°C。质谱记录在负离子模式下显示(mh) + m / z 591年达到峰值,这是符合预期的分子量为592 (C₂₈H₃₂O₁₄)为2′′-O-rhamnosylswertisin。MS / MS分析显示亏损146质量(m / z 445峰值),对应的损失rhamnosyl一半。峰也观察到m / z 427和m / z 324。应该指出,这是第一个报告女士这种化合物的分析。

2.2.2。定量分析2′′-O-Rhamnosylswertisin干提取类黄酮

高效液相色谱系统由一个水域600泵(美国质量米尔福德);2996年PDA探测器、自动717 +喷射器,脱气器AF,和年授权软件。注射(20μL)进行了在C8 X-Bridge 150×6毫米(5嗯)(水域,陶顿,质量,美国)。一个梯度的流动相组成(乙腈)和B(与醋酸酸化水pH值3.54)的10:90 (B)(0分),25日:75(20分钟),和10:90(30分钟),维持这个成分,直到40分钟,流速为0.5毫升·分钟⁻¹。分析监测在338 nm和柱温箱适合30°C。

溶剂都是高效液相色谱级(美国俄亥俄州Tedia、费尔菲尔德)和被超声脱气浴(独特,圣Amaro,圣保罗,巴西)。使用Milli-Q水纯化系统(微孔、Billerica质量,美国)。所有的解决方案都是透过0.45μm膜(微孔、Billerica的质量,美国)。

2.2.3。药理研究

动物
女性瑞士老鼠(25 - 30 g),获得淡水河谷大学的伊塔雅伊(UNIVALI、伊塔雅伊、巴西),是本研究中使用。雌性老鼠选择调查机械hypernociception基于文献数据,这表明女性更容易发展慢性伤害感受(14,15]。动物们被安置的条件下最优光,温度和湿度(12 h,每个周期22±1°C,湿度60 - 80%),提供食物和水随意。本研究中使用的所有程序后从国家卫生研究院发布“实验动物保健原则”。85 - 23和动物伦理委员会批准UNIVALI(协议编号416/2008 UNIVALI)。动物的数量和使用的有害刺激的强度最低必要证明一致的效果。每组动物的数量是5 - 8。

Carrageenan-Induced机械Hypernociception
诱导炎性疼痛,老鼠收到身份证,注入50μ卡拉胶(300 Lμg /爪)的表面下正确hindpaw [14]。评估的系统性影响药物治疗,老鼠了答:moluccana钻(批处理1、2或3;125 - 500毫克/公斤,订单),2′′-O-rhamnosylswertisin(30毫克/公斤;50.6μ摩尔/公斤,订单),swertisin(30毫克/公斤,67.2μ摩尔/公斤,订单),吲哚美辛(0.1 - 5毫克/公斤,订单),或车辆(10毫升/公斤,0.9%氯化钠溶液),角叉菜胶注射前1 h。的机械hypernociception组评估通过冯·弗雷细丝(VFH), 48 h后角叉菜胶管理,如下所述。

CFA-Induced机械Hypernociception
为了评估预防效果,建立小鼠口服预处理答:moluccana剖析批1;125 - 500毫克/公斤),2′′-O-rhamnosylswertisin(10毫克/公斤;16.86μ摩尔/公斤,订单),吲哚美辛(10毫克/公斤,订单。),或车辆(10毫升/公斤,0.9%氯化钠溶液)。1 h后,他们收到一份身份证注射完全弗氏佐剂(CFA)(1毫克/毫升heat-killed和干结核分枝杆菌;每毫升的车辆包含0.85毫升石蜡油+ 0.15毫升mannide油酸酯;20μL /爪)正确的hindpaw [16]。机械hypernociception评估CFA注入后48 h。

引起的机械Hypernociception铂族元素₂
评估机械hypernociception,老鼠接受答:moluccana剖析批1;125 - 250毫克/公斤,i.p), 2′′-O-rhamnosylswertisin(10毫克/公斤;16.86μ摩尔/公斤,订单),吗啡(5毫克/公斤,南卡罗来纳州),或车辆(10毫升/公斤,0.9%氯化钠溶液),身份证前30分钟注射前列腺素E₂(铂族元素₂)(0.1 nmol /爪)16]。机械hypernociception VFH测量,如下所述,在不同的时间点后身份证铂族元素的注入₂。

冯·弗雷Hair-Induced Hindpaw戒断反应
评估机械hypernociception,老鼠单独放置在明确有机玻璃盒(9×7×11厘米)在高架网平台上,允许访问的腹侧表面hindpaw。戒断反应频率测量后10应用程序•冯•弗雷(1 s每个时间)毛(美国VFH Stoelting,芝加哥,Il)。刺激是来自下面的足底表面hindpaw。动物们适应行为测试前30分钟,和机械hypernociception评估在几个时间点。VFH 0.6 g的产生意味着退出的频率约为15%,这被认为是一个适当的值的测量机械hypernociception [14,17]。因此,0.6 g VFH是本研究中使用。确定基础机械阈值,所有之前的组进行评估测试。

药品和试剂
使用以下药品和试剂:CFA(σ化学公司,圣路易斯,密苏里州美国);角叉菜胶,铂族元素₂(丙烯酰胺Riedel-de一点儿,Seelze,德国);吲哚美辛(度Importacao de Produtos Quimicos Ltda)。所有其他的试剂和溶剂使用的均为分析纯。

统计分析
结果提出了均值±S.E.M.5到7的动物,除了ID₅₀值(即。,the dose of答:moluccanaDE hypernociceptive反应减少了50%相对于控制值),这是作为手段伴随着各自的95%置信区间。ID₅₀价值观和抑制的百分比是基于AUC(曲线下的面积),计算每个实验的整个时间进程和报告为±S.E.M.获得的禁忌为每个单独的实验。统计比较的数据是由双向方差分析(方差分析),其次是Bonferroni事后测试和单向方差分析和Dunnett事后测试。值低于0.05 (或更少)被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。分离、鉴定和纯度测定黄酮类化合物

植物化学的程序进行粗甲醇提取获得答:moluccana叶子用硅胶CC和flash色谱分离和鉴定了两个主要的黄酮类物质C-glycosides swertisin (1)和2′′-O-rhamnosylswertisin (2)(图1)。虽然之前发表的光谱数据(13女士,这是第一个报告这种化合物的分析。

通过高效液相色谱纯度分析,在338 nm, 2′′-O-rhamnosylswertisin被确认,24.5分钟的保留时间和swertisin 25.5分钟保留时间图2(一个)。在338纳米集成所有的山峰后,类黄酮的纯度> 95%计算,图2(一个)。

3.2。准备标准化干提取

的答:moluccana干提取批次获得的喷雾干燥机的中试规模显示相似的物理和化学特性,表1。干提取的特征就是好,吸湿粉、球形颗粒表面光滑,颜色绿褐色,大约3%水分(图3)。2′′-O-rhamnosylswertisin提取内容相似,物理和化学结果同意在以前的研究中获得的数据来优化提取工艺和生物活性在活的有机体内。

干提取物的色谱资料高效液相色谱显示存在的各种黄酮类化合物包括2′′-O-rhamnosylswertisin(主要成分,峰值8)和swertisin(9)峰值,人物2(一个)。

3.3。药理研究

数据4(一)和4 (b)证明身份证注射角叉菜胶(300μg /爪)显著降低机械灵敏度阈值(相比),与动物的反应率对照组注射生理盐水和基底阈值。口服治疗答:moluccana(500毫克/公斤)能够减少机械hypernociception身份证注射角叉菜胶引起的,与抑制36±4%和ID₅₀% 443毫克/公斤(400 - 490)。吲哚美辛,非甾体抗炎药物作为积极的控制,还能够抑制角叉菜胶引起的机械敏感,抑制38±5%。

重要的结果与动物注射CFA,答:moluccana剖析批1;订单。)500毫克/公斤,减少了hypernociceptive阈值后6 h CFA爪子注入,抑制48±4%的剂量500毫克/公斤,看到数字4 (c)和4 (d)。nonsteroid抗炎药物吲哚美辛(10毫克/公斤,订单。),给口头,没有干扰hypernociceptive阈值由CFA在老鼠身上。

如图4 (e)和4 (f),身份证铂族元素的注入₂(0.1 nmol /爪)产生杰出的机械鼠标hindpaw hypernociceptive效果持续24 h,显著增加显示在0.6 g VFH刺激基线值。答:moluccana德(批1;125 - 500毫克/公斤,订单。,1 h) proved to be effective in significantly preventing PGE₂全身的机械hypernociception 1 h刺激物剂注射后,数据4 (e)和4 (f)。减少的百分比是26±10%,33±3%,分别为250和500毫克/公斤。吗啡(5毫克/公斤,南卡罗来纳州。),药物作为积极的控制,减少了hypernociceptive响应由铂族元素₂,抑制48±6%,数字4 (f)。

的antinociceptive影响孤立的标记,swertisin和2′′-O-rhamnosylswertisin(30毫克/公斤,订单。,1 h before), was also investigated in the carrageenan-induced mechanical hypernociception model in mice. Figures5(一个)和5 (b)证明swertisin和2′′-O-rhamnosylswertisin被有效地抑制hypernociceptive响应,与对照组相比,压抑的70±2%和50±5%,分别。此外,2′′-O-rhamnosylswertisin能够显著抑制机械敏感引起的CFA或铂族元素₂,禁忌25±3%,94±6%,分别见图5 (c)和5 (d)。2′′-O-rhamnosylswertisin占干提取所得的3%答:moluccana,高效液相色谱,见图2。

最后,当干提取生产按比例扩大测试,所有三个批次时相同的效果与之前的研究相比,数字6(一)和6 (b)。提到获得的结果是很重要的剂量250毫克/公斤呈现在图4(一)明显不同于对照组,尽管AUC表示并未证明相同。

4所示。讨论

介绍了分离、纯化、鉴定、药理作用的化学标记2′′-O-rhamnosylswertisin swertisin从叶子的答:moluccana。虽然这些黄酮类化合物被发现在其他植物,他们被认为是罕见的在高等植物和植物属于没有描述大戟科家庭。这些标记是重要的质量保证每一步植物学期刊发展并阐明其药理作用。

钻的方法制备的中试规模显示再现性和可行性用于提取工业规模生产。同时,HPLC-developed方法允许标准化提取物的植物学期刊的未来发展。

药物用于治疗慢性炎症条件不一样有效和显示药理效应作用只在抑制前列腺素类的生产而不干扰其他炎症级联的重要元素。因此,天然产物的药理验证建立在民间医学中使用在这些类型的环境是非常重要的。SDE的药理效应和标记评估模型引起的机械hypernociception重要flogistic代理如卡拉胶、铂族元素₂,足协。最初我们的研究证明了影响机械钻的hypernociception身份证注射角叉菜胶诱导的小鼠。卡拉胶是一种炎症代理,主要是用作药理研究炎症大鼠和小鼠痛觉过敏的工具(18]。当注入皮内足底动物hindpaw表面,它诱发炎症过程与痛觉过敏(19]。组织损伤后原始注射角叉菜胶涉及不同的化学介质,如铂族元素的释放₂(20.产品),肥大细胞组胺和5 -羟色胺(21],神经肽[22),和细胞因子(TNFα和il - 1β)[23)等(23]。这种效果是类似的与动物相比用消炎痛治疗。这个结果表明,钻的答:moluccana可能干扰不同通路参与炎性疼痛信号。

SDE的影响对身份证注入导致的炎症hypernociception CFA和铂族元素₂也被调查。CFA模型具有重要的接近人类慢性炎症性疾病,如风湿性关节炎。CFA引起的炎症反应迅速发展并能持续几个星期或几个月(14]。hypernociceptive响应是由本地敏感的痛觉受器和还包括免疫反应和中枢神经系统的变化24]。现在证实炎症hypernociception,如铂族元素所造成的₂取决于信号通路的激活,需要神经元激活神经元的PKA,下游的第二信使营25]。此外,许多研究表明,PKC途径也参与伤害感受器敏感化,引起疼痛的介质,如肾上腺素、内皮素、缓激肽,以及更一般的炎症。

这些药理数据加强这一事实的一部分antihypernocicepive效果观察与干提取获得答:moluccana可能是由于分离化合物的作用2′′-O-rhamnosylswertisin swertisin。类黄酮的作用的影响答:moluccana调节疼痛的阈值,可以假设,因为它已被广泛报道,这类化合物的抗炎和anti-nociceptive效果负责一些草药产品,如芦丁、槲皮素,和myricitrin在疼痛和急性炎症动物模型(26- - - - - -28]。此外,一些黄酮类化合物,包括槲皮素和myricitrin也有效地减少hypernociception慢性炎性疼痛模型(29日- - - - - -31日]。

先前的研究与类黄酮swertisin透露其潜在的代理,刺激胰岛素分泌呈现降糖药效果(32),但没有镇痛与这类黄酮还没有被进行了研究;除了tge工作(33]在flavonoid-enriched分数Cayaponia tayuya其中包括swertisin根。

在我们实验室进行的最近的研究已表明没有毒理学效应的提取在两个不同的动物物种(未发表的结果)。此外,没有中毒的病例粉砂物种被发现在文献[34]。

它也建议干的提取答:moluccana给系统,可能作用于外围和/或疼痛控制的中心路径。的机制答:Moluccana,其标记2′′-O-rhamnosylswertisin,发挥他们的anti-hypernociceptive行动目前不清楚,需要进一步调查;然而,这很可能是一个新的和有吸引力的替代炎性疼痛管理在人类使用天然产品。针对需要新的安全有效的疗法,并考虑与目前使用的药物相关的不良反应,答:moluccana代表一个重要的和有前途的草药治疗病态的来源没有有效治疗存在,如慢性疼痛。

5。结论

标准化干的提取答:moluccana以3%的标记2′′-O-rhamnosylswertisin是再现性按比例扩大的方法获得。此外,提取显示antinociceptive实验模型的潜在影响炎症机械敏感,使用不同的电感器代理,等λ角叉菜胶、CFA或铂族元素₂在老鼠身上。提取的生物效应可能认为,至少部分的标记2′′-Oswertisin -rhamnosylswertisin和其他黄酮类,出现在小数量。这些可喜的成果支持进一步的研究,旨在开发一种新的基于树用于传统民间草药医学,导致痛苦的治疗过程。

确认

作者要感谢Laboratorio Farmaceutico Eurofarma(巴西圣保罗),FINEP / MCT (Financiadora de Estudos e Projetos / Ministerio da Ciencia e Tecnologia)(没有。01.05.0812.00)、CNPq(慰问Nacional de Ciencia e Tecnologia),女士/十进数字(Ministerio哒Saude / Departamento de Ciencia e Tecnologia哒Secretaria de Ciencia Tecnologia e Insumos Estrategicos), CT-BIOTEC(底部Setoriais de Biotecnologia),和CT-Saude(底部Setoriais Saude (Edital Bioinova没有。本研究期间551023/2007-4)为他们的财政支持。c . s . Antonialli和g·f·席尔瓦是医药科学硕士学生从CNPq赠款支持。

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