文摘
基质金属蛋白酶(MMP)家庭是参与细胞外基质在正常生理过程的分解,以及疾病过程,如关节炎和癌症转移。在目前的研究中,dieckol获得高产与海洋褐藻Ecklonia静脉(EC),其效果评估MMP-2和9的表达和形态变化在人类纤维肉瘤细胞(HT1080)。Dieckol抑制MMP-2和9的表达方式存在剂量依赖的相关性,也抑制了细胞入侵和细胞形态学在HT1080细胞三维培养系统。此外,dieckol可能影响核转录因子(NF -κBκB)通路没有明显影响激活蛋白1 (AP-1)途径和组织金属蛋白酶的抑制剂(TIMPs)。总之,dieckol可以显著抑制MMP-2和9的表达和细胞形态学改变HT1080细胞通过NF -线κB通路。
1。介绍
过去几十年的癌症研究表明基质金属蛋白酶(MMPs)扮演了一个重要的角色在各种病理条件。尤其是恶性肿瘤,基质金属蛋白酶是不受控制的活动和他们的表情常常与不良预后相关。在所有的基质金属蛋白酶、MMP-2和9展示了建立转移中发挥重要作用,在大多数恶性肿瘤大幅增加。因此,抑制MMP-2和9被认为是治疗对癌症(1- - - - - -8]。
最近,合成生物活性应用中取得了显著的成果。然而,天然化合物及其衍生物还被称为最丰富的生物活性化合物与制药应用潜力巨大9]。Dieckol(图1)是一个phloroglucinal导数与海洋褐藻Ecklonia静脉(EC)与多种生物功能在体外和在活的有机体内例如,抗氧化,抗肿瘤,反人类的免疫缺陷病毒(艾滋病毒),和抗炎活动。例如,dieckol是一种新型安全phloroglucinal导数抑制hiv - 1的细胞病变效应包括HIV-1-induced合胞体形成、溶解性的影响,和病毒生产p24抗原,以及表现出hiv - 1逆转录酶酶抑制和条目活动除了其他生物属性(10,11]。
在目前的研究中,影响dieckol MMP-2和9的表达,细胞毒性,细胞侵袭性是评价HT1080细胞。这个细胞系的选择是基于广泛的研究进行之前对基质金属蛋白酶表达(12]。此外,dieckol机制通过影响核转录因子调节MMP-2和9 (NF -κBκB)途径也被调查。
2。材料和方法
2.1。一般的材料
1H NMR (400 MHz)13C NMR (100 MHz)光谱被记录在JEOL JNM-ECP 400核磁共振谱仪(JEOL、日本),用DMSO -溶剂峰(2.50 ppm1H和39.5 ppm13C NMR)作为一个内部参考标准。一些化学变化近似信号,第三个小数位。这是非常接近的区分信号值,但这可能不过是明显不同的光谱的目视检查。女士光谱得到JEOL jms - 700光谱仪(JEOL、日本)。使用提取单元提取执行EC (Dongwon科学有限公司、韩国)。柱层析法是由硅胶60(230 - 400目,默克公司、德国)和交联葡聚糖LH-20(σ,圣路易斯,密苏里州)。薄层色谱法(TLC)上运行预镀默克Kieselgel 60 F254年板(0.25毫米),地点在TLC板检测紫外灯使用CHCl(254和365海里)3/甲醇/小时2O /醋酸(65:25:4:3,v / v / v / v)作为发展溶剂系统。Vanillin-H2所以4受雇为酚类化合物检测代理。在这项研究中使用的溶剂和化学品都是来自商业来源的试剂级(Duksan纯化学品有限公司,韩国)。
2.2。提取、分离纯化、Dieckol的说明
Ecklonia静脉收集从韩国济州岛海岸,用水洗了三次去除盐和冻干。冻干EC是磨成粉之前提取。干EC粉(10公斤)被搅拌提取单元提取与甲醇(L) 10天在室温(25°C)。提取(273克)悬浮在水中,分区与正己烷(35.92 g), CH2Cl2(20.49克),层(24.87 g),提取序列(106克)。层分数(24.87 g)受到了硅胶的闪光色谱筛选了己烷/层/甲醇/ CH2Cl2(梯度)收益率十小分支(F1-F10)。交联葡聚糖的F5小分支进一步纯化LH-20与甲醇获得dieckol(58.30毫克)。
2.3。细胞培养和细胞生存能力分析
人类纤维肉瘤细胞(HT1080)写明ATCC培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),补充10%胎牛血清的边后卫,2毫米谷氨酰胺,和100 U /毫升penicillin-streptomycin孵化有限公司5%2和37°C调湿大气。对于实验,细胞通过至少5次与Trypsin-EDTA分离。细胞生存能力测定,细胞被播种在96 -孔板的密度细胞/在200μL包含10%胎牛血清的DMEM。24小时后,介质被和细胞培养48 h DMEM含有1%的边后卫在没有或不同浓度的dieckol的存在。48小时后,100年μL 3 - (4、5) -dimethylthiahiazol (-z-y1) 3, 5-di-phenytetrazoliumromide (MTT)(0.5毫克/毫升最终浓度)被添加到每个好,孵化为另一个4小时37°C的5%股份2。最后,DMSO (150μL)添加到甲瓒盐溶解甲瓒盐形成和数量决定通过测量OD在540 nm使用GENios标(Tecan奥地利GmbH,奥地利)。相对细胞生存能力是由麻省理工的量转换成甲瓒盐。细胞的生存能力量化相比,比例控制和剂量反应曲线。数据表示为均值(±SD)从三个独立的实验。
2.4。在体外入侵检测
一个在体外入侵检测进行了使用24-well transwell单元(8μ孔隙大小)与polyvinylpyrrolidone-free聚碳酸酯过滤器涂上了500μ克/毫升的基底膜基质和放置在transwell室。涂布过滤器清洗彻底在PBS和干立即使用前。细胞被放置在上部transwell板和允许细胞依附的24小时,然后用dieckol孵化36小时37°C。的细胞入侵的下表面膜固定与甲醇和沾0.5%结晶紫为10分钟。最后,我们决定入侵表型通过计算细胞迁移到较低的一侧的过滤器使用徕卡DM6000B显微镜在200×(德国徕卡Microsystems Wetzlar GmbH)至少5光明的领域(13]。
2.5。三维(3 d)的文化HT1080细胞线
3 d细胞行为和形态文化系统是完全不同于观察2 d系统(14]。建立了三维文化模型如前所述[15]。简单地说,HT1080细胞()停牌中和解决I型胶原蛋白(1毫克/毫升)(σ,圣路易斯,密苏里州)和1/5体积的5×DMEM。包含各种dieckol最终浓度的细胞悬液加入24-well盘子和保持在37°C到稠化。盘子被孵化24小时37°C。显微镜下观察结果在200×(德国徕卡Microsystems Wetzlar GmbH)。
2.6。明胶Zymography
明胶zymography, HT1080细胞无血清培养系统被播种在24-well板使用媒体和使用不同浓度的dieckol 1小时。MMP的表达被12-O-tetradecanoylphorbol刺激13-acetate (PMA) (10 ng / mL)和孵化是持续了48小时。孵化后,条件收集媒体和他们的蛋白质含量由布拉德福德法(16]。正常化后,蛋白质含量,等量的蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶电泳nonreducing条件下含1.5毫克/毫升的明胶。电泳后,聚丙烯酰胺凝胶与50 mM Tris-HCl洗(pH值7.5)包含2.5% Triton x - 100删除十二烷基硫酸钠。凝胶在一夜之间被孵化在37°C在发展中包含10毫米CaCl缓冲区2、Tris-HCl 50毫米和150毫米氯化钠消化凝胶基质金属蛋白酶。凝胶基质金属蛋白酶水解的可视化领域明确的区域在蓝色背景下的Coomassie蓝染色和乐队是由微密度估计的强度(多计V3.0软件,富士胶片生命科学,日本)(12]。
2.7。一
总RNA从每个样本被孤立的试剂盒试剂和受到一(rt - pcr)。rt - PCR分析,总RNA reverse-transcribed合成cDNA使用商业套装(豆类RNA PCR试剂盒(lamv))根据制造商的协议。PCR是在50岁μL反应卷包含RNA PCR缓冲,2.5毫米MgCl2,0.2μ2.5 M的底漆,豆类Taq单位。样本在94°C predenatured 4分钟,其次是放大在94°C 1分钟,每分钟55°C 30年代,在72°C和1分钟25周期,紧随其后的是最后10分钟在72°C扩展步骤。GAPDH的引物5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3′′, 5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′预计放大产品的300个基点。MMP-2引物的5′-CTCAGATCCGTGGTGAGATCT-3′, 5′- ct TTGGTTCTCCAGCTTCAGG-3预计放大产品的496个基点。MMP-9引物的5′-ATCCAGTTTGGTGTCGCGGAGC-3′, 5′-GAAGGGGAAGACGCACA GCT-3′预计放大产品的552个基点。
2.8。提取的核和血浆蛋白和免疫印迹分析
HT1080细胞没有预处理或不同浓度的dieckol 1小时后跟PMA刺激,孵化是持续48小时。分离提取的核和细胞质蛋白质,CelLytic核提取工具包(S26-36-23 Sigma-Aldrich有限公司,密苏里州,美国)按照制造商的指示。0.5毫升的细胞细胞溶解裂解缓冲(500μL低渗的裂解缓冲,5μL 0.1二硫苏糖醇(DTT)和5μL蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,蛋白酶体抑制剂MG132) 15分钟在冰上。Igepal ca - 630解决方案(4μL)添加和涡20年代。细胞核被离心分离10000 g×10分钟和上层清液(细胞质蛋白质)收集。与100年沉淀细胞核是细胞溶解μ(98 L的提取缓冲组合μL提取的缓冲区,1μL(0.1米,德勤和1μL蛋白酶抑制剂的鸡尾酒)10分钟和细胞核蛋白是通过离心收集12000 g×10分钟。蛋白质分离12% sds - page和electrotransferred到PVDF膜(微孔,贝德福德,质量)。阻塞后5%的脱脂牛奶PBST (Tween-20 PBS, pH值7.6,包含0.2%),膜与孵化主要抗体(圣克鲁斯生物技术公司我们)。1小时,用PBS Tween-20 0.2%,洗净,然后用辣根peroxidase-linked孵化二级抗体(美国加州圣克鲁斯生物技术有限公司)。无功信号被ECL可视化工具包(PE应用生物系统公司)。
2.9。统计分析
所有的实验都重复至少三次。所有的结果都表示为三个复制的决心和标准偏差的平均值(SD)。是用学生的统计比较以及和值被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。细胞生存能力分析
介绍了细胞生存能力分析确定dieckol能否在高浓度对HT1080细胞毒性作用。比较细胞生长在48 h与各种dieckol浓度(0 - 250μ米)被显示在图2。的值浓度都是类似于控制(dieckol 0μ米)表明dieckol并不影响细胞的生存能力低于200的浓度μM。
3.2。Transwell入侵检测
尽管没有细胞毒性效应观察甚至低于200μ米的浓度dieckol HT1080细胞线,理想情况下,0到100μM dieckol是用于细胞入侵和随后的实验。调查是否dieckol抑制肿瘤入侵,基底膜基质入侵检测进行了dieckol-treated HT1080细胞。这是观察到dieckol治疗减少了细胞入侵,和100年μM dieckol浓度明显阻止肿瘤入侵(图3(一个))[13,17]。
(一)
(b)
3.3。Dieckol对3 d文化HT1080细胞线
调查的影响dieckol HT1080细胞的三维培养系统,相同密度的细胞被播种到三维胶原凝胶各种dieckol的最终浓度。36小时后,控制(没有dieckol)伸出在凝胶,形成了许多分支在I型胶原蛋白和细长的结构矩阵(图3 (b))。相比之下,树枝在细胞治疗减少5μM dieckol浓度。随着浓度的增加到100人μ米,这些分支消失了,改为球形细胞。
3.4。影响的Dieckol MMP-2 9 HT1080细胞的转录和表达水平
明胶zymography分析,调查dieckol是否能抑制蛋白质含量MMP-2 MMP-9。如图4(一)、蛋白质MMP-2和MMP-9的表达式被显著地抑制dieckol剂量依赖性的方式。此外,rt - pcr和免疫印迹结果表明MMP-2和9的表达被dieckol抑制在转录水平,或多或少与zymography分析(数据相似的方式4 (b)和4 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.5。影响Dieckol AP-1影响,NF -κB,我κB表情HT1080细胞线
免疫印迹效应的差别研究进行分析对这些dieckol表达的可能机制激活蛋白1 (AP-1)和核factor-kappa (NF - BκB)。与此同时,金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)被免疫印迹检查。如图5 (b),dieckol不表现出明显的影响激活蛋白1 (AP-1) (c-jun)表达和增殖蛋白激酶(MAPK) (ERK,物,p38)介导AP-1。NF -κB家族转录蛋白由几个蛋白质亚基,很明显,NF -水平κB (p65和p50)是剂量依赖性的方式减少。导出了κB -α表达显著增加,当处理高浓度的dieckol (100μ米)(图5(一个))。观察图5 (c)的表情,没有明显的改变TIMP-1 dieckol TIMP-2当不同浓度处理。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
基质金属蛋白酶,家庭zinc-dependent肽链内切酶,参与许多生理和病理过程。基质金属蛋白酶的抑制和激活是一个失衡相关的一些疾病,如关节炎、类风湿性关节炎、肿瘤转移、心血管疾病和充血性心力衰竭(18- - - - - -20.]。发现MMP抑制剂(MMPIs)这些流行疾病的治疗已经今天癌症研究的一个重要方面(21]。MMPIs调节基质金属蛋白酶在几个生化途径,但其中大部分是直接抑制酶的活性。直到现在,MMPIs进入临床试验只是合成起源(有机化合物)和未能进入制药市场由于他们的副作用22]。寻找小说和天然化合物,发现了海洋的物质以惊人的药理潜力的宝库。因此,发现理想MMPIs从海洋自然资源是可行的,更有利23]。
Ecklonia静脉(一种海洋藻类),海洋植物的成员之一,产生dieckol以前一直深入研究抑制各种基质金属蛋白酶的表达(12,24]。在这项研究中,dieckol没有任何细胞毒性影响HT1080细胞浓度低于200μm .然而,dieckol影响细胞迁移以transwell入侵检测;它也抑制HT1080细胞穿过矩阵凝胶剂量依赖性的方式。此外,我们有检查的影响dieckol HT1080细胞的组织在一个3 d的文化环境。在活的有机体内,细胞体验3 d环境和其他细胞和ECM包围。传统的二维单层培养系统不能模拟3 d组织微环境的复杂性和总是代表一个理想的环境为研究生理ECM与结缔组织细胞相互作用[25,26]。基质金属蛋白酶3 d也影响细胞形态的文化环境。基质金属蛋白酶分裂矩阵蛋白纤连蛋白,vitronectin,胶原蛋白分解成更小的碎片。然后裂解ECM碎片促进和加速癌症细胞粘附和入侵15]。HT1080细胞形成的星状结构在3 d的文化环境中,这些结构迁移到胶原蛋白矩阵裂开ECM的帮助下基质金属蛋白酶。然而,dieckol治疗显著降低的数量和长度的星状结构。培养HT1080细胞治疗与dieckol选定的浓度(0 - 200μ9米)和MMP-2的表达,是由PMA诱导的。多项研究表明,PMA诱导表达MMP-2, 9 (27]。Dieckol抑制的表达MMP-2 9方式存在剂量依赖的相关性,结果显示rt - pcr,免疫印迹和zymography化验。
AP-1和NF -κB是主要的转录因子调节MMP-2 9表达(28- - - - - -30.]。MAPK的成员总科(ERK1/2、物和p38激酶)已知能够调节AP-1 transactivation通过增加水平AP-1组件或改变他们的子单元的磷酸化(c-jun c-fos),然后调节基质金属蛋白酶的表达和活动在不同细胞类型(31日]。NF -κB,在其活动的形式,它是隐藏在细胞质中,受抑制剂κB(我的成员κB)抑制剂蛋白质(包括我的家庭κ英国航空公司,我κBb,我κBg,我κ)。各种刺激激活NF -κ我导致的磷酸化κB,紧随其后的是它的泛素化和后续的退化(32,33]。Dieckol抑制NF -κB (p65和p50)在剂量依赖性的方式表达。然而,dieckol AP-1没有任何明显的影响和ERK1/2,物,p38激酶表达式。人们已经发现,导出κB -α表达增加,当处理高浓度的dieckol (100μ在低浓度(M),但不是34]。这可能表明,k B家族的抑制剂可以调节dieckol浓度高,NF -这可能是另一个原因κ由dieckol B抑制。免疫印迹结果从TIMP-1 TIMP-2描绘TIMP没有dieckol的不同浓度的影响。这是表明抑制MMP-2 9活动dieckol并不是因为TIMP的测试浓度。
在MMP-2和9基因的启动子站点,几个公认的对转录因子结合位点存在,调节基因的表达。该启动子包含AP-1绑定共识站点79−上游的入门网站和进一步的上游,有一群监管元素包括另一个名为AP-2的AP-1结合位点和NF -κB结合位点(35]。通常知道MMP-9转录监管主要是通过AP-1 [36,37]。此外,在一些炎症和其他病理条件下,MMP-2 9转录可以通过NF -监管κB信号通路。有趣的是,dieckol抑制NF -κB表达相同剂量依赖性的方式作为MMP-2观察到,9表达式。然而,它没有显著影响AP-1的表达。这种模式的行动可能会导致dieckol[独特的化学结构38- - - - - -40]。的原因可以讨论的结构特点的基础上的孤立dieckol和构效关系可以被描述由于其独特的骨架。例如,羟基的数量在其化学结构可能扮演重要的角色,因为更高的phloroglucinal聚合单位和另一方面,O-bridge联系(醚键)在phloroglucinals捐赠更多的自由离子吸引受体负责。
5。结论
从食用海洋褐藻Dieckol被隔离Ecklonia静脉已根据MS和NMR特征数据。它作为抑制剂MMP-2 9 NF -差别,对这些基因的表达κ对AP-1 B通路没有显著影响,MAPK通路。此外,MMP-2和9表达式的调制可以抑制侵袭性的一个原因和3 d HT1080细胞的培养。因此,本研究建议dieckol可以有效的抑制癌症候选人入侵。
承认
本文是由海洋生物处理研究中心的资助海洋生物技术项目”资助的土地、交通和海上,韩国。