靶向细胞信号:BRAF抑制及其外治疗转移性恶性黑色素瘤

摘要

尽管在一些肿瘤的细胞毒性治疗方面取得了进展，但在转移性黑色素瘤方面，在过去30年里，没有药物能够显著改变疾病的自然史。在过去的十年中，转译研究确定了恶性转化、侵袭和进展的重要机制。信号通路可被致癌基因异常激活。在这一过程中所涉及的致癌突变激酶的鉴定为新的靶向治疗提供了机会。黑色素瘤对braf突变激酶的依赖性使得抑制剂的开发在临床试验中产生了主要反应。这是一种治疗转移性黑色素瘤的新型药物的开端;识别转导信号网络和其他“可药物”激酶的研究正在积极进行中。在本文中，我们讨论了正在进行的细胞信号抑制，耐药机制，以及克服治疗失败的策略的研究。

1.介绍

恶性皮肤黑色素瘤是人类最具化学耐药性和侵袭性的肿瘤之一。在过去的30年里，没有一种细胞毒素能够重要地改变疾病的自然史[1］．已经测试了几种克服细胞毒性药物耐药性的策略，包括药物组合[2]、细胞因子和疫苗接种[1］．使用这些治疗方法，只有一小部分转移性患者的肿瘤缩小，但这些影响并没有转化为显著的临床益处，在无进展生存期或总体生存期[1，3.］．直到最近，还没有建立起预测反应的标志物。

这种情况在过去十年开始改变。随着转译研究的进展，有可能确定涉及黑素瘤生物学的途径和体细胞突变。通过丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径识别和阻断异常信号是目前最有希望的治疗策略。大约60%的黑色素瘤在BRAF蛋白中表达体细胞突变，其中90%表达致癌激活V600E突变[4］．Vemurafenib是V600E BRAF激酶活性的抑制剂，产生了重大反应[5]，并在最近的一项III期试验中显示了单药治疗达卡巴嗪的总体生存优势[6］．

尽管取得了进展，但应对措施是短暂的，我们尚未能够长期治愈或稳定这一疾病。更好地理解肿瘤生物学及其对治疗干预的适应仍然是一个挑战。平行信号通路和它们之间的网络可能是导致耐药的一些原因，并可能为药物开发提供新的靶点。本文综述了转移性黑色素瘤信号通路抑制和治疗新策略的研究进展。

2.MAPK Pathway-RAS / RAF MEK / ERK

MAPK通路在黑色素瘤中经常发生突变。它与细胞突变、分化和生存有关。作为对胞外信号的响应，RAS家族蛋白将RAF家族蛋白招募到细胞膜上。激活的RAS信号激活ERK及其下游效应器，如图所示1．特别是NRAS和BRAF突变与黑色素瘤高度相关[4］．临床前结果显示通路阻断的细胞毒性作用增加了这一方向的临床研究兴趣[4，7］．

2．1．拉

在大约15%的黑色素瘤中观察到NRAS蛋白序列中的致癌突变[4]导致蛋白质活化及存活和增殖信号的转导[8，9］．临床前研究证实RAS蛋白是临床药物开发的可能靶点[7，10］．

法尼基转移酶抑制剂是为了避免RAS的膜定位，防止其激活而开发的药物[11］．这些药物已经在几种肿瘤中进行了评估，结果令人失望[12，13］．在黑色素瘤中，只有一项II期研究在14名患者中观察到无反应[14］．该研究没有根据NRAS突变状态对患者进行分层，这可以解释在该队列患者中缺乏应答。有一些证据表明法尼基转移酶抑制剂与顺铂的协同机制[15，但这种方法没有经过临床试验。

2．2．英国皇家空军

几乎60%的黑色素瘤显示BRAF突变[4，16］．在这些患者中，最常见的是600位谷氨酸被缬氨酸取代，即所谓的V600E BRAF突变[4］．它占了BRAF基因突变的90% [4］．

V600E BRAF是黑色素瘤的一种常见突变，也常在良性痣中发现[17］．BRAF突变似乎不足以促进恶性转化，但可能在早期癌变阶段发挥作用[16，18- - - - - -20.］．可能是必要的第二种致癌袭击：BRAF与PTEN的相互作用[21], p16 [20.], p53 [18),一种蛋白激酶(22]，以及紫外线辐射[23已经被描述过了。

阻断该蛋白质的第一种治疗方法是使用多喹啉酶抑制剂索拉非尼，其靶向BRAF，CRAF，PDGFRβ，及VEGFR [24］．索拉非尼单药联合细胞毒性化疗达卡巴嗪[25]替代唑啉代[26]，卡铂加紫杉醇[27)——负面结果。这与肾细胞癌的阳性结果形成对比[28并提示黑色素瘤可能更依赖于BRAF通路。一些作者认为，从临床试验中使用的剂量来看，索拉非尼不是一种有效的BRAF抑制剂[29］．

vemureafenib，也称为PLX4032，RG7204或RO5185436，是V600E BRAF活性的有效和特异性抑制剂，最近批准用于治疗晚期黑色素瘤。在I / II类研究中，在升级剂量相后，每天960 mg剂量方案的两次含有32例患V600E BRAF突变的黑色素瘤患者，以评估响应率。观察到令人印象深刻的81％的RR，包括24个部分反应和两个完整的反应。vemurafenib甚至在多种治疗型，LDH水平或内脏转移的患者中也活跃。估计的无进展生存率超过七个月，并且在出版时，尚未达到整体生存[5］．Vemurafenib与达卡巴嗪进行了III期随机试验。总生存期的中期分析显示，vemurafenib具有生存优势，相对死亡风险降低63%(95%置信区间[CI]， 0.26 - 0.55;）.6个月时，总生存率为84% (95% CI, 78 - 89) vs . 64% (95% CI, 56 - 73)，估计中位无进展生存率为5.3个月vs . 1.6个月，vemurafenib vs .达卡巴嗪组有效率为48% vs . 5% [6］．特异性BRAF抑制具有促进野生型BRAF角质形成细胞产生的增生性皮肤病变的矛盾副作用[30.］．

第二种靶向BRAF突变蛋白的化合物是GSK2118436。它是一种更有效的突变BRAF激酶活性抑制剂，与皮肤毒性不相关。这种化合物的特点之一是它能有效地通过血脑屏障。在纳入I期研究的一组患者中，观察到脑转移灶大小减小[31］．GSK 2118436正在进行II期研究，用于治疗脑转移患者[32］．此外，一项III期研究正在将GSK 2118436与达卡巴嗪进行比较[33］．

2．3.MEK

MEK激酶在信号通路中处于BRAF的下游。这种激酶的抑制被认为是BRAF突变黑色素瘤中一个有趣的靶点[34]，但并不适用于NRAS [35］．体外研究发现MEK抑制在BRAF突变细胞中的敏感性更高[34］．一项I期临床试验的结果显示，黑色素瘤患者亚组的疾病应答和稳定[36]相关翻译研究成功地确定了ERK磷酸化的减少[37，38］．

MEK抑制剂正在评估用于转移性黑色素瘤的治疗，并在I期研究中显示中度活性[38］．MEK抑制剂AZD6244正在几个II期研究中单独或联合化疗进行试验[39］．重要的是，并不是所有的研究都要求BRAF突变作为纳入标准。该分子也正在与BRAF抑制剂联合进行II期试验[40]，在BRAF抑制失败后[41］．

２.４.的兵

在基础研究中正在研究直接ERK抑制。合成了一种激酶活性抑制剂，并在类风湿性关节炎小鼠模型中进行了测试[42，43］．作者认为这类药物可以用于癌症治疗[43］．然而，到目前为止，在这种情况下，没有发表过ERK抑制的数据。

3.PI3K / AKT Pathway-PI3K / PTEN / mTOR

PI3K通路是通过配体与受体酪氨酸激酶(RTK)结合而激活的[44］．它与生存、增殖、移动性、分化和生长等多种细胞机制相互作用[45］．信号通路的改变可在恶性转化和侵袭中发挥作用[45，46］．最近有研究表明，AKT与突变的BRAF蛋白相互作用与黑色素瘤的发生有协同作用[47］．目前，一些针对通过该途径的信号转导的分子正在开发中(图)1）.

3．1.PI3K

许多抗癌疗法依赖于细胞凋亡，并且已经假设抑制PI3K活性可以改变这一过程。LY294002被开发为PI3K活性的抑制剂。在黑素瘤细胞系中，它通过自身或与其他药物联合有效地诱导细胞凋亡[48］．在小鼠模型中，局部使用LY294002联合RAS抑制剂抑制了黑色素瘤移植物侵袭行为并减少了血管生成[49］．这种组合在细胞系中也很有效[50］．

观察P110 PI3K P110级分的强谱抑制mTOR的激活激发了双阻断那些激酶的策略[51］．在临床前研究中测试了几种组合[51，52］．

PI3K和mTOR激酶属于磷脂酰肌醇-3激酶相关激酶(PIKK)家族，其活性位点具有相当的同源性。因此，抑制PI3K活性的抑制剂，如LY294002和wortmannin，对这两种激酶都有活性。这些化合物的一些作用可能不仅是由于PI3K的抑制，而且是由于通路的双重阻断。研究正在进行，目的是了解活性位点的微小差异，并产生特定的抑制剂[53］．双阻断药物的临床早期研究正在招募中。

3．2．一种蛋白激酶

大约60%的黑色素瘤中发现AKT3基因的拷贝增加，并与黑色素瘤的进展相关[54］．AKT通路的激活可以抑制细胞凋亡[55］．

Perifosine是首个在黑色素瘤中达到2期研究的抑制AKT的化合物。在两个28天的治疗周期后，18例黑色素瘤患者使用了该药物，7例病情稳定，11例进展。作者得出结论，这种药物不应作为单一药物进行试验[56］．其他化合物如MK-2206 [57，58， RX-0201, PBI-05204，和GSK2141795 [59目前正处于几种癌症的早期临床研究阶段[60- - - - - -63］．

在临床前模型中已经观察到MK-2206与其他靶向治疗和常规化疗联合产生的细胞毒性协同效应[58］．考虑到这些激酶在恶性转化中相互作用的作用，这种方法在含有BRAF突变的恶性黑色素瘤中可能特别有前景。

3.3。PTEN.

磷酸酶和三素同源物（PTEN）是肿瘤抑制基因[64，65］．它的蛋白质产物抑制黑色素瘤的生长并增加其对细胞凋亡的敏感性[66］．PTEN的缺失或沉默增加了黑素细胞和早期黑素瘤细胞中AKT3磷酸化水平[67，68］．缺乏PTEN的细胞对化学治疗剂更耐药，并显示出增加的BCL-2活性，更耐细胞凋亡[69］．

在裸鼠黑色素瘤异种移植模型中，使用质粒或染色体转移引入PTEN抑制了肿瘤的发展[66］．在耐EGFR抑制和缺乏PTEN活性的乳腺癌细胞系中也观察到，引入野生型基因使耐药表型逆转[70］．恢复PTEN活动的方法仍在基础实验室的研究中。

3．4．mTOR

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)位于AKT的下游，并通过反馈机制调控其活性。mTOR至少形成两种活性蛋白复合物:mTOR1和mTOR2，其中第一种抑制AKT信号，第二种激活AKT信号[71］．

mTOR信号似乎在黑色素瘤细胞系中活跃[72］．在乳腺癌中，抑制mTOR可以逆转曲妥珠单抗耐药表型[73］．作为一种单药治疗，抑制mTOR对转移性黑色素瘤的活性低且无临床益处[74］．mTOR阻断正在与热休克蛋白疫苗联合进行临床前研究[75]和MAPK抑制剂[71，76］．

针对mTOR1复合物的几种雷帕霉素衍生物是可用的，并在临床研究中。目前正在进行一些I期和ii期研究，以测试依维莫司和替西莫司与传统细胞毒性疗法的组合[77］．

4.c - kit受体

C-Kit属于生长因子受体家族。它是与胚胎发生中黑素细胞细胞迁移过程相关的RTK [78］．它还在造血和胚芽细胞稳态中发挥作用[79，80］．在一些实体瘤中观察到kit的致病性激活，如精原细胞瘤[81],要点[82]和胸腺癌[83］．

一组黑素瘤(2 - 5%)也在c-Kit中出现扩增或突变。它更常发生在非暴露在阳光下的区域，如黏液和肢端黑色素瘤亚型，尽管它也可以在长期阳光损伤的皮肤区域发现[84，85］．黑素瘤中大多数Kit突变位于近膜区[86，预测对酪氨酸激酶活性抑制剂甲磺酸伊马替尼的反应[87］．

几例病例报告证实使用伊马替尼对c-kit突变黑色素瘤有客观反应[88- - - - - -91］．这一观察结果也在细胞系研究中得到了证实[92］．在II期研究中，三个不同的试验得到了不一致和令人失望的阴性结果[93- - - - - -95］．对这一发现的可能解释是c-Kit信号对生存刺激的依赖性相对较低，或者需要一种更特异、更有效的c-Kit阻滞剂。不同的c-kit阻滞剂目前正在临床开发中，这些试验的结果可能有助于回答这些问题[96］．

5. BRAF抑制的抗性机制

抑制突变的BRAF蛋白是更先进的临床发展的靶点疗法。即使大多数病人对最初的治疗有反应，他们最终都会复发。BRAF抑制抗性的相关机制正在深入研究中。MAPK通路的重新激活似乎与大多数病例有关，但通过平行通路的信号转导也被确定[97- - - - - -99)(图2）.

RAS蛋白位于RAF的上游。MAPK通路的激活是RAS刺激下RAF蛋白(ARAF、BRAF和CRAF)二聚化的结果。BRAF野生型细胞对BRAF抑制具有抗性，因为药物与一个二聚体结合会导致另一个的激活[One hundred.- - - - - -102］．在braf突变的细胞中，这种激酶的高活性可能导致RAS激酶的负反馈[101，因此，这类细胞中的RAF二聚体含量较低，治疗是有效的。在原发性黑色素瘤中，RAS和RAF的突变是相互排斥的[4]，但在vemurafenib治疗失败后，发现NRAS激酶出现了新的突变，导致MAPK通路的重新激活和疾病进展[99)(图2(b))。过表达CRAF的细胞系的实验也显示了对vemurafenib效应的耐药性[97］．

不依赖于RAF信号的ERK的激活也可以引起抗性。MAPK激动基因MAPK8编码蛋白质COT。在BRAF抑制失败后的一组患者中检测到COT过表达。这种激酶可以以非raf的方式磷酸化MEK和ERK，并介导对vemurafenib的耐药性[97)(图2(c))。MAPK通路再激活的另一种抗性机制是获得或新创激活MEK蛋白的突变[98)(图2(d))。

PDGFRβ在对vemurafenib耐药的细胞系中观察到过表达。尽管ERK磷酸化水平持续较低，但这些细胞对BRAF V600E抑制的抗增殖作用仍有抵抗(图)2(e))。这一观察结果在一个亚组患者中得到验证[99］．

BRAF蛋白的新突变使细胞系对其抑制产生抗性[103，但迄今为止还无法在患者的活组织检查中识别出来。

6.克服阻力

因为MAPK通路的重新激活似乎参与了大多数来自BRAF抑制的获得性耐药病例[97- - - - - -99，下游阻断似乎是一个很有前途的策略。现在有几项研究测试MEK在转移前期和抗braf治疗失败后的抑制作用。同时或顺序抑制RAF和MEK也可能对这类患者有用。另一种策略可能是发展BRAF和CRAF的双重抑制。COT或PDGFR激活引起的耐药性β可以通过这些蛋白的抑制剂与维持型RAF抑制剂的结合靶向。

由于耐药机制的多样性，没有一种策略适合所有患者。在个性化治疗的背景下，肿瘤概况在疾病过程的不同时刻是非常重要的。只有通过对肿瘤分子谱的序列分析，才能在最佳时刻为每个特定的患者确定最佳的靶点。

黑色素瘤治疗的进展为研究人员开发新的治疗策略提供了独特的机会。实验室耐药细胞模型加上连续活检对黑素瘤皮肤肿瘤的可及性提供了一种研究策略，将导致更好地了解耐药机制和改善临床护理。

7.结论

了解黑素瘤的生物学特性对于新疗法的发展至关重要。MAPK通路对肿瘤存活的依赖性的观察，促进了干扰肿瘤细胞信号通路方法的研究。目前正在积极研究几种能够阻断多种信号通路的化合物。V600E BRAF抑制剂vemurafenib目前已被批准用于晚期黑色素瘤的治疗。

然而，这些进步仅适用于大约60％的患者，即那些拥有BRAF突变的人，甚至在这些患者中也是短暂的。对于那些未呈现这种突变的人来说，寻找另一个目标是紧迫的。患有免疫疗法和疫苗接种的方法是在有前途的结果下开发，但再次，只有一小部分患者响应治疗（〜10％）[104]，并且没有可用的反应预测标志物。

序贯活检和分子谱分析是癌症治疗和研究的重要工具。它使我们能够了解疾病的进展及其抗性机制，并选择最合适的治疗策略。在恶性皮肤黑色素瘤中，个性化分子治疗已经成为现实。将激酶抑制与传统的细胞毒性化疗相结合，结合肿瘤分子谱引导的免疫治疗或多激酶抑制，将为黑色素瘤的个性化治疗提供新的策略。

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