一种与炎症相关的9基因标记改善肺腺癌预后预测

摘要

背景．基于炎症相关基因的肺腺癌(LUAD)临床预后预测模型鲜有报道。方法．利用TCGA数据库筛选出9个具有预后价值的炎症相关基因，并应用LASSO回归构建模型。通过生存分析和多变量分析来评估炎症相关基因的预后特征的预测价值。采用PCA和t-SNE分析验证风险评分的聚类能力。结果．最终鉴定出13个具有预后价值的炎症相关基因(BTG2、CCL20、CD69、DCBLD2、GPC3、IL7R、LAMP3、MMP14、NMUR1、PCDH7、PIK3R5、RNF144B、TPBG)。LASSO回归进一步筛选了9个候选候选(BTG2、CCL20、CD69、IL7R、MMP14、NMUR1、PCDH7、RNF144B、TPBG)。然后，利用上述9个基因构建预后预测模型。在500例LUAD患者中，PCA和t-SNE分析显示了可靠的风险评分聚类能力。生存分析显示，高危组的总体生存明显低于低危组，1年、3年和5年的AUC值分别为0.695、0.666和0.694。最后，多因素分析表明评分系统是总生存率的独立预后因素。结论．我们的研究表明，9个炎症相关基因的特征可以作为LUAD的预后标志物。

1.介绍

肺癌是最常见的恶性肿瘤，是全世界肿瘤相关死亡的主要原因[1］．它分为非小细胞肺癌(约84%的病例)和小细胞肺癌(约16%的病例)[2］．肺腺癌(LUAD)是NSCLC最常见的组织学亚型[3.］．尽管在新辅助化疗、手术等临床治疗方面取得了显著进展，大大提高了患者的生存率，但仍有大量患者存在远处转移[4，5］．因此，迫切需要开发一种新的方法来指导临床治疗，提高LUAD患者的临床疗效。

以往的研究表明，炎性微环境作为肿瘤的第七个标志，可以被激活以促进肿瘤进展[6，7］．有报道称LUAD与慢性肠道炎症相关，表明炎症基因在LUAD的肿瘤发生和发展中发挥重要作用[8，9］．此外，一些研究报道了LUAD中单个炎症基因的重要性[10，11］．例如，炎症相关基因BTG2在肺癌中低表达，过表达抑制LUAD细胞的增殖和转移[12］．此外，在之前的研究中也证实了其在肺癌中的诊断和预后价值[13］．PCDH7在LUAD中明显过表达，其在癌症中的上调预示LUAD患者的生存期更短。PCDH7沉默在功能上抑制ERK激活和肿瘤生长[14］．Zhao和他的团队观察到三种炎症基因(CSF3、IL-1A和IL-6)与b细胞淋巴瘤患者的长期生存有关[15］．到目前为止，还没有基于炎症相关基因预测LUAD患者临床生存的流行模型的研究。

在本研究中，我们旨在确定一个能够预测LUAD患者总生存期的预后炎症相关基因标记。来自TCGA数据集的LUAD原发标本和正常肺标本的大队列患者被用来筛选差异表达的炎症相关基因。我们筛选了与LUAD结局明显相关的炎症相关基因，利用这些基因构建了一个9 - mrna模型，并深入研究了新模型在LUAD患者中的预后价值。

2.材料和方法

2．1．微阵列数据集

基因表达谱分析数据来源于TCGA数据集(https://portal.gdc.cancer.gov/）.本研究使用LUAD组织的数据。微阵列数据包括522例LUAD。在生存分析方面，收集了500例LUAD患者的生存数据。炎症相关基因从分子特征数据库中提取[16］．应用EdgeR-3.30.0软件对差异表达基因(DEGs)进行分析。通过使用Benjamini和Hochberg (BH)方法，修正的错误发现率(FDR)。信使rna与 ， ，百万分之trans的中位数 定义为有统计学意义的差异表达。根据国家生物技术信息中心数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，与这些mrna对应的基因被鉴定。

2．2.临床LUAD样本采集

收集山西省中医院行手术的LUAD患者8对原发性LUAD组织及相应的非肿瘤组织。所有标本的组织病理学诊断分别由两位病理学家诊断。所有患者均获得知情同意。所有实验方案均经山西省中医院机构审查委员会批准。

2．3.LUAD预后炎症相关基因标记的构建

用a值<0.01时，Cox回归分析(使用“生存”包)被用于建立预后模型。根据初步分析( ），然后将收集到的炎症相关基因合并到一个最小绝对收缩和选择算子- (LASSO-)惩罚Cox比例风险回归模型中，该模型用于识别最优风险签名模型，而不存在过拟合风险[17］．应用该模型探讨总生存期(OS)与炎症相关基因的关系。然后，我们组使用该模型计算风险评分，并进一步将所有患者分为高危组和低危组。

２.４.风险评分系统的评估

为了探讨我们的模型的预后价值，我们通过“survival”和“survminer”软件包进行Kaplan-Meier分析。随后，应用“生存ROC”软件包生成受试者工作特征(ROC)曲线。进一步进行PCA和t-SNE分析，评估风险评分的聚类能力，进一步证明模型的相关性[18］．也进行了单因素和多因素分析。

2．5．实时荧光定量PCR分析

用Trizol试剂(Invitrogen)从所有肿瘤和正常标本中分离总RNA。根据制造商的说明书，使用miScript II RT Kit (Qiagen)，用2mg总RNA进行cDNA合成。qRT-PCR检测采用Power SYBR Green (Takara, Zhejiang, Hangzhou, China)的方法进行。计算基因的相对表达量，用2^−ΔΔCt方法相对于GAPDH。特异性引物序列见表1．

2.6。人类蛋白图谱分析

人蛋白(HPA;https://www. proteinatlas.org/)包含了人类在肿瘤和正常标本中的蛋白表达模式图谱。在本研究中，我们使用HPA数据库检测BTG2、MMP14和PCDH7的蛋白表达。

2.7。统计分析

所有分析都使用R版本3.6.2进行。差异被认为在统计学上显著 ．

3.结果

３．１．LUAD中预后炎症相关基因的鉴定

首先，我们使用“R”对TCGA数据集进行分析，筛选出46个与炎症相关的DEGs和35个与炎症预后相关的基因。维恩图显示13个与炎症相关的预后异常，包括BTG2、CCL20、CD69、DCBLD2、GPC3、IL7R、LAMP3、MMP14、NMUR1、PCDH7、PIK3R5、RNF144B和TPBG(图)1(一)）.热图显示了炎症相关基因的表达趋势(图)1 (b)）.对522份LUAD样本中的13个差异基因进行了单因素分析value和HR value如图所示1 (c)．此外，我们基于TCGA数据集中BTG2、CCL20、CD69、DCBLD2、GPC3、IL7R、LAMP3、MMP14、NMUR1、PCDH7、PIK3R5、RNF144B、TPBG的表达构建了相关网络，发现MMP14、DCBLD2、TPBG、PCDH7呈正相关关系。BTG2与DCBLD2、PCDH7、TPBG呈负相关。BTG2、CD69、NMUR1、PIK3R5、LAMP3、RNF144B和IL7R呈正相关(图)1 (d)）.

３.２．预后炎症相关基因标记的构建

为了降低模型过拟合的风险，我们对上述13个基因进行了LASSO回归，结果显示了9个关键的生存相关炎症相关基因(图)2(一个)和2 (b)）.应用这9个基因建立预后模型评分: (表2）.这4个DE炎症相关基因中有2个与风险升高相关(CCL20、MMP14、PCDH7和TPBG; ），5个是预测风险降低的保护性基因(BTG2、CD69、IL7R、NMUR1和RNF144B; ）.所有患者均采用该风险评分方法进行评分。所有患者被分为低风险组( ）和高风险( ）应用中位数风险评分值的组。表格3.列出250例LUAD患者的临床信息。此外，PCA和t-SNE分析显示了这一基于9个基因的风险评分的聚类能力(图)2 (c)和2 (d)）.

３．３．9 - mrna模型在预后预测中具有很强的诊断能力

生存分析显示高危组患者的总生存期明显短于低危组患者( ；数字3(一个))， 1-、3-和5年的AUC值分别为0.695、0.666和0.694(图3 (b)）.如图所示，LUAD患者在TCGA数据集中的风险评分分布(图)3 (c)）.建立了生存状态概述(图3 (d)）.单变量分析显示该阶段( ）及风险评分( ）可以预测LUAD患者的OS(图4(一)）.多因素分析进一步证明该阶段( ）及风险评分( ）可能是LUAD患者的独立生物标志物(图4 (b)）.

3．4．数据验证

然后通过RT-PCR检测LUAD标本中BTG2、MMP14和PCDH7的表达情况，观察BTG2的表达情况(图)5(一个))在正常肺标本中明显升高，而MMP14(图5 (b))和PCDH7(图5 (c))在LUAD标本中表达明显高于正常肺标本。此外，从HPA提取的免疫组化数据显示，BTG2蛋白在非肿瘤组织中的表达高于肿瘤标本，而MMP14和PCDH7蛋白在非肿瘤组织中的表达低于肿瘤标本(图)5 (d)- - - - - -5 (f)）.

4.讨论

LUAD的临床治疗仍然是一个挑战，LUAD仍然是肿瘤相关死亡率的主要原因[19］．虽然手术切除被广泛应用，但5年生存率仍在15%左右，说明这方面并没有令人满意的改善[2，20.］．为了改善LUAD患者的临床结局，许多研究者关注早期诊断的发展[21，22］．此外，越来越多的靶向治疗在临床实践中增加了治疗方案，这对敏感预后生物标志物的鉴定提出了更高的要求[23，24］．近年来，由于炎症基因在血清和肿瘤标本中的频繁失调，以及其在各种肿瘤(包括LUAD)中的致癌或抗致癌作用，越来越多的研究发现炎症基因是一种新型的生物标志物[25，26］．

在本研究中，我们分析了TCGA数据集并筛选了9个与预后相关的炎症基因(BTG2、CCL20、CD69、IL7R、MMP14、NMUR1、PCDH7、RNF144B和TPBG)，其中一些基因在LUAD中也显示了异常表达[27- - - - - -29］．此前，已对上述几个基因在LUAD中的功能进行了研究。例如，BTG2在肺癌中高表达，促进肿瘤细胞的增殖和转移[30.］．过表达CCL20通过PI3K途径促进肺癌细胞迁移和增殖[28］．MMP14也被证明在肺癌中作为肿瘤启动子[29］．这些发现强调了这些炎症基因作为新型生物标志物的潜力。因此，我们进行了多变量分析并构建了提供风险评分的预后模型。通过生存分析、风险分析、ROC曲线和多变量分析，进一步验证了模型的准确性。此外，我们检测了BTG2、MMP14和PCDH7在LUAD标本中的表达，发现BTG2在LUAD标本中低表达，而MMP14和PCDH7在LUAD标本中高表达。因此，该特征是LUAD患者的独立预测因素。

应该注意到我们研究的几个局限性。首先，本研究对患者数量较少进行了分析;需要对更多的患者进行进一步的研究来证明我们的发现。其次，这9个基因的潜在功能没有被发掘。因此，需要更多的样本来证明预后模型的准确性。此外，炎症相关基因在LUAD进展中的作用机制还需要进一步的研究。

5.结论

我们的研究表明，9个炎症相关基因的特征可以作为LUAD的预后标志物。

数据可用性

本研究纳入的数据可在TCGA数据库(https://cancergenome.nih.gov/）.

的利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

刘泽经和王希兴对这一概念的形成负有责任。形式分析由刘泽景、侯鹏晓负责。刘泽经、王希兴负责原稿的撰写，并对原稿进行了修改和编辑。

致谢

山西省中医院基金资助项目(No. 201903D321225)。

参考文献

1. R. L. Siegel, K. D. Miller和A. Jemal，《2018年癌症统计》，CA:临床医生的癌症杂志第68卷第2期1，第7-30页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. b.c. Bade和c.s. Dela Cruz，《2020年肺癌:流行病学、病因学和预防》，胸科诊所号，第41卷。1, pp. 1 - 24, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. S. K. Thakur, D. P. Singh, J. Choudhary，“肺癌鉴定:检测和分类综述”，癌症转移的评论第39卷第3期3, pp. 989-998, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. S. K. Vinod和E. Hau，“肺癌放射治疗的现状和未来方向”，Respirology， vol. 25, supp2, pp. 61-71, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. K. Wadowska, I. Bil-Lula， Ł。Trembecki和M. Śliwińska-Mossoń，《肺癌诊断中的遗传标记:综述》，国际分子科学杂志第21卷第2期13，第4569页，2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. J. Kim和J. S. Bae，“肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞和中性粒细胞”，炎症介质， 2016年第1期，文章编号6058147,11页，2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. J. Candido和T. Hagemann的《癌症相关炎症》临床免疫学杂志， vol. 33, Suppl 1, pp. S79-S84, 2013。视图:谷歌学术搜索
8. 石磊，王磊，侯建军等，“炎症微环境在肺癌及其转移中的靶向作用”，癌症转移的评论第34卷第3期2, pp. 319-331, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. S. Saab, H. Zalzale, Z. Rahal, Y. Khalifeh, A. Sinjab，和H. Kadara，“对肺癌免疫生物学、预防和治疗的深入了解，”免疫学前沿， 2020年，第11卷，第159页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. “微环境相关基因在肺腺癌预后价值的鉴定与验证”，肿瘤的信件，第20卷，第2期。2, pp. 1772-1780, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. Mao K.， Lin F.， Zhang Y.， and H. Zhou，“利用生物信息学分析鉴定吉非替尼耐药肺腺癌的关键基因和通路”，进化生物信息学网络，第17卷第11769343211023767条，2021年。视图:谷歌学术搜索
12. “miR-25通过直接抑制BTG2的表达调控非小细胞肺癌细胞的放射敏感性，”生物化学与生物物理研究通讯，第457卷，第2期。3, pp. 235-241, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. S. Shen, R. Zhang, Y. Guo等，“一项多组学研究揭示BTG2是早期非小细胞肺癌可靠的预后标志物，”分子肿瘤学，第12卷，第2期6, pp. 913-924, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. 原cadherin 7通过SET和PP2A增强EGFR和KRAS介导的MAPK信号通路。癌症研究第77期1，页187-197,2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. 赵s .，白南，崔娇，向仁，李南，“通过三种炎症基因的表达预测弥漫性大b细胞淋巴瘤患者的生存”，癌症医学，第5卷，第5期。第8页，1950-1961,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. a . Subramanian, P. Tamayo, V. K. Mootha等人，“基因集富集分析:解释全基因组表达谱的基于知识的方法，”美国国家科学院学报第102卷第1期43, pp. 15545-15550, 2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. J. Friedman, T. Hastie，和R. Tibshirani，“通过坐标下降的广义线性模型的正则化路径”，统计软件杂志第33卷第3期1，页1 - 22,2010。视图:谷歌学术搜索
18. D. Kobak和P. Berens，“使用t-SNE进行单细胞转录组学的艺术”，自然通讯，第10卷，第5期。1, p. 5416, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. F. R. Hirsch, G. V. Scagliotti, J. L. Mulshine等，“肺癌:当前疗法和新的靶向治疗”，《柳叶刀》，第389卷，第2期。10066, pp. 299-311, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. P. Villalobos和I. I. Wistuba，“肺癌生物标志物”，北美血液学/肿瘤学诊所第31卷第1期1，第13-29页，2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. Mao Y.， Yang D.， He J.， M. J. Krasna，“肺癌流行病学”，北美肿瘤外科诊所，第25卷，第2期3，第439-445页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. 何俊杰及梁志忠，“肺结核及肺癌的治疗”，肺癌，第122卷，第83-87页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. M. N. Aoki, M. K. Amarante, C. E. C. de Oliveira, M. A. E. Watanabe，“非小细胞肺癌的生物标记物:个体化靶向治疗的前景”，药物化学中的抗癌药剂第18卷第2期15，第2070-2077页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. I. Hoseok和J. Y. Cho，《第三章:肺癌生物标志物》，临床化学研究进展，第72卷，107-170页，2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. C. H. Lu, D. W. Yeh, C. Y. Lai等，“USP17通过调节TRAF2/TRAF3复合物的形成介导巨噬细胞促进的炎症和干性肺癌细胞，”致癌基因，第37卷，第2期49, pp. 6327-6340, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. B. Sandfeld-Paulsen, P. Meldgaard, B. S. Sorensen, A. Safwat, and N. Aggerholm-Pedersen，“肺癌患者炎症评分对总生存期的预后作用”，Acta Oncologica，第58卷，第2期3，第371-376页，2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. Chen Z.， X. Chen, B. Lu等，“上调LINC01234通过激活VAV3和抑制BTG2表达促进非小细胞肺癌细胞转移，”血液学与肿瘤学杂志，第13卷，第2期1, p. 7, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. Wang B.， Shi L.， Sun X.， Wang L.， X. Wang, and C. Chen，“肺癌细胞产生CCL20通过PI3K途径诱导细胞迁移和增殖”，细胞与分子医学杂志，第20卷，第2期。5、pp. 920-929, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. M. Stawowczyk, M. D. Wellenstein, S. B. Lee etal，“基质金属蛋白酶14通过肝素结合egf样生长因子的切割促进肺癌”，瘤形成第19卷第2期2, pp. 55-64, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. M. E. Fiori, L. Villanova, C. Barbini, M. L. De Angelis，和R. De Maria，“miR-663通过抑制线粒体外膜透过PUMA/BBC3和BTG2的通透性(MOMP)来维持非小细胞肺癌”。细胞死亡与疾病，第9卷，第5期。2，第49页，2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权所有©2021刘泽京等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。