ssDNA作为肝癌诊断和预后的无创指标的作用:一项探索性研究

摘要

背景和目的．这项探索性研究探讨了单链DNA (ssDNA)在肝细胞癌(HCC)诊断和预后中的作用。方法．本前瞻性研究在南京医科大学附属无锡市第二人民医院(2018年5月- 10月)招募了102例新诊断HCC患者、21例肝硬化患者、20例慢性肝炎患者、284例非肝病患者和45例健康者。用磁珠提取ssDNA，用Qubit ssDNA测定法定量。比较了不同疾病组的ssDNA水平以及HCC与非HCC组的ssDNA水平。采用受试者工作特征(ROC)曲线确定ssDNA的诊断价值。在可切除的HCC患者中，ssDNA和α-甲胎蛋白(AFP)水平在随访期间进行测量，并与影像学检测的HCC复发进行比较。结果．HCC中位ssDNA水平高于健康个体、肝硬化和慢性肝炎(中位，23.20 vs. 9.36、9.64和9.76 ng/)μL,分别 ）.HCC患者的ssDNA水平高于肝硬化和慢性肝炎患者 );ssDNA水平在健康对照组和肝硬化患者之间没有差异( ）或慢性肝病( ）.诊断HCC的ssDNA曲线下面积为0.909 (95% CI: 0.879-0.933)。ssDNA水平下降了3.19倍( ）肝癌根治性切除术后。在6例患者中，在AFP和影像学检查发现复发前3-6个月ssDNA水平升高。结论．ssDNA可能是肝癌诊断和预后的一种无创指标。ssDNA最终可能与AFP水平和影像学相补充，但确认性研究是必要的。

1.介绍

肝细胞癌(HCC)是世界上第五大最常见的癌症，也是第三大与癌症相关的死亡原因[1］．肝癌的一个主要病因是慢性乙型和丙型肝炎，在中国等国家流行，导致肝癌发病率高[2]，每100,000名男性为40.0人，每100,000名女性为15.3人[3.］．肝损伤和/或炎症可导致纤维化和肝硬化、肝细胞再生异常和瘤前病变的形成[4，5］．否则，具体的发病机制取决于具体的病因。嗜肝病毒引起炎症、细胞损伤、细胞周转增加、纤维化和肝硬化[5］．酒精相关性肝癌与乙醇代谢和炎症引起的氧化应激有关[5］．非酒精性脂肪性肝炎(NASH)与氧化应激、胰岛素抵抗、脂肪细胞因子功能障碍和导致癌变的细胞增生有关[5］．

甲胎蛋白(AFP)是HCC诊断和监测的生物标志物，39%-65%的HCC患者可检测到AFP水平升高，但许多HCC患者AFP水平较低(例如， ng / mL) [6]因此，需要互补的生物标志物。AFP和其他传统肿瘤标志物（TTM）的联合诊断HCC是一种可能的策略[7- - - - - -9］．新的生物标志物，如高尔基蛋白73 (GP73) [10， glypican-3 (GPC-3) [11和microrna [12- - - - - -14]正在研究中，但对HCC的低敏感性和/或特异性限制了其在临床实践中的应用[10- - - - - -14］．

细胞游离DNA (cfDNA)主要来自凋亡和坏死的细胞，包含其组织起源的完整遗传信息。cfDNA已被认为是接受各种治疗的患者肝癌负荷的动态实时标志物，并可能作为检测肿瘤突变的手段[15］．cfDNA在HCC诊断中的研究主要集中在使用各种技术检测肿瘤突变和甲基化信息，但这些技术价格昂贵，结果也存在冲突[16- - - - - -20.]先前的研究表明，cfDNA的定量测量可能对HCC具有诊断和预后价值[21，22，但cfDNA的定量分析不能提供有关HCC生物学和分子特征的信息。虽然cfDNA定量分析在HCC中的有效性存在争议，但它具有简单、快速、廉价等优点[23，24］．

考虑到afp阴性HCC的高比例[6及cfDNA与HCC的相关性[21，22， cfDNA可用于afp阴性患者的HCC检测。cfDNA由双链DNA (dsDNA)和单链DNA (ssDNA)组成。以往对cfDNA定量变化的研究主要集中在dsDNA上。ssDNA是比dsDNA更早的复制应激标志物[25- - - - - -27］．在高复制应激和复制不受控制的细胞(如癌细胞)中，由于不协调的酶而导致复制叉的停滞或崩溃，导致凋亡细胞形成和释放ssDNA [25，26］．此外，血浆中ssDNA的含量远高于dsDNA [23，24］．

因此，可以推测血浆ssDNA是HCC的一种标志物。本探索性研究旨在探讨ssDNA对HCC的诊断和预后价值。

2.材料和方法

2．1．研究设计与患者

本前瞻性探索性研究纳入新诊断HCC ( ),肝硬化( ),慢性肝炎( ),和非肝脏疾病( ）2018年5月至10月在南京医科大学附属无锡市第二人民医院就诊。根据症状、影像学发现、活检、TTMs(包括AFP和癌抗原(CA) 12-5)和其他血清标志物[28- - - - - -30.］．给定的患者在第一次入院时只被纳入一次。本研究经南京医科大学附属无锡市第二人民医院伦理委员会批准(#Y-25)。在进行任何研究程序之前，参与者需提供书面知情同意。

健康的人( ）在他们去医院做例行检查时登记入选标准为肿瘤、肝脏标志物无高于正常上限及正常体格检查(CT、上消化道内镜、腹部超声)。排除标准为(1)年龄小于30岁，(2)既往治疗(大手术、化疗、内分泌治疗或任何药物的慢性治疗)，(3)良性肿瘤，(4)慢性炎症(糖尿病、心血管疾病或类风湿疾病)，或(5)任何自身免疫性疾病。

为了分析肝脏条件下的ssDNA水平，参与者被分为HCC ( ),肝硬化( ),慢性肝炎( ),及健康人士( ）.为进行诊断价值分析，将受试者分为HCC ( ）和non-HCC ( ）组。可切除肝细胞癌定义为经肝肿瘤外科医生根据Child-Pugh分类判定可切除的肝细胞癌[28，30.]AFP阳性HCC定义为 ng / mL [31］．

2．2.血液采样

在任何处理前，使用4 mL EDTA真空管(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)和4 mL凝胶前凝血真空管(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)采集空腹外周血。对于可切除的HCC患者，在术后第3、14、30和60天采血。对切除的标本进行检查。根据肿瘤淋巴结转移(tumor node metastasis, TNM)分型进行HCC的临床或病理分期[32]肿瘤大小根据实体瘤（RECIST）1.1中的反应评价标准[33］．术后60天(化疗前)行腹部和盆腔CT，作为RECIST评估的基线。

用于HCC和ssDNA患者 ng /μL术后每3个月行CT扫描及采血。根据RECIST版本1.1:完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、进展性疾病(PD)和稳定性疾病(SD)评估疾病缓解。

2.3.单链DNA定量

血样在抽取后1小时内进行处理。等离子体是在 10分钟。等离子体在 10分钟。收集的血浆保存在-80°C。

cfDNA提取试剂盒采用无细胞DNA提取试剂盒(Yuan Biotechnology, Jiangsu, China)，以磁珠法为基础，根据厂家说明书，在样品解冻后2 h内进行提取。简单地说，1ml裂解吸附剂和12.5μ0.5 mL血浆中加入L蛋白酶K, 1500 rpm, 60℃离心10 min。然后,10μ加入L磁珠，室温1500rpm离心10min。磁珠被捕捉到一个磁框上。用25μL洗脱缓冲液B并储存在-20°C下。混合血浆用作质量控制，以监测提取效率的变化。

用5 μ根据制造商的说明，对每个样品和Qubit单链DNA分析试剂盒（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Life Technologies）进行定量。单链DNA的定量在1 μL模式使用Qubit 3.0荧光计(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)。每个样品进行两个重复。质量控制中ssDNA浓度的变异系数必须小于5%。

２.４.血清AFP, CA19-9, CA12-5和CEA

血清AFP、CA19-9 CA12-5和癌胚抗原(CEA)水平测定2 h内使用商业测试工具(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士)Cobas e601分析仪(罗氏诊断、巴塞尔、瑞士),与正常的上限9 ng / mL, 35 U /毫升,35 U /毫升,分别和5 ng / mL。

2．5．统计分析

根据BCLC分类的分界点来呈现患者的特征[34］．连续变量使用Mann-Whitney分析 -或者是Kruskal-Wallis测试。配对连续变量采用Wilcoxon检验进行分析。分类变量采用卡方检验或带连续性校正的卡方检验进行分析。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析ssDNA的诊断价值。选取约登指数最大的值作为最优临界值。大于或等于临界值的值视为正值，小于临界值的值视为负值。用线性回归分析ssDNA水平与肿瘤大小的关系。值< 0.05被认为具有统计学意义。ROC曲线下面积(AUC)采用双侧95%置信区间(CI)报告。采用spss16.0 (IBM, Armonk, NY, USA)进行统计分析。

3.结果

３．１．学科特征

最后，472名受试者被纳入:AFP-negative HCC患者61,41 AFP-positive HCC患者,21与肝硬化,慢性肝炎20,28日与冠心病、34和自身免疫性疾病,与糖尿病20,53岁,肺癌,43与结直肠肿瘤,30胃与十二指肠的肿瘤,与头部和颈部肿瘤,16 5与泌尿系肿瘤,食管癌19例，妇科肿瘤11例，胰腺癌9例，其他肿瘤16例;45名健康人士也参加了研究。在102例HCC患者中，I期37例，II期42例，III-IV期23例。在102例患者中，62例HCC可切除1)， 13例(12.8%)有淋巴结转移，9例(8.8%)有远处转移，76例(74.5%)乙肝病毒(HBV)阳性。

３.２．ssDNA水平

如图所示1和2，肝细胞癌中ssDNA水平较高( ）与其他疾病相比 ，除了胰腺癌 ）.在三种肝病中，HCC患者的ssDNA水平高于肝硬化患者( ）慢性肝炎( ）（两者 ）.健康对照组之间的单链DNA水平没有差异( ）及肝硬化患者( ）（ ）或慢性肝病( ）（表2）.

3．3.肝癌患者的ssDNA水平

在HCC患者中，不同年龄的ssDNA水平无差异( ),性( ),甲胎蛋白阴性/阳性肝癌( ),及肝硬化肝细胞癌( ）分组（表1）1）.不可切除肝细胞癌的ssDNA水平高于可切除肝细胞癌( ）.肿瘤大小亚组间ssDNA水平无差异( ）单链DNA水平与肝癌大小无相关性( ）(补充图S1A）.不同TNM分期患者ssDNA水平差异有统计学意义( ）（表1）.ssDNA水平与TNM分期之间存在秩相关( ，95%置信区间:0.084—-0.444, ）.

3．4．ssDNA对HCC的诊断价值

表格3.和数字3(一个)表现出ssDNA在HCC患者中的诊断价值( ）及非hcc受试者( ）.单用ssDNA检测HCC的AUC为0.909 (95% CI: 0.879-0.933)，敏感性为95.1%，特异性为76.5%3.）.ssDNA水平的诊断效率和阳性率在HCC与 ng / mL和 ng/mL和肝硬化阴性与肝硬化阳性HCC之间的差异(补充表)S1和补充图S2）.ssDNA与其他ttm的所有组合均未显著提高单纯ssDNA对HCC的诊断价值(见表)3.和数字3 (b)）.

3．5．TTMs对HCC的诊断价值

表格3.介绍了TTMs在HCC患者中的诊断价值( ）和非hcc受试者( ）.CA12-5单独用于HCC的AUC为0.742 (95% CI: 0.700-0.781)，敏感性为90.2%，特异性为46.2%。AFP在HCC中的AUC为0.733 (95% CI: 0.691-0.722)，敏感性为56.9%，特异性为89.2%。HCC中单独CA19-9和CEA的AUCs均低于CA12-5和AFP。联合TTMs (AFP、CA19-9、CA12-5、CEA)的敏感性为62.8%，特异性为84.1%，AUC为0.772 (95% CI: 0.732-0.809)。多个组合进行检验;所有含ssDNA的组合的auc均高于不含ssDNA的组合。

3.6。不同疾病ssDNA阳性率的比较

使用 ng /μ以L为最佳临界值，肝癌患者ssDNA阳性率(97/102)显著高于非肝癌患者( ）(图2）.

3.7.肝癌患者根治术前后单链DNA水平的变化

配对ssDNA结果显示，62例可切除HCC患者的ssDNA水平在术后3天达到峰值，并随着AFP水平的下降而下降(补充图)S3）.ssDNA水平在术后60天左右稳定，平均下降3.19倍( ）与基线相比。根据ssDNA的最佳截断值(>12.36 ng/μL)， 11例可切除HCC患者的ssDNA水平未恢复到低水平(即<12.36 ng/μ11例患者中有6例根据RECIST评估为CR。

3.8。ssDNA水平与疾病预后的关系

我们对上述6例CR患者的ssDNA水平进行了长期随访，以确定ssDNA在HCC中的预后价值(补充表)S2）.根据RECIST 1.1评估疾病反应。曲线图描述了随访期间ssDNA水平的变化。如图所示4， 6例患者的ssDNA水平在随访6-12个月时升高，但在疾病进展前由RECIST测定。

3.9。根据提取方法，ssDNA和dsDNA水平的差异

补充数字S4结果表明，磁珠法提取效率优于QIAmp循环核酸试剂盒(Qiagen, Venlo, the Netherlands) ( ),另外，ssDNA和dsDNA诊断HCC的auc分别为0.909和0.880，敏感性分别为95.1%和88.2%，特异性分别为76.5%和79.7%。

4.讨论

HCC缺乏可靠的生物标志物[7- - - - - -9］．高水平的血浆ssDNA是基因组不稳定的标志。本探索性研究旨在通过分析102例HCC患者和370例对照组，探讨ssDNA作为HCC诊断和预后的标志物的价值。结果表明，ssDNA可能是HCC诊断和预后的非侵入性指标，并可能补充AFP和影像学，但需要研究来证实和验证结果。尽管如此，结果表明，ssDNA可以用于筛查疑似HCC但AFP阴性和影像学不确定的患者的HCC。

cfDNA在肿瘤诊断、治疗和预后中的应用前景广阔[16- - - - - -20.］．磁珠法提取cfDNA效率高、质量好[19- - - - - -27，32，33，35］．因此，本研究采用磁珠法提取cfDNA。量子比特ssDNA检测试剂盒对ssDNA不是特异性的，它也可以检测dsDNA和RNA。因此，对cfDNA的提取方法进行方法学评价。结果表明，磁珠法提取ssDNA的效率约为QIAmp循环核酸试剂盒(Qiagen, Venlo, The Netherlands)的两倍，提取的核酸被证实为DNA。由于cfDNA中的ssDNA水平远高于dsDNA [23，24， dsDNA对ssDNA测定的干扰可能不会影响结论，但这必须在具体的方法学研究中加以验证。

当患者患有肿瘤、自身免疫性疾病、传染病、中风和心肌梗死时，血中cfDNA水平显著升高[36].为了排除这些疾病对肝细胞癌单链DNA水平诊断价值的影响，健康个体和肝硬化、慢性肝炎、代谢性疾病、循环系统疾病、自身免疫性疾病和除肝细胞癌以外的各种肿瘤患者被用作不同的对照组。结果显示，HCC患者的单链DNA水平明显高于所有其他疾病，ROC曲线的AUC为0.909，用于HCC诊断。因此，单链DNA似乎是HCC的特异性生物标记物，不受其他疾病的干扰。与AFP和TTMs相比，单链DNA可提高HCC的诊断水平。单链DNA与任何TTM的结合并不能有效地提高诊断价值，这表明单链DNA可能在HCC的诊断中起着关键的诊断作用，正如先前的研究所支持的那样[37］．此外，肝癌患者的ssDNA水平高于那些与肝癌(肝硬化和慢性肝炎)高风险相关的慢性疾病患者[7］．另一方面，在有肝硬化和没有肝炎的HCC患者中，ssDNA的诊断价值没有差异，这表明ssDNA对HCC是特异性的，不受伴随肝病的干扰。虽然复制应激在肝硬化和慢性肝炎中很重要，但可以控制，但HCC具有更高的复制应激。这些结果表明，ssDNA对HCC有很好的鉴别诊断效果，它可能与肝硬化和肝炎无关。间接支持了目前的研究，Kim等人[38表明，在侵袭性HCC患者中，ssdna结合蛋白2的表达升高。Du等[39和Dong等[40]研究表明，特异于单链DNA的适体可以识别HCC。然而，单链DNA截止值必须通过大规模多中心研究确定。事实上，本研究中的最佳单链DNA截止值>12.36 ng/μL，而Chen等报道>509.98 ng/mL的最佳值[41］．

有趣的是，与肝硬化相关的HCC一样，在ssDNA水平、ssDNA诊断效率和ssDNA阳性率之间没有差异 ng/mL vs. >20 ng/mL。这些结果提示，ssDNA水平可能与AFP表达无关，ssDNA可以弥补AFP阴性HCC中AFP诊断的不足。

ssDNA可能用于病人的随访。本研究显示，与AFP水平不同，ssDNA水平在术后3天达到峰值后开始下降，这可能反映了肿瘤切除后循环DNA的快速释放[42］．众所周知，术后AFP水平的下降通常反映了HCC治疗的有效性[43，44].在本研究中，手术后60天内，单链DNA水平稳定。当分析6名完全应答且其单链DNA水平未恢复到低水平（即<12.36）的患者时 ng/μL)术后，ssDNA在随访6-12个月时达到高峰，随后通过影像学证实HCC复发。这些结果表明，ssDNA可用于肝癌根治性切除的有效性，并可用于AFP和影像学诊断HCC的预后。它得到了Kim等人的支持[38他的研究表明，ssdna结合蛋白2的水平与肝癌的生存有关。需要更多的研究来证实这些结果。

本研究有几个局限性。首先，由于本研究进行时没有从文献中获得的数据，因此必须使用在研究期间符合资格标准的患者的方便样本。其次，临界值的阈值基于ROC分析，需要在独立验证队列中进行验证。第三，考虑到本研究中纳入的HCC患者数量适中，应谨慎看待这一结论，特别是在存在边缘性的情况下值。由于这是一个探索性分析，ROC分析的对象简单地分为HCC和非HCC。不同类型癌症及其特征的正式比较将是未来研究的重点。第四，由于随访患者较少，ssDNA在HCC进展和预后中的应用还需要进一步探索。第五，ssDNA与其他hcc相关治疗疗效之间的关系尚未得到评估。最后，不能切除的肝细胞癌患者的ssDNA水平高于可切除的肝细胞癌患者，但本研究并没有探讨ssDNA是否可以用于确定肝细胞癌的可切除性。这些问题还有待进一步研究。

5.结论

本研究提示ssDNA可能是肝癌诊断和预后的一项无创指标。结果的确认和ssDNA截断值的确定对于HCC的诊断是必要的。

数据可用性

本研究中使用和/或分析的数据集和数据均可根据要求从通讯作者处获得。

伦理批准

本研究方案经南京医科大学附属无锡市第二人民医院伦理委员会批准。

同意

所有参与者均提供书面知情同意。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

黄学文构思设计;发展方法论、分析和解释;以及手稿的写作、审查和/或修订。齐昭进行了数据采集、分析和解释。Yiqiu Xu进行了数据采集、分析和解释。袁丹丹对手稿进行了分析和解释、审查和/或修订。杨俊军进行了数据采集和分析解释。王颖、沈国荣对方法论进行了发展。赵琦、徐益秋、袁丹丹、杨俊君、王颖、沈国荣等人对这部作品贡献良多。

致谢

感谢清华大学数学系黄俊宇同学对本次研究的统计支持。我们也要感谢所有在临床前研究中提供专业知识和帮助的成员。

补充材料

补充表S1: ssDNA对HCC的诊断效率。补充表S2。6例完全缓解和可进行随访的患者的标记特征。补充图S1。ssDNA水平与肿瘤大小(最大肿瘤直径之和)的关系。(A) ssDNA水平与肿瘤大小呈线性关系。方程为y=32.744+0.405x, r=0.17, P=0.095。补充图1A中的箭头指向案例。(B)病例1(肿瘤大小:11mm;ssDNA水平:48.6 ng/μL;AFP水平:267 ng/mL)。(C)病例2(肿瘤大小:84mm;ssDNA水平:453 ng/mL;(D) Case3(肿瘤大小:172mm, ssDNA水平:23.8 ng/μ五十、 AFP水平：520 ng/mL）。补充图1B-D中的箭头指向病变。补充图S2。AFP阴性HCC和AFP阳性HCC之间以及肝硬化阴性HCC和肝硬化阳性HCC之间ssDNA阳性率的比较。补充图S3。HCC手术前后ssDNA和AFP水平的变化。（A）单链dna（B）AFP**P< 0.01。补充图S4。验证磁珠法提取cfDNA的效率和cfDNA的性质。(A)两种方法提取ssDNA的效率比较。(B)不同方法提取dsDNA的效率比较。(C)消化前Agilent 2100检测cfDNA的结果。(D-E)分别对RNase A和DNase I酶切后的cfDNA提取液进行Agilent 2100检测。NS:P> 0.05。**P< 0.01。（补充材料）

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