文摘
长非编码RNA (lncRNAs)显示参与肿瘤发生和发展的人类恶性肿瘤由微RNA (microRNA)通过竞争内源性RNA(龙头)机制,新提出的“RNA的语言。”然而,lncRNA-associated竞争三联体(lncACT)网络龙头、成绩单中透明细胞肾细胞癌(ccRCC)目前缺乏。我们进行微分表达式分析来识别异常表示lncRNAs, microrna, mrna分析RNA-seq数据420 ccRCC组织和71年的非癌变肾组织获得癌症基因组图谱(TCGA)。然后,ccRCC-specific龙头、网络使用计算算法,构建包括miRcode TargetScan,米兰达,miRTarBase。总共有1491 lncRNAs特异表达被发现之间的正常肾组织和ccRCC(褶皱 和错误发现 )。的龙头、网络组成的46 DElncRNAs, 11 DEmiRNAs, 55 DEmRNAs建立了整合lncRNA / microrna和microrna / lncACTs信使rna相互作用。几个lncRNAs被确定与ccRCC患者的临床特征显著相关。值得注意的是,四个关键lncRNAs (TCL6 HOTTIP,人类负重外骨骼,PCGEM1)是紧密相关的患者的临床特点和总生存期(log-rank ),表明在ccRCC他们潜在的重要作用。HOTTIP可能是一个潜在的预后和治疗分子标记ccRCC病人。总的来说,我们的研究结果提供了一个全面的观点lncRNA-associated龙头、监管网络更好地理解为ccRCC机制和预后的生物标志物。
1。介绍
肾细胞癌(RCC)是最致命的泌尿系统恶性肿瘤在成人越来越发病率在全球范围内(1]。据估计,76080新病例和13780例死亡从肾脏恶性肿瘤发生在2021年的世界2]。碾压混凝土,异质群体的疾病,分为几个组织学亚型根据不同肿瘤来源于肾元细胞类型,包括透明细胞RCC (ccRCC ~ 75%),乳头状RCC (pRCC ~ 15%),和chromophobe RCC (chRCC ~ 5%)3]。ccRCC是主要的和最恶性亚型肾癌。尽管ccRCC改善主要是由于先进的诊断成像检测技术,ccRCC病人的临床行为咄咄逼人,特别是转移性的高速率发展(4]。因此,识别潜在的分子机制ccRCC开发诊断标记和治疗靶点成为迫切需要。
这些非蛋白编码rna基因分为长ncRNAs和短ncRNAs根据他们的长度。非编码RNA转录超过200个核苷酸长的一般称为“长非编码RNA”(lncRNAs) [5]。lncRNAs已经承认参与多种癌症的发病机理通过破坏各种生物过程(6]。异常表达的小分子核糖核酸(microrna -核苷酸长度)参与肿瘤形成和癌症进展(7]。近年来,lncRNAs被验证函数作为内源性rna(龙头)竞争与其他rna通过共享通信miRNA-binding网站。这个lncRNA-miRNA-RNA交互的一个子类,电抗器,称为lncRNA-associated竞争三胞胎(lncACTs) [8]。2014年,夏等人首先构建了一个lncACT相声网络在胃癌,还建立了一个bioinformatics-based方法预测癌症相关的龙头、网络(9]。随后,一些癌症特异性电抗器,网络也被发现在各种癌症,包括肝细胞癌(10),膀胱癌(11),甲状腺癌(12]。
然而,只有有限的研究到目前为止在RCC lncACTs。lncRNA MALAT1已被确定通过调解作为龙头MALAT1 / mir - 200 s / ZEB2途径促进ccRCC扩散和转移13]。lncRNA热空气,致癌基因在不同的肿瘤,也作为龙头、促进HIF-1报道α绑定mir - 217 /妳级联的碾压混凝土(14]。药物resistance-related lncRNA lncARSR传播舒尼替抗性,骗取mir-34 / mir - 449增加目标基因表达在RCC细胞(15]。风扇等人构建lncRNA-related龙头、网络和发现诺模图和相关免疫细胞浸润预测预后pRCC患者(16]。然而,巨大的遗传异质性的存在在不同组织学亚型的碾压混凝土17]。在这项研究中,差异表达lncRNAs, microrna, mrna (DElncRNAs、DEmRNAs DEmiRNAs)筛选的表达谱420 ccRCC病人群的癌症基因组图谱(TCGA)。ccRCC特定龙头、监管网络也建立了基于lncRNA / microrna的mRNA的潜在竞争三胞胎预测的计算算法和数据库。我们还发现了几个关键lncRNAs ccRCC进展和预后有关。
2。材料和方法
2.1。病人数据集
TCGA公共数据库提供研究人员开放的多个癌症基因组概要分析和出版物(18]。这项研究符合freedom-to-publish TCGA标准公布网站(https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines)。537年一群TCGA ccRCC病人获得下载在这项研究中。排除标准包括以下几点:(1)患者临床病理的数据不全,包括年龄,性别,种族,TNM阶段,和病理阶段(12例);(2)患者随访数据超过2000天(84例);(3)患者不完整RNA-seq或miRNA-seq数据(21例)。总共420 ccRCC患者(队列T)和71年正常样本(队列N)参加本研究。RNA和microrna的表达数据(三级)生产从IlluminaHiseq_RNASeq IlluminaHiseq_miRNASeq测序平台和预规格化TCGA的存档(http://cancergenome.nih.gov)。
2.2。网络建设lncACT相声
我们进行微分表达式分析磨边机包在Bioconductor [19]。都设置为严格的筛选标准 和 (FC:褶皱变化;罗斯福:错误发现率)。在这些差异表达基因(度),收集miRNA-lncRNA的假定的交互miRcode [20.]。不同的miRNA-target预测算法,包括实验验证数据库TargetScan (http://www.targetscan.org/mamm_31/)[21),米兰达(http://www.microrna.org/microrna/home.do)[22),和miRTarBase (http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/)[23),被用来预测mrna microrna的目标。这些工具为miRNA-target交互提供全面注释和实验验证。最后,lncRNA-associated电抗器ccRCC网络集成和可视化是基于上述竞争三胞胎使用Cytoscape v3.5.1 (http://www.cytoscape.org/)[24]。
2.3。功能富集分析
访问龙头、网络功能角色的基因,基因本体论(去)是使用数据库执行注释,可视化和集成发现(大卫,https://david.ncifcrf.gov/)(值< 0.05)。同时,路径进行了分析使用京都基因和基因组的百科全书(KEGG) KOBAS 3.0 (值< 0.01)。
2.4。Coexpression分析
相关测试是由R软件算出coexpressed与HOTTIP相关的基因(和值< 0.001)。
2.5。药物敏感性分析
进行了药物敏感性分析与Bioconductor pRRophetic包中发现药物之间的敏感性显著差异HOTTIP高、低组(值< 0.05)。
2.6。统计分析
未配对 - - - - - -测试是用于识别度和不同病理之间的DElnRNAs子组的区别。之间的关联DElncRNAs表达与患者的总生存期(OS)是由单变量Cox比例风险回归分析(log-rank )。kaplan meier法生成总体生存曲线。
3所示。结果
3.1。病人的特点
共有420名患者病理诊断为ccRCC正常样本和71年参加这项研究。研究人口的临床病理的信息总结表1。中位数年龄为60年。符合一个以前的报告25),白人男性患者个人似乎大多数的碾压混凝土的性别比率(男/女)1.9/1和白色种族的比率为86.7%。
3.2。筛查结果ccRCC度
筛选后的RNA和microrna的表达谱的阈值 和 ,我们发现1491 DElncRNAs 2368 DEmRNAs, 53个microrna ccRCC肿瘤组织和正常组织之间的异常表达。其中,1610年989 lncRNAs mrna, 32个microrna是调节,而502 lncRNAs 758 mrna,在队列和21个microrna表达下调T相比队列n总调节和表达下调lncRNAs, mrna, microrna是列在表中S1-6。层次聚类进一步用于识别表达模式两个群体之间的度。前50名中,前50名downexpressed lncRNAs是可视化的热图,这表明ccRCC肿瘤组织从正常组织(图明显不同的表达模式1和表S7)。
3.3。在ccRCC lncACT相声网络
电抗器,假设lncRNAs之间被描述为一个复杂的转录后的调控机制和其他rna介导的microrna通过共享microrna的反应元素(26]。因此,进一步分析了建立lncACT相声网络基于上述ccRCC度。我们有11个具体DEmiRNAs针对46 DElncRNAs miRcode在线工具,这是一个lncRNA-miRNA交互预测数据库(表2)。为了进一步分析这些DEmiRNAs,全面考虑了来自TargetScan miRNA-mRNA交互,miRTarBase,米兰达数据库来提高预测的可靠性。共有55个目标mrna预测与7 DEmiRNAs也参与了超过2368 DEmRNAs(表3)。通过整合这些lncRNA / microrna和microrna / mRNA交互lncACTs,电抗器,网络构建和可视化图2包含46 DElncRNAs 11 DEmiRNAs, 55 DEmRNAs。
3.4。功能富集分析
识别的功能55 DEmRNAs参与龙头、网络、功能分析。去分析显示26丰富种类的生物过程(值< 0.05),前15名的可视化图3。有两个明显凋亡过程浓缩去而言(去:1902042,:0043065)。根据值< 0.01,27 KEGG类别被选为大大丰富KEGG通路。十大丰富路径表中列出4,包括四种癌症相关通路(小分子核糖核酸在癌症、膀胱癌、转录misregulation癌症,癌症和途径)。细胞周期蛋白D1 (CCND1)特别是参与六个十大通路,指示其复杂的角色在肿瘤的进展。
3.5。在ccRCC DElncRNAs的临床相关性
我们下一个分析之间的联系的46 DElncRNAs龙头、网络和临床病理的特点。总共有八个lncRNAs有区别地表达在不同临床特征子组( 和 )(表5)。我们发现6个表达下调lncRNAs (C12orf77, TCL6, C8orf49、PCGEM1 ERVMER61-1),和两个调节lncRNAs (HOTTIP和LINC00200)显著相关ccRCC的进展。C12orf77和TCL6不仅可以抑制肿瘤的生长(T3 + T4与T1 + T2)而且downexpressed与高水平的病理阶段,个人在肿瘤发展ccRCC暗示他们的负面作用。人类负重外骨骼是促进淋巴结转移;然而,似乎人类负重外骨骼的低表达与肿瘤大小、远处转移,病理阶段。
随后,kaplan meier分析应用于调查总体生存时间DElncRNAs ccRCC病人。在46 DElncRNAs参与lncACT网络,五lncRNAs (TCL6, PCGEM1, FGF12-AS2 LINC00443, LINC00472)被发现积极与单变量Cox回归分析(log-rank总体存活率 ),而另一个八lncRNAs (HOTTIP,人类负重外骨骼,PVT1 WT1-AS, C20orf203, NALCN-AS1, TRIM36-IT1,和LINC00299)与生存负相关。kaplan meier HOTTIP曲线,人类负重外骨骼,TCL6 PCGEM1,也在临床特征比较差异表达,如图所示4(一)。kaplan meier曲线分析也是用来调查总体存活率与这四个lncRNAs DEmiRNAs相关。值得注意的是,mir - 144的表达增加,预测与TCL6互动,与预后呈正相关。mir - 155的高表达,可能有针对性的人类负重外骨骼和PCGEM1,与不良预后相关(图4 (b))。
(一)
(b)
3.6。高表达的HOTTIP与药物敏感性下降有关
进一步理解HOTTIP ccRCC患者的表达,转录组测序数据420 ccRCC和71年的正常样本提取TCGA的数据库。HOTTIP ccRCC病人的表达水平明显高于正常对照组(图5(一个))。Coexpression与HOTTIP相关分析表明,55个基因表达,包括7负相关基因和48呈正相关基因(表S8)。圆图的相关性表明,HOXA13、SERPIND1 ALDH1L2, AADAC, ADAM33,并与HOTTIP OSBPL6呈正相关,和BCL2 EDNRB, AQP1、ENPP4, FBXL3 HOTTIP呈负相关(图5 (b))。药物敏感性分析确定半最大抑制浓度(IC50)的吉西他滨、pazopanib舒尼替,xl - 184 ccRCC HOTTIP高表达患者患者显著高于低HOTTIP表达式,表明患者高HOTTIP表达式对这些疗法(图不太敏感6)。
(一)
(b)
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
先前的报道表明,lncRNAs参与肿瘤发生,癌症进展、转移碾压混凝土和充当致癌基因或肿瘤抑制。几项研究进行了基因微阵列的表达模式lncRNAs基于小样本大小(27,28]。的肿瘤特异性lncACT相声网络已经在chRCC前所述[29日]。然而,不同碾压混凝土组织学亚型包括广泛的多样性的肿瘤发生的分子机制。因此,迫切探索lncRNA-associated ccRCC龙头、网络。在目前的研究中,我们分析了TCGA ccRCC病人群的表达谱数据档案,全面识别景观如何肿瘤特异性lncRNAs ccRCC函数。我们成功地建立了lncRNA-associated龙头、网络ccRCC根据预测竞争DElncRNAs三胞胎,DEmRNAs, DEmiRNAs。
最近的研究表明,lncRNAs可能与microrna通过相互竞争相互作用和间接调节microrna的目标。lncACT交互可能积极功能价值的预后指标在癌症8]。因此,我们推测,一些特定lncACT相声包括lncRNA, microrna,信使rna可能影响ccRCC进展。我们利用严格的标准来确定DElncRNAs, DEmiRNAs, DEmRNAs ccRCC肿瘤组织和正常组织之间,然后应用一些生物信息学策略来提高预测的准确性RNA-RNA交互。最后,46 DElncRNA 11 DEmiRNAs, 55 DEmRNAs构成了lncACT ccRCC coexpression网络。探索这些龙头的生物功能的网络出现的基因,KEGG路径分析表明,癌症相关的关键DEmRNAs明显丰富途径,暗示他们的肿瘤发生的重要角色。46中关键DElncRNAs四lncRNA (TCL6 HOTTIP,人类负重外骨骼和PCGEM1)不仅与临床特征的相关性,也可能影响ccRCC病人的结果,强烈建议他们重要的角色作为ccRCC预后的生物标志物。与我们的结果一致,最近的一项研究也证实,低表达TCL6与先进ccRCC患者临床病理特征和预后不良。此外,初步实验表明TCL6潜在antioncogene ccRCC细胞株的抑制癌细胞增殖,促进细胞凋亡(30.]。我们预测TCL6可能与mir - 144,其中潜在的目标基因包括BTG2抗增殖基因。BTG2被报道参与细胞周期调控和随后参与细胞增殖在致癌作用31日]。因此,它值得进一步的实验来阐明机制TCL6-associated三胞胎在ccRCC竞争的影响。
HOXA转录上调的远端提示(HOTTIP),作为一个重要的致癌lncRNA,一直在各种恶性肿瘤相关的整体存活率较差(32,33]。我们预测,高表达的HOTTIP近似十二倍的变化ccRCC肿瘤组织可以促进肿瘤的生长和统计总生存期短,这与先前的研究一致(34,35]。我们发现HOTTIP之间显著正相关,HOXA13 ccRCC患者的表达式。这是证明HOTTIP转录调节HOXA13食管鳞状细胞癌的细胞促进致癌作用和转移(36]。因为与HOXA13 HOTTIP的物理接触,我们假设HOTTIP和HOXA13密切协调监管ccRCC[的发生和发展37]。更重要的是,我们发现患者高HOTTIP表达不太敏感的临床治疗药物,包括吉西他滨、pazopanib,舒尼替,和xl - 184,较低的患者比HOTTIP表达式,表明高HOTTIP ccRCC患者的表达可能导致耐药性。
人类负重外骨骼,一个普遍的致癌lncRNA在人类癌症,据报道强烈过表达在多种癌症类型,包括肝癌、胃癌、胰腺癌、骨肉瘤(38]。然而,人类负重外骨骼的角色在ccRCC仍然很大程度上不清楚。我们预测,增加表达的人类负重外骨骼(~ 6折)ccRCC肿瘤组织可能促进淋巴转移和预后不良。CCND1可能受人类负重外骨骼通过交互ccRCC mir - 155。同样,此前透露,人类负重外骨骼击倒诱导细胞生长逮捕并通过抑制细胞凋亡CCND1弥漫型大b细胞淋巴瘤细胞中表达(39]。PCGEM1的过度表达,前列腺特异性lncRNA,是与前列腺癌的风险很大40,41]。的差别恰恰相反,我们发现对这些PCGEM1可能延长转移状态和缩短ccRCC患者的生存时间。我们所知,本研究首先报道人类负重外骨骼的潜在功能,HOTTIP, PCGEM1 ccRCC日期。此外,我们还验证lncRNA PVT1成为致癌lncRNA ccRCC。据报道,ccRCC最强的调节表达PVT1在所有癌症类型和担任肾癌预后因素(42,43]。
然而,由于我们的研究基于TCGA队列通过计算分析,未来的研究应该被设计来验证这些lncACT相声ccRCC进展及其多种功能。总之,我们的研究已经建立了一个新发现,电抗器ccRCC网络基于TCGA数以百计的临床标本。龙头、网络披露,许多癌基因和antioncogenes可能导致ccRCC开发,可以扩大我们对lncACTs在肿瘤发生中的作用的理解。重要的是,我们已经确定了几个lncRNAs是潜在的预后因素和分子目标ccRCC病人。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者没有利益冲突。
作者的贡献
回族张分析数据并写了主要的手稿。紫翔Chen Chunyi赵、钱吴和华中Ting帮助分析数据。Qixiang邵、Yangjing赵和清你们设计的学习和检查和修改后的文章。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
这项工作是支持由国家自然科学基金资助(82100183和82100183)和创新和对江苏省大学生创业培训项目(2021102991051 x)。
补充材料
表S1:调节在ccRCC lncRNAs列表。表S2:列表中表达下调lncRNAs ccRCC。表S3:调节在ccRCC mrna的列表。表S4:列表中表达下调ccRCC mrna。表S5:调节在ccRCC microrna的列表。表S6:表达下调的列表在ccRCC microrna。表S7:前100名的列表(50调节和50下调)特异表达lncRNAs在与图一致1。表S8:基因的列表coexpressed ccRCC HOTTIP。(补充材料)