文摘
背景。WNK赖氨酸缺乏蛋白激酶1 (WNK1)已被证明是高度表达肝细胞癌(HCC)和不良预后相关的肝细胞癌患者的样本基于生物信息学分析。然而,WNK1在肝细胞癌的具体功能还没有被分析。本研究旨在探索的功能WNK1 HCC进展以及其相关的分子机制。方法。由小型干扰RNA WNK1击倒后,细胞计数kit-8,集落形成,免疫印迹,Transwell,伤口愈合化验了评估肝癌细胞的生物学行为。Immunofluorescent染色法应用于检测的影响WNK1 LC3 II。GSK690693或si-AMPK应用块AMPK途径。自噬和AMPK途径相关分子的表达被免疫印迹试验检查。结果。WNK1肝癌细胞株中高度表达,WNK1抑制肝癌细胞增殖、细胞周期、迁移和入侵。此外,我们表明,失去WNK1提升在肝癌细胞自噬和激活AMPK途径。同时,GSK690693治疗或si-AMPK转染抑制自噬和促进肝癌细胞增殖。然而,WNK1击倒中和的效果GSK690693或si-AMPK调节肝细胞增殖。最后,我们证明了WNK1监管肝癌细胞的恶性行为通过调节自噬和AMPK途径。结论。上述结果表明,WNK1可能是一个有价值的目标被认为是肝细胞癌的治疗。
1。介绍
肝细胞癌(HCC)是一种恶性肿瘤肝细胞生成,这是很常见的在亚洲包括中国,占大约80%的肝癌类型(1,2]。目前,越来越多的研究表明,肝癌的发生和进展有关的异常表达许多癌基因和抑癌基因的失活,被越来越多的用于肝癌的早期诊断和治疗3,4]。因此,它是很有价值的探索目标分子和分子机制的肝癌发展的更有效的诊断和治疗策略。
WNK赖氨酸缺乏蛋白激酶(WNK),作为一个典型的蛋白激酶,结合其守恒的赖氨酸残基ATP激酶结构域在不同的位置。在四个哺乳动物WNK亚型,WNK1是最长和广泛表达5]。WNK1击倒可以阻止迁移和血管生成在人类内皮细胞的培养实验小学(6]。除了血管生物学的伟大价值,WNK1提出了促进迁移的细胞参与多种癌症类型(7]。例如,在体外和在活的有机体内联合实验证明WNK1损失显著降低迁移,入侵和转移乳腺癌在多个模型(7]。此外,WNK1可以刺激血管生成加速肿瘤的生长和转移在结肠直肠癌8]。另外,WNK1可以促进肾肿瘤发展通过激活TRPC6-NFAT通路(9]。在活的有机体内使用鼠标和斑马鱼模型分析表明,WNK1加速癌症转移的肝细胞癌和前列腺癌在血管生成和执行伟大的值(10- - - - - -14]。然而,潜在的分子机制WNK1参与HCC的快速开发和高死亡率仍不清楚。
越来越多的证据表明,自噬是显著激活肿瘤细胞包括肝癌、和诱导自噬为癌细胞生成强烈prosurvival机制(15]。先前的研究显示,WNK1是一种自噬抑制剂(5]。然而,WNK1和自噬在肝细胞癌之间的关系尚未透露。
这项研究的目的是探索WNK1的表达水平在肝癌细胞株和WNK1损耗的影响肝癌细胞系的恶性行为。此外,我们还发现自噬WNK1和AMPK的功能信号通路在肝细胞性肝癌细胞株。
2。材料和方法
基因表达分析交互式分析(GEPIA)是一个基于web的工具承受微分表达式的分析,分析策划,相关分析,病人生存分析基于TCGA, GTEx数据。
2.1。细胞系和刺激
人类肝癌细胞系(Huh7, Hep3B HepG2,贝尔- 7402)和正常的人类肝细胞L-02收到中国科学院(中国上海)和培养在同类群包括10%胎牛血清(Gibco的边后卫,中国)37°C的孵化器有限公司5%2。
来击倒WNK1表情,小干扰RNA (siRNA si-WNK1-1,或si-WNK1-2)对WNK1转染成Huh7或Hep3B细胞,和小干扰RNA被视为争夺控制权。GSK690693 (50 nM)或si-AMPK被用来阻止AMPK信号通路。
2.2。qPCR
WNK1基因表达的是qPCR Huh7和Hep3B细胞中发现的。整个使用试剂盒RNA提取试剂(美国表达载体)。的TransScript®一步gDNA移除和互补脱氧核糖核酸合成SuperMix免费设备(美国应用生物系统公司)应用到生成的互补。7500年ABI棱镜进行PCR扩增检测系统(应用生物系统公司)和荧光实时监控。所有数据归一化到GAPDH和分析使用2−ΔΔCt方法。
2.3。免疫印迹
细胞蛋白质制备的支持下裂解缓冲,和蛋白质浓度使用BCA试剂盒检测。然后,30μg蛋白是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳,然后转移到聚偏二氟乙烯膜。接下来,膜被密封在环境温度与5%脱脂奶1 h与以下主要抗体,然后涂抹在一夜之间在4°C: WNK1 (ab137687, 1: 2000年,Abcam) LC3 I / II (ab128025, 1: 1000年,Abcam) Beclin 1 (ab210498, 1: 1000年,Abcam) P62 (ab91526, 1: 1000年,Abcam), AMPK (ab207442, 1: 1000年,Abcam) p-AMPK (ab23875, 1: 1000年,Abcam)和GAPDH (ab181602, 1: 8000年,Abcam)。膜被玷污的二次抗体1 h在环境温度。蛋白质与增强乐队是chemiluminesence然后使用图像分析J软件。
2.4。细胞计数Kit-8化验
根据供应商的方向,发现细胞生存的帮助下细胞计数kit-8 (Beyotime,中国)。Huh7 Hep3B细胞培养在96孔板的密度 。然后,细胞培养与15μL装备解决方案,和孵化1.5 h,其吸光度检测450波长。
2.5。集落形成实验
细胞被播种到60毫米的菜肴和培养介质。盘子被放置在37°C孵化器为14天,和殖民地形成固定与乙醇和0.1%结晶紫染色。殖民地被观察和统计。
2.6。细胞入侵检测
细胞入侵是评估通过Transwell钱伯斯(24-well插入)。总之,细胞( )培养在参议院在DMEM培养基中不包括的边后卫。然后,600年μL完全培养基包括12%的边后卫是众议院。24小时后,noninvaded细胞Transwell膜的上表面被用湿棉拭子。接下来,入侵细胞沾0.1%结晶紫和在显微镜下观察到。
2.7。伤口愈合实验
细胞被播种到6-well板的密度 细胞/。当细胞融合达到了80%,100年μL吸管技巧应用于生成。随后,刮伤的宽度被发现在0 h和24小时对细胞迁移能力进行评估。
2.8。Immunofluorescent染色
Huh7和Hep3B细胞,生长在幻灯片,固定在甲醇,阻止了10%牛血清白蛋白10分钟,和涂抹的主要抗体在环境温度对LC3-II 1 h。然后,细胞在环境温度二次抗体孵育1 h。最后,细胞与DAPI染色10分钟。
2.9。统计分析
所有的实验数据都表示为 三个独立的实验。单向方差分析发现显著差异与Bonferroni事后测试三个或三个以上8.0 GraphPad棱镜组比较。值小于0.05被用来代表一个统计上的显著差异。
3所示。结果
3.1。WNK1的显著增加是发生在肝癌细胞株和损失WNK1肝癌细胞的增殖能力有限
我们首先发现WNK1表达模式在肝癌细胞株,这表明WNK1在肝癌细胞中表达显著增加包括Huh7 HepG2 Hep3B, bel - 7402细胞与正常细胞相比L-02(数字1(一)和1 (b))。较高的表达水平,Huh7 Hep3B细胞被申请后续实验。针对这一点,siRNA技术应用于减少的表达WNK1评估WNK1损耗的影响肝癌细胞的生物学行为(数字1 (c)和1 (d))。信息从GEPIA网站建议WNK1 PCNA表达呈正相关,暗示的重要功能WNK1对肝癌细胞生长(图1 (e))。因此,CCK-8和集落形成试验进行检测的功能WNK1对肝癌细胞增殖。我们观察到的治疗si-WNK1-1或者si-WNK1-2可以显著减少Huh7的OD值和Hep3B细胞(数字1 (f)和1 (g))。此外,细胞克隆的数量显著减少Huh7 Hep3B细胞si-WNK1-1或si-WNK1-2治疗后(数字1 (h)- - - - - -1 (j))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
3.2。失去WNK1限制细胞周期,在肝癌细胞入侵和迁移能力
后来,GEPIA网站的信息显示,CDK1 WNK1表达呈正相关,CDK2表达式在肝细胞癌(数字2(一个)和2 (b))。接下来,应用免疫印迹调查的功能WNK1 CDK1的表达和CDK2 Huh7和Hep3B细胞。数据的数据2 (c)和2 (d)表明WNK1损失减少的表达模式CDK1 CDK2在Huh7和Hep3B细胞。此外,来自Transwell和伤口愈合的数据分析表明,失去WNK1入侵细胞的数量减少,Huh7和Hep3B细胞的迁徙区域(数据2 (e)和2 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。失去WNK1动机肝癌细胞的自噬调控AMPK途径
免疫印迹试验数据表明,WNK1损失明显增加的模式Beclin 1和LC3 II /我的比率,以及减少的模式中P62 Huh7 Hep3B细胞(数字3(一个)和3 (b))。同样,immunofluorescent染色进一步证实WNK1损失明显增加LC3 II的表达与对照组相比在Huh7 Hep3B细胞(数字3 (c)和3 (d))。考虑的重要性AMPK在自噬过程中,应用免疫印迹检测的功能WNK1 AMPK途径。数据显示WNK1损失显著增加的表达式模式p-AMPK Huh7和Hep3B细胞(数字3 (e)和3 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。抑制AMPK抑制肝癌细胞的自噬和促进细胞生长
进一步分析的功能调控AMPK的WNK1自噬,GSK690693 (AMPK抑制剂)的应用。数据从数据4(一)和4 (b)表明GSK690693治疗显著降低p-AMPK的表达模式,Beclin 1, LC3 II /我和P62水平增加。然而,失去WNK1 p-AMPK中和GSK690693治疗的效果,Beclin 1, LC3 II /我和P62水平。随后,来自CCK-8和集落形成的数据分析表明,GSK690693治疗显著增加OD值和殖民地的数量Huh7 Hep3B细胞(数字4 (c)- - - - - -4 (g))。然而,失去WNK1得罪GSK690693治疗对肝癌细胞生长的影响。上述结果表明,WNK1限制损失的恶性行为通过促进肝癌细胞自噬和激活AMPK途径。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
进一步避免脱靶效应AMPK抑制剂,si-AMPK应用。数据从数据5(一个)和5 (b)表明si-AMPK转染显著降低AMPK的表达模式,Beclin 1, LC3 II /我和P62水平增加。然而,失去WNK1中和的效果si-AMPK转染AMPK, Beclin 1, LC3 II /我和P62水平。随后,来自CCK-8和集落形成的数据分析表明,si-AMPK转染显著增加OD值和殖民地的数量在Huh7和Hep3B细胞(数字5 (c)- - - - - -5 (g))。然而,失去WNK1得罪si-AMPK转染对肝癌细胞生长的影响。上述结果表明,WNK1限制损失的恶性行为通过促进肝癌细胞自噬和激活AMPK途径。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
4所示。讨论
先前的研究已经表明WNK1可能也是一个关键激酶参与各种类型的癌症(16]。然而,重要的功能在HCC WNK1尚未透露。这个问题促使我们研究探索WNK1在肝癌细胞的功能。我们的研究显示,WNK1肝癌细胞株中高度表达,和损失的WNK1抑制肝癌细胞的恶性行为通过激活自噬,AMPK信号通路。
自噬是一种重要的生物现象守恒从酵母到哺乳动物。Autophagy-related异常被认为是与多种人类疾病相关,神经退行性疾病和癌症,包括肝细胞癌(17]。在癌症自噬执行双重功能,包括肿瘤发展和抑制,暗示在肿瘤细胞自噬是一把双刃剑(18]。肝细胞癌中,自噬可能促进癌症的发展,例如,CCND1沉默抑制肝癌干细胞分化抑制自噬(19]。另一方面,自噬可以阻止liver-related疾病的发生,例如,阻断自噬,自噬溶酶体降解导致小鼠hepatosteatosis和肝肿大20.),autophagy-deficient老鼠可以开发多个肝肿瘤(21),同源框包含1通过促进自噬抑制肝癌发展[22]。上面发表的报告表明,自噬可以预防肝癌的发展。先前的研究表明WNK1吞噬普遍影响,可能抑制自噬的发生5]。在自噬过程中,Beclin 1参加autophagosomal膜的成核,和LC3 II是涉及双层膜囊泡形成,P62作为衬底被绑定到自噬溶酶体系统退化ubiquitinated蛋白质,这被认为是自噬起始的生物标记物(23,24]。在我们的研究中,我们发现WNK1增加Beclin - 1的表达和LC3 II,以及减少P62表达式,表明WNK1会抑制肝癌细胞的自噬。
AMPK,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,充当一个主传感器与细胞能量代谢体内平衡(25]。除了能量传感器,AMPK的功能在癌症仍然是有争议的。例如,AMPK显然是表示从早期增生的发生大的出现神经胶质瘤(26]。除此之外,降低AMPK AMPK在乳腺癌患者比较强劲的信号信号在正常乳腺上皮细胞27]。激活AMPK密切相关的肿瘤生长,癌细胞迁移和入侵(28]。AMPK损失可以配合致癌潜水员加速肿瘤发生在组织的方式28]。激活AMPK调制多种代谢过程,包括自噬(29日,30.]。energy-deprived条件下,激活AMPK引发自噬(31日]。在我们的研究中,我们发现WNK1损失增加了蛋白质的p-AMPK模式。然而,GSK690693治疗显著降低p-AMPK的水平,Beclin 1, LC3 II /我和P62水平增加。然而,失去WNK1 p-AMPK中和GSK690693治疗的效果,Beclin 1, LC3 II /我和P62水平。此外,GSK690693治疗显著增加OD值和殖民地的数量Huh7和Hep3B细胞,WNK1后反向损耗。
应该指出一些不足。首先,WNK1 / AMPK的功能只是证实了体外。动物实验进一步深造将被执行。第二,上游调节器WNK1和下游AMPK尚未解决的目标,在未来应该发现。第三,LC3II水平测量只在缺乏溶酶体融合抑制剂,LC3II /相比我比需要在溶酶体融合抑制剂的存在与否。第四,其他途径可能参与WNK1对自噬的影响尚未阐明。
5。结论
总之,我们的数据表明WNK1肝癌细胞株中高度表达,失去WNK1抑制增殖,细胞周期,入侵,肝癌细胞的迁移。此外,我们还发现,失去WNK1动机自噬和激活AMPK途径。然而,GSK690693治疗或si-AMPK转染中和自噬的激活AMPK途径WNK1损耗。
数据可用性
和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
我们的研究得到了国家自然科学基金(没有。81801163),医生山东省自然科学基金(基金。ZR201807060846),中国博士后科学基金会(没有。2018 M640636)。