文摘
多个基因已经被牵连在哮喘易感性的关联研究。儿科患者经常表现更广泛的形式的这种疾病,一种特别严重的疾病。很可能遗传易感性可能会发挥更重要的作用。本研究旨在识别罕见的光谱和小说在已知的小儿哮喘易感基因变异使用全外显子组测序分析在9个个案儿童过敏性哮喘。九个孩子的DNA样本与支气管哮喘诊断的历史进行了全外显子组测序在离子质子。对于每一个病人,整个补的罕见变异密切相关候选基因是编目。分析显示21个变种的主题,13之前确定,8是小说。在其中,19是产生和2是无稽之谈。关于这部小说变异,2中产生的变异PRKG1基因(PRKG1:p。C519W和PRKG1提出了:p.G520W) 4例,产生的变体小牛基因(小牛:3例p.A45V)被确认。我们在这项研究中发现的变异将丰富变异谱,建立数据库在沙特人口。小说8变种被识别的研究提供了更多的证据在沙特儿童哮喘的遗传易感性,提供遗传筛查地图过敏疾病的分子遗传学因素在沙特的孩子,目标是减少慢性疾病对健康的影响和经济。我们相信先进的统计指定过滤/注释程序用于这项研究成功释放这样的初步研究结果,探索在沙特儿童疾病的遗传图谱。
1。介绍
哮喘和其他过敏性疾病,包括过敏性鼻炎、湿疹、食物过敏,导致儿童重大疾病负担。虽然在哮喘和过敏症快速增长已被确定在20世纪后期,原因仍然未知的(1]。最近环境因素的变化及其与基因相互作用的资料已经被认为是主要因素负责哮喘和过敏性疾病的增加(2]。
哮喘、慢性炎性呼吸道条件特点是反应过度航空和可逆气流阻塞,仍然是一个重大的公共卫生问题,影响了全世界将近1.55亿人与当前儿童哮喘和较高的发病率比成人相比(3- - - - - -5]。虽然环境因素很重要,有很强的遗传易患变应性疾病的发展。据报道,有超过100个候选基因在每个染色体的识别与哮喘和连杆的强度关联的单核苷酸多态性(snp)与哮喘品种在世界不同的地方3- - - - - -5]。更好的知识哮喘易感性的前景将更好地了解病理学、诊断、预防、治疗和管理的日益频繁的疾病。
下一代测序(上天)技术,特别是外显子组测序,目前是最强大的和成本有效的方法来识别人类基因组的变化和已经发现重要致病变异错过GWAS研究[6- - - - - -13]。先前的研究已经涉及罕见变异在哮喘和哮喘相关的特征的相关基因(14,15),这表明罕见变异可能在哮喘易感性确实发挥了重要作用。
17号染色体是第一个对方篮里哮喘易感性位点发现了全基因组关联研究(GWAS) (10,14,16- - - - - -19]。然而,没有一个基因位点内曾参与哮喘发病机理。snp in17q21展示非常重要对儿童哮喘与ORMDL3成绩单的表达,表明ORMDL3基因是一个似是而非的哮喘的候选人在轨迹1]。后来,allele-specific其他基因的基因表达也观察到17轨迹(对方篮里20.]。
至少有12 GWAS的哮喘,产生了无数的联想,与最重要的(在大多数情况下复制)关联发生在或接近以下基因:ORMDL3 [1,2],PDE4D [21],HLADRB1 [2],hla dq [2,3],RAD50-IL13 [3],DENND1B [4],TLE4 [5],SMAD3 [2],IL1RL1 [22],IL18R1 [2],IL33 [2],IL2RB [2],RORA基因[2],SLC22A5 [2]。这些研究结果极大地扩展我们对疾病的理解,确定了小说的几个基因位点此前从未参与哮喘的发病机制(如ORMDL3, RAD50 DENND1B, TLE4)。尽管取得了这些成就,没有明确的因果变异已确定这些基因。有人主张相关的变异与因果LD在这些基因变异,但必须做出更多的努力来识别因果变异,因此这些基因的生物学在哮喘的病因可以更好地理解。
尽管GWAS的成功识别复杂疾病相关的遗传变异和超过1000的研究在过去的几年中进行识别的遗传复杂性许多免疫疾病包括哮喘,这种方法仍然做了一定程度的遗传性哮喘的临床预测表型遗传和免疫通路(23]。
本研究旨在揭示了遗传因素对小儿哮喘在沙特阿拉伯使用全外显子组测序技术,评估结果与类似的国际研究。
2。材料和方法
2.1。招聘的小儿哮喘患者群
七十九儿童纳入本研究最初选择儿科过敏反应和免疫学的诊所,孕妇儿童医院麦加,哪些国家,2014年1月至2015年10月。后所有的孩子被诊断出患有哮喘临床评价除了生理评估包括肺功能测试(击球)和使用国际儿童哮喘和过敏的研究(ISAAC)问卷(人口)修改(注意,击球时没有考虑年轻的时候谁没能正确地执行测试)。他们是5至14岁的时候招聘。参加父母的书面知情同意了所有的孩子。在最初的招聘面试,临床数据和静脉血液样本的全血(3毫升CBC和DNA提取和3毫升血浆分离)被收集。
额外的综合临床数据从他们的医疗记录中提取他们的同意。对于每个病人,收集的信息包括性别、出生日期和初始诊断、实验室调查,生理评估、疾病史、父母的历史对于任何和/或其他自身免疫性疾病,过敏药物历史(使用类固醇、免疫调制剂和生物疗法),和历史的潜在过敏原如地毯、植物、动物和/或曝光。
2.2。选择全外显子组样本的分析
九个哮喘病人提交门店招募基于临床评价和表型使用以下标准:(我)全球倡议对哮喘(吉娜)指南24)除了使用国际儿童哮喘和过敏的研究(ISAAC)问卷(招募病人修改)作为初始标识使用的药物与注意事项(β受体激动剂和类固醇)(2)历史的呼吸道症状,如呼吸急促,胸闷、气喘、咳嗽,不同强度随着时间的推移,以及变量呼气气流限制(3)生理测试包括击球和肺量测定法测量(iv)只有患者不记录任何其他过敏症状如皮肤或食品allergy-who提交全外显子组测序(见(表1))
本研究将延长执行所有选定的病人多用于测量确定变异的发生率。
2.3。DNA提取
基因组DNA提取EDTA实际上外周静脉血样使用旋转列方法使用推荐的应用生物系统DNA提取工具(目录编号:K182001)。所有基因组DNA量化使用Nano-Drop 2000分光光度计(热费希尔科学)。DNA质量评估的260/280比例(1.8 - -2.0)。为图书馆准备,DNA测定再次使用量子位(表达载体)荧光计,调整所有样本100 ng同样(浓度高于50 ng /接受μl)。然后,图书馆是纯化使用磁板,随后量化使用离子库TaqMan实时PCR定量工具。
2.4。全外显子组测序
全外显子组测序了九个病人的DNA样本使用离子激流技术(热费希尔科学)。图书馆准备后,协议中描述离子AmpliSeq外显子组RDY图书馆准备用户指南(出版MAN0010084)使用离子AmpliSeq图书馆装备+(猫。不,4488990)。一百毫微克的基因组DNA与离子AmpliSeq图书馆准备使用外显子组1×8 (Cat RDY工具包。不。A38262);然后,图书馆是纯化使用磁板和随后量化使用离子库TaqMan定量组件(部件编号4468802)和实时PCR仪7500快(生活技术,美国)。每个样本都被分配一个不同的条码使用IonXpress条形码适配器1 - 16工具包(猫。不,4471250)。编码库被稀释至100点; three libraries were pooled and subjected to template preparation on Ion Sphere Particles (ISP) using the Ion OneTouch 2 System and the Ion PI Template OT2 Hi-Q Kit. Each templated ISP was loaded on the Ion PI v3 chip and sequenced on the Ion Proton instrument (Life Technologies, USA) using Ion PI Hi-Q sequencing Kit. Base calling and alignment were performed on a Torrent Suite v4.2 Server.
2.5。信息化分析
过滤低质量读取和删除适配器被对齐之后对人类参考基因组(hg19构建)。GATK v3.7 [25)是用来调用单核苷酸多态性和短indels multisample VCF文件。GATK v3.7变体质量分数调整(VQSR)应用于数据集。注释使用AnnoVar[执行26]RefSeq记录的数据库(27),外显子组聚合联盟(ExAC) (28]和致病性分数包括排序不能容忍宽容(筛选)29日,PhyloP Phast缺点(30.),基因进化速率分析(GERP + +)31日),并结合注释依赖损耗(CADD) [32]。
验证BamID v1.1.13软件被用来估计可能的污染,和一个“自由组合”值阈值0.02的应用(33]。基因覆盖决心使用SAM工具v1.3.1 [34]和床上工具v2.17.0 [35]。变异与GATK质量分数调整(VQSR)笔> 99%被排除在外。同义变异和变异被发现 也被排除在分析之外。变体被破坏致病性分数优先( , (36),而 )。
2.6。选择一组已知的哮喘目标基因
GWAS目录中所有研究与“哮喘”作为表型或关键字综述了直到2017年3月28日,研究确定哮喘易感性变体,包括儿科受试者识别和检索的重要的位点。这之后,添加附加16基因从四个研究后手工文献之回顾。的研究导致了候选基因列表(见补充表33)。131年共有20个位点包括潜在候选基因分析其中110个基因都淹没了。
3所示。结果
八个样本验证BamIDf混音值低于0.02阈值,不显示大量的污染水平。一个样本(主题9)显示污染的证据,被排除在进一步分析。最低平均阅读的深度是47.7 x,最小覆盖在10倍深度为86.6%在8个样本(补充表23)。
共有8个学科,21个变量被确定后筛选潜在的功能,其中13之前被确认dbSNP和小说(表82)。19的21个变量非同义和2是无稽之谈(停止获得)。2 dbSNP 13中产生的变异,变异之前进行了研究。据报道,rs3923647与Th1细胞因子的增加产量,干扰素-γ2、卡介苗接种后(37]。rs16889462变体是SLC30A8基因编码的识别和报告的许多功能T2D病理生理学包括T2D的降低风险的降低SLC30A8基因活动(38]。关于这部小说变异,PRKG1 2产生变异的基因(54041969和54041969)中4例(1、3、4、5),和小牛基因产生的变体(3842992)被确认在3例(4、5、9)。
4所示。讨论
这份报告描述了第一个研究的结果外显子组测序在沙特的孩子被诊断为哮喘。外显子组测序的八个孩子在这个研究已经确定了21个潜在有害的SNPs知道哮喘的基因;其中,8个小说变异和13之前存入dbSNP变体。
在这项研究中,基因协会并不重复所选样本,因为这项研究并没有设计成基于家庭的研究。我们的研究提出了对第一次KSA-the与哮喘相关的基因变异,主要是发展儿童年龄在麦加地区通过一个大的哮喘GWAS队列研究,认识到可能的遗传原因,可能与哮喘和也提出相关的生物学途径,在哮喘的发病机制中发挥作用。使用先进的过滤和注释程序,导致变异减少到只有28日10日候选基因变异位点与儿童疾病有关。
1号染色体上的三个基因变异被发现在三个不同的样本(病例中3、4、7)和两个新颖的变体。之前报道,rs147827524 pyrin和欣域家庭成员1基因编码(PYHIN1)已经占HIN200蛋白质,主要是核蛋白质参与转录调节基因的重要的细胞周期控制,分化,细胞凋亡除了惊人的哮喘风险的大部分在非洲血统的人39]。这两个小说snp被发现后,rs152488110 rs180651520,编码为cysteine-rich c端1基因(CRCT1)和嗜异性和多变的逆转录病毒受体1基因(XPR1),分别。CRCT1 SNP位于附近的外显子基因和许多地区产生的SNP。因此,我们认为这将是无意义的影响蛋白质的功能。然而,第二个变种,XPR1,已经提到了扮演一个角色在调节人类气管平滑肌收缩(ASM),细胞生长,促进支气管狭窄和促炎细胞因子的生产,在哮喘气道炎症和重塑(40]。2号染色体上,只有一个变种被确认之前,据报道,rs184451758, tensin 1基因编码(TNS-1)的基因基本上占myofibroblast分化和细胞外基质的形成。据报道基因的多态性与慢性阻塞性肺病完整形式的风险显著相关(41]。4号染色体上的三个多态性变异,一个之前报道,rs3923647,编码,toll样receptors1 (TLR1)多态性似乎扮演一个角色对哮喘、过敏性湿疹,过敏性鼻炎42]。另外两个多态性,rs745975778 rs61529635,据报道同样的基因,synaptopodin 2 (SYNPO2),据报道,与一个独立的哮喘病患者的血清总IgE,显示角色这个基因在哮喘43]。6号染色体上的两个按顺序关闭小说变异,rs32946010 rs32946011,编码为同一基因转录因子元素,bromodomain (BRD2),位于外显子8(12个基因外显子)调节转录的蛋白质已被证明,特别是在细胞周期转录激活。据报道最近BRD2蛋白抑制变弱neutrophil-dominant过敏性气道疾病小鼠模型(44]。8号染色体上的一个产生的多态性变异被发现,rs16889462,据报道之前编码流出锌转运蛋白之一,溶质载体家庭30 8 (SLC30A8)成员,被归类为一个主要组件提供锌胰岛素分泌胰腺的成熟和/或存储过程β肽。五个全基因组关联研究(GWAS)确定SLC30A8多态性rs13266634亚洲和欧洲但不是非洲人群(45]。9号染色体上,只有一个多态性被报道,rs35642290,编码细胞骨架蛋白,蛋白1 (TLN-1),这被认为是其中一个基因可能与总IgE哮喘病患者(46]。10号染色体上,令人惊讶的是,三个相同基因的变异被发现包括一个之前报道SNP和两个连续的小说,rs54041969 rs54041970,识别出50%的样品(例1,3,4,5)位于外显子14(18个基因外显子报道)。所有三个变体编码相同的蛋白激酶c GMP-dependent 1基因(PRKG-1)。所有关键PRKG蛋白亚型充当调解人的一氧化氮/环鸟苷酸信号通路和许多信号转导过程的重要组成部分在不同的细胞类型47]。据报道,哮喘是通常与高水平的呼出一氧化氮(NO)减少S-nitrosothiols的正常水平,作为一个在气道(支气管扩张剂47]。
12号染色体上的一个之前报道的SNP, rs747186265,发现只有一个样本(箱号6)编码otogelin-like基因/蛋白质,一直占据在脊椎动物的内耳表达水平最高的表达在胚胎阶段。没有明显的耳朵并发症都记录了那个孩子在我们的研究中。我们假设这个变量没有显著参与哮喘的病理生理学的发展。同时,我们假设这个SNP不影响蛋白质的结构和功能即使是分为产生、和/或我们建议进行进一步的研究,这些特定的SNP的效果。19号染色体上的四个多态性被确定在我们的研究包括两个之前报道的单核苷酸多态性,rs142299823 rs74939505,编码为锌指蛋白基因家族,ZNF30 ZNF154,分别参与DNA结合转录因子的活动的过程。此外,两个小说变异被确定在两个孩子分析(例4和5),产生的(rs7267725)和停止(rs7267726)。变异都是编码的胰岛素受体(INSR)基因区域,联想到与哮喘相关的风险(48]。20号染色体上,只有一个产生之前报道的变体,rs779234123,发现三个样本(病例4、5、8)编码线粒体antiviral-signaling基因(小牛),该表达蛋白激酶活动所需的蛋白质基因表达是至关重要的。受损的抗病毒干扰素表达可能参与哮喘发作通常由鼻病毒感染引起的哮喘病人(49]。
大量的遗传和分子领域的研究已经进行了哮喘的儿童和成人之前(50- - - - - -60]。基因研究中,外显子组/ NG测序研究已经记录在整个全球人口(61年,62年]。确认观测以及遗传结论证实哮喘病人的吸引力的遗传易感性因素。可能是基因和nongenetic小说和记录变种可能发挥重要作用在沙特哮喘病人。然而,有限的病人的数量和失踪的筛查小说变异呈现出本研究的限制。
不仅遗传因素,而且环境、种族和民族因素与哮喘相关的病因;此外,饮食因素可能有一个活跃的和直接影响哮喘症状(63年- - - - - -65年]。哮喘可以接触引发了许多环境因素(66年]。过敏性哮喘是由过敏原引起的像宠物毛屑、害虫、尘螨和霉菌比nonallergic哮喘儿童更为常见。Nonallergic哮喘可能由于某些因素如病毒、焦虑、压力、寒冷或干燥的空气,吸烟。过敏性哮喘的发病率是最高的童年,虽然nonallergic哮喘的发病率高峰在成年晚期67年]。据报道,美国黑人和拉丁裔人更容易受到哮喘,和这个类别中的发病率高68年,69年]。生活在单亲家庭的儿童可能诊断为两倍相比,孩子的已婚父母(70年]。然而,据我们所知,这些因素是如何贡献在阿拉伯人口哮喘的病因尚未完全理解,因为有限的研究有关于这种疾病来自中东国家。
4.1。研究的优点和局限性
这项研究的结果是独一无二的基因分析的哮喘患儿在沙特阿拉伯,识别小说产生的多态性可能与严重的儿童哮喘和弱对治疗的反应。本研究将成为未来研究的基础上,将档案和诊断的目的。
本研究在样本大小也有限制。虽然我们最初招募了79例哮喘在这项研究中,由于预算限制,我们能做的只有9例全外显子组测序分析。这项研究有一个有限数量的患者将受益于更大的样本量和可能与遗传资料在不同的国家。
5。结论
总之,这是最初的外显子组测序研究实现在沙特的孩子患有哮喘。基于早期研究结果我们发现在这项研究中,我们假设基因变异可能发挥作用的敏感性增加哮喘的发展。其他变异出现在本研究无法避免考虑到大量的位点及其特定的遗传疾病在全球人口中所涉及的角色。未来的研究建议对小说变异筛选更多的病人在沙特人口排除在哮喘疾病中的作用。
缩写
| 背景: | 脱氧核糖核酸 |
| EDTA: | 乙二胺四乙酸 |
| SNP: | 单核苷酸多态性 |
| 质量控制: | 质量控制 |
| 籍: | 沙特阿拉伯王国。 |
数据可用性
数据提供的补充材料。
伦理批准
本研究通过两个医学院的医学伦理委员会,嗯Al Qura大学(伦理批准证书号18过时8/2/1435H)和道德和医学研究委员会的孕妇和儿童医院麦加(合格证47/25/107862过时11/12/2013)。
的利益冲突
所有调查都没有从属关系或参与任何组织或实体与任何经济利益或非金融利益(如个人或职业关系、从属关系、知识或信仰)在讨论的主题或材料在这个手稿。
作者的贡献
Neda m . Bogari和艾哈迈德Abdelmotelb负责概念化。Husni h·雷策划数据。Neda m . Bogari收购资金。Husni h·雷和Amr a阿明做了调查。Mohiuddin m·塔希尔Amr a·阿明,胡斯尼El-Rayes负责的方法。Neda m . Bogari负责资源。约翰·w·霍洛威学院和Neda m . Bogari监督。奥格尔曼卢克和Neda m . Bogari分析数据。Amr阿明和Husni h·雷写了初稿。Amr a·阿明Abdellatif Bouazzaoui,费萨尔a Al-Allaf审查和编辑。 Neda M. Bogari, Amr A. Amin, and John W. Holloway did the validation.
确认
作者要感谢院长以来嗯Al-Qura大学科学研究支持这项工作由格兰特20 uqu0069dsr代码。我们感谢艾哈迈德Shawky博士和科技人员的科研单位(STU)和院长职Umm-Al-Qura大学麦加,他们持续的支持。作者也承认Abdulmoniem先生的支持高达和默罕默德先生Adil海湾生物系统集成以及Muhmmed努尔博士和先生根据Abdulraof a Khogeer从生物化学系,嗯Al-Qura大学麦加,哪些国家。
补充材料
补充1。表1 - 3:意思是深度,覆盖在目标地区的10倍深度和VerifyBamID freemix为每个样本值。
补充2。表2 - 3:基因覆盖107个基因从哮喘基因面板。
补充3。表3 - 3:选择列表基因与哮喘有关。