文摘

背景。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2 (SARS-CoV-2)感染已从2020年初的迅速蔓延全球。量化一(RT-qPCR),这一天,病毒RNA检测的首选方法,即使不是没有问题。克服的一些局限性还是现有的核酸检测和量化的在各种应用程序中,使用一步扭转transcription-droplet数字PCR (RT-ddPCR)已经建立。然后,本研究的目的是评估的有效性ddPCR SARS-CoV-2 RNA的检测鼻咽拭子,优化检测机率load-burdened样本。方法。RT-ddPCR工作流验证了灵敏度、特异性、线性、重现性和精度使用样本90 COVID-19-infected病人指实验室医学系乌迪内大学医院的(意大利)。结果。目前的研究表明,RT-ddPCR允许检测作为SARS-COV-2低见10.3份apoe基因每样一个更高层次的准确性和精度,特别是在低浓度。结论。SARS-CoV-2 postpeak阶段的大流行期间,必须依赖于一个高度健壮的分子生物学方法来识别受感染的受试者,他们是否有症状,为了准备适当的控制措施。

1。介绍

严重急性呼吸系统综合症冠状病毒的出现2 - (SARS-CoV-2)相关疾病(COVID-19)在2019年底在中国引起了重大的全球疫情和仍是一个严重的公共卫生问题。事实上,到2020年1月底,世界卫生组织(WHO)宣布COVID-19第六国际关注的突发公共卫生事件(1]。所谓SARS-CoV-2是属于属Betacoronavirus单链RNA病毒。多重序列比对发现SARS-CoV-2密切相关(88 - 89%的相似性)bat-derived类似非典的冠状病毒,但相比严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(冠)和中东呼吸系统综合症冠状病毒(MERS-CoV) SARS-CoV-2显示更少的遗传相似性(分别为79%和50%)2]。相关的疾病,称为COVID-19,特点是发热、疲劳、干咳,pharyngodynia、气短、头痛、胸闷、胸痛、和肌痛(3]。在一些病人,症状迅速恶化导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS) [4]。比例变量受感染的受试者,估计有20 - 25%左右,不会显示任何症状,很难限制感染,因为这些患者能够传播病毒,可能代表了一群很容易被忽视的流行病预防的。事实上,公共卫生当局将需要实现快速和敏感的诊断工具在最短的时间内病人的管理。根据世界卫生组织(世卫组织),目前的黄金标准SARS-CoV-2感染的诊断是基于定量一(RT-qPCR),它可以检测SARS-CoV-2核酸患者样本。

液滴数字的PCR (ddPCR)是一个变体emulsion-based PCR技术。超灵敏的方法,它是一种很有前途的能力划分样本到数百万picoliter液滴含有single-nucleic酸(NA)和分析每个液滴的终端荧光分子平行放大后(5]。此外,它消除了需要一个标准曲线定量PCR (qPCR) [5,6]。这种尖端技术已迅速进入临床实践,为预后评估提供有用的迹象,监视和特征的疾病也为病原体的检测核酸(7,8]。此外,一些数据的发展反向transcription-ddPCR (RT-ddPCR)方法已经产生,证明这种方法具有更高的精度和提高灵敏度检测比RT-qPCR罕见的目标在低拷贝数。

SARS-CoV-2 postpeak阶段的大流行期间,必须依赖于一个高度健壮的分子生物学技术检测感染对象,不管是否有症状,建立适当的控制措施。本研究的目的是验证和优化检测机率load-burdened患者耦合已经可用的引物和探针集和RT-ddPCR技术,确定最合适的工作流。

2。材料和方法

2.1。患者样本

paucisymptomatic SARS-CoV-2样本收集从90年症状,或无症状患者的鼻咽拭子,指的是实验室医学系,乌迪内大学医院,据报道,意大利和积极分子生物学标准程序(RT-qPCR)。棉签收集、运输和长期储存,使用UTM®管(科潘诊断),根据制造商的指示。伦理批准了该地区医学研究伦理委员会的弗留利威尼斯会,意大利(同意ceur - 2020 - os - 033)。

2.2。从鼻咽拭子中提取RNA

自动提取的精英InGenius®SP200 SARS-CoV-2 RNA (ELITechGroup)系统,200年μL培养基的UTM®管包含3毫升,遵循制造商的指示。100年样本筛选了μL洗脱缓冲和用作下游分析模板。提取RNA是储存在−80°C。

2.3。一步扭转Transcription-Droplet数字聚合酶链反应(RT-ddPCR)

5 6-FAM / 3 BHQ-1®共轭分析被用于病毒载量评估一步RT-ddPCR先进装备的探针(Bio-Rad)。寡核苷酸在表列出1从默克公司购买。简单地说,5μL (ddPCR™Supermix探针(没有dUTP), 900海里引物和250纳米探针,15毫米德勤,20 U /μL逆转录酶,2μL样本,nuclease-free水混合总量的20倍μl .样本混合液滴发生器石油探测(Bio-Rad)和液滴与自动生成液滴发生器QX200™液滴发生器(Bio-Rad)。进行PCR扩增的Veriti®热循环(热费希尔科学)。放大了在50°C逆转录60分钟,95°C为酶激活,10分钟,其次是45 95°C的周期30年代,60年代55°C,然后98°C为10分钟酶失活。滴上读QX200™滴读者(Bio-Rad)和反应不足10000滴被重复。引物的5 十六进制/ 3 BHQ-1®共轭探针RNaseP人类基因进行了评估验证的充分性RNA隔离。数据分析使用QuantaSoft™1.7.4软件(Bio-Rad)。对所有实验在这个工作中,相同的阈值被用于FAM和十六进制信号。这些都是由运行在一个多路复用积极控制(冻干积极控制LightMix®模块化SARS和武汉浸apoe基因从罗氏)和没有模板控制样本。

表1
引物和探针SARS-CoV-2检测用于这项研究。
2.4。定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)

检测病毒RNA, LightMix®模块化SARS和武汉浸apoe基因(罗氏)曾如前所述9]。RT-qPCR是由LightCycler®480 II仪器(罗氏)和绝对量化评估了LightCycler®480 II系统(罗氏)。估计病毒拷贝数提取RT-qPCR Cq值的计算是基于线性回归的连续稀释用的综合控制E基因由罗氏公司在LightMix®模块化SARS和武汉浸apoe基因工具包。

2.5。空白(LoB)和极限检测极限(LoD)

空白的极限(LoB)和检测极限(LoD)评估,避免假阳性和假阴性结果,可靠和批判性描述最低能被探测到的病毒载量与这个方法。空白的极限(LoB)建立了最多的病毒复制,可以测量时没有模板控制(NTC)复制测试。使用信噪比的LoB成立,即。,by measuring false-positive events from 40 wells of NTC for each primer and probe set (see Table1),使用下面的公式: 如前所述(10,11]。LoD代表分析物的最低数量,可以可靠地检测到,即,the lowest number of copies that can be clearly distinguished from the background with 99% probability, ensuring a false-positive 。在我们的研究中,LoD计算为: ,被 低浓度样品的标准偏差11- - - - - -13]。LoB和LoD表中列出的寡核苷酸1。

2.6。量化的限制(定量限)

代表了最低定量限的分析物,可以可靠地量化精度和准确性。这是通过信噪比计算方法 。此外,对于E基因孤独,进一步验证了定量限7系列稀释SARS-CoV-2-positive样本(5倍),与每个稀释被重复十倍(见部分2.10)。浓度,变异系数(CV)不到30%是用作定量限10,14,15]。

2.7。协议

评估我们RT-ddPCR之间的协议和金本位(RT-qPCR) Bland-Altman分析使用。共有60个样本用于这个目的,分为30积极和30 SARS-CoV-2负样本。评估数据的分布,Shapiro-Wilk正常测试。比较的方法是使用斯皮尔曼等级相关系数分析。正样本的原始数据的分析与RT-qPCR RT-ddPCR补充表中给出1。

2.8。精度

分析过程的准确性测试结果的亲密方法到一个特定的值,得到的是真正的传统价值或公认的参考。RT-ddPCR准确性的评价是由测试四种不同的阳性样本稀释(Cq 20.7 RT-qPCR),与10复制。积极的控制稀释使用缓冲区中提取病毒RNA(精英InGenius®SP200系统)。

2.9。精度

的精度分析方法被定义为测量获得的一系列的亲密的多个决定在特定条件下相同的样本。它可以建立重复性和中间的精度。重复性是评估通过评估通过分析阳性样本方差在三个不同的稀释,三次同日,使用相同的设备和一批试剂。中间精密度是评估通过测量阳性样本在三个不同的稀释,每天三次,连续三天。每个系列的分布结果与Shapiro-Wilk测试检查。评估差异的平等,精度检查使用单向方差分析,根据ISO 5725指南(16]。

2.10。线性

分析方法的线性是能够获得测试结果直接正比于样品的分析物的浓度在一定范围内或通过定义良好的数学转换。RT-ddPCR的线性范围是建立一系列的文科稀释。每个稀释测试10复制。观测值之间的关系和线性回归了金本位。

2.11。统计数据

GraphPad Prism 6.0执行统计分析。Grubb内的测试被用来识别异常值复制。定量变量与单向方差分析进行了分析。一个 值≤0.05被认为是具有统计学意义。 , , ,和 。

3所示。结果

我们优化RT-ddPCR工作流使用引物和探针集在2020年初发布的两个德国Consiliary实验室冠状病毒(柏林夏洛,)17)和美国疾病控制和预防中心(CDC,亚特兰大)[18),这对COVID-19已获批准在体外诊断。表1包含六种不同引物对信息(化验)用在这项研究中,这是针对SARS-CoV-2基因组的特定区域。空白的极限(LoB)决定对所有化验分析40没有模板控制(NTC)复制。所有分析点显示10000多滴,因此保留进行进一步分析。N1的使用试验立即放弃了由于高的引物二聚体,创建积极放大所有NTC复制(数据没有显示)。检测极限(LoD)被计算为所有5化验,ntc的意思是+ 3低集中样本的标准偏差。如表所示2、分析目标信封的基因(E基因)提出了最低的LoD(7册/反应)相比其他化验。确保患者样本进行评估以最好的方式,避免失去低病毒载量,我们计算的极限量化(定量限),这样做,我们评估的分析使用E基因因为它是证明了最佳性能(表2)。

表2
估计的极限空白(LoB),检测极限(LoD),并限制的量化(定量限)根据国际协调会议的指导方针(我)27]。

然后我们评估所有5个检测的敏感性和特异性,测试30患者样本,(19阳性和11个阴性)与标准的分子生物学技术检测SARS-CoV-2(即。RT-qPCR) (19]。除了N2的试验,特异性引物和探针显示100%,但一个变量的敏感性。表3总结了敏感性和特异性百分比的分析评估。

表3
特异性和敏感性SARS-CoV-2化验测试30患者样本。

考虑到目前为止收集到的所有数据,我们继续我们的工作流验证使用引物和探针E基因,显示最低定量限的测定,最佳组合的特异性和敏感性。

Bland-Altman分析显示,所有负样本提出了病毒复制以下估计定量限。测量值之间的偏差为0.168(95%置信区间:0.030—-0.307)和95%(图的协议1)。Shapiro-Wilk正常测试表明,人口不是正态分布( )。斯皮尔曼的ρ测试显示这两种方法之间有高度的相关性系数 ( )。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
协议RT-qPCR和RT-ddPCR SARS-CoV-2 RNA检测。(一)Bland-Altman情节代表RT-qPCR和RT-ddPCR之间的协议。虚线代表95%的上限协议,偏见,和下限95%的协议。(b)箱线图显示 份SARS-CoV-2 RNA RT-qPCR和RT-ddPCR评估。 由Mann-Whitney (ns) 测试。

确定系数( )显示之间的关系预期病毒复制(RT-qPCR)和测量的(RT-ddPCR)是线性的( )和安装线的斜率为0.91。这种回归系数表明RT-ddPCR检测病毒复制比预期低9%。更准确的估计这种偏见已经获得的评估方法的准确性。

方法的准确性评估分析4不同浓度与10复制。准确性是表示为变异系数(CV)。对于分子生物学分析,CV值是接受不到30% (20.]。结果表明,我们的工作流程有一个高水平的准确性, 对所有的检测稀释。总结了数据表4。

表4
SARS-CoV-2 RT-ddPCR使用的检测的准确性E基因化验。

最后,给出表精度评价数据5。重复性和精度中间被分组为每个测试和分析了单向方差分析(方差分析)。这两个参数的变异系数< 25%稀释分析。

表5
国际米兰,intra-assay精度表示为变异系数(CV %)。

4所示。讨论

SARS-CoV-2大流行构成了重大挑战国家和地方公共卫生实验室,这不得不重组很快识别感染者尽快使容器的发展策略来防止病毒的传播。据世界卫生组织(世卫组织)和中国疾病控制和预防中心(CDC),目前的黄金标准SARS-CoV-2感染的诊断是基于PCR定量一(RT-qPCR) [19),因为它有很大的伸缩性,它很快,很便宜。另一方面,qPCR结果在低精度和准确性评估样本低病毒载量,报道的敏感性变化从30%到60%取决于试验(21- - - - - -24]。

2020年1月以来,提出了几个化验病毒RNA的准确检测COVID-19患者的样本。在这项研究中,我们比较了前六发表分析评估其性能检测的敏感性和特异性()使用期间收集的样本在意大利的第一波爆发。结果表明,存在实质性差异的能力正确识别弱阳性样本。此外,大多数这些化验显示定量限高,这使得它们不适合诊断的目的。由于这些原因,我们验证RT-ddPCR工作流使用引物和探针信封的基因(apoe基因),因为它能够区分10.3的副本apoe基因SARS-CoV-2的背景,具有高敏感性和特异性(分别为90%和100%)。实验评估SARS-CoV-2检出率在60患者样本显示RT-ddPCR和RT-qPCR之间有高度的相关性。然而,由于高度的相关性并不一定意味着有一个很好的协议之间的两个方法,我们执行一个Bland-Altman测试。两种方法之间的偏差是0.1683,几乎所有的测量分协议中的95%。综上所述,我们的数据表明,RT-ddPCR和RT-qPCR可用于SARS-CoV-2 RNA的检测。尽管这两种方法显示良好的协议和相关,RT-ddPCR演示了一个更高层次的准确性和精度,特别是在低浓度,即。,接近定量限。此外,它提供了一个绝对测量的病毒复制,而不需要为RT-qPCR设定阈值水平。由于精密诊断程序的一个关键特性,进一步描述工作流的优势,我们计算重复性和中间精密度测试三种不同的阳性样本稀释每天连续三天。变异系数(CV)国际米兰还不到30%,盘中测量表明在评估结果没有显著差异。

不幸的是,并不是所有发光的都是金子。样品制备、液滴生成和检测需要很长时间,增加调查时间。此外,病毒效价高的样品进行低估实际的核酸的浓度,随着液滴饱和,ddPCR目前的成本与RT-qPCR相比更高。

事实上,在过去的几个月里,一些作品强调的好处使用RT-ddPCR为分析样本与低SARS-CoV-2负载或来自病人的唾液,比较两个不同的平台(即。,从Bio-Rad QX200系统,从TargetingOne TD-1系统,或者从Stilla奈卡系统技术)和使用不同的工具21- - - - - -23,25,26]。尽管不同的方法,他们所有的人都同意我们的数据在考虑RT-ddPCR SARS-CoV-2高度健壮的技术检测在临床应用中,在病人的随访,首选正确监测病毒载量控制感染是至关重要的。

总之,尽管限制,RT-ddPCR是合适的,精确的,敏感的,和准确的方法检测SARS-CoV-2 RNA,这应该不喜欢(即大规模筛查。,指数大流行阶段)但当正确的检测受感染的受试者将防止进一步波感染的可能性。我们已经验证工作流基于检测的E基因,它允许检测低见10.3病毒复制。这项工作描述的工作流实际上是旨在减少假阴性,与评估对象的可能性低病毒载量,仍将无法觉察的大规模筛选qPCR或准确地跟踪卸货前患者病毒载量。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

信息披露

病理学的部分手稿提出了调查人员,学生,院士(PISA) 2020年,国会(文摘A051;p: S16)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

厘米,AC, SM概念研究;CM和AC执行所有的实验和批判性思维导致解释结果;CM起草的手稿;BM和CM修订统计分析;SM, CP、GD和FC造成了实验设计和修订后的手稿。

补充材料

补充表1:30阳性样本的原始数据用来评估RT-qPCR和RT-ddPCR之间的协议。(补充材料)