异常Hypermethylation-Mediated抑制前列腺癌PYCARD极其频繁的格里森评分≥7

文摘

表观遗传基因沉默异常的DNA甲基化导致损失的关键细胞通路在肿瘤发生。为了分析前列腺癌DNA甲基化的影响,我们建立了LNCaP-derived人类前列腺癌细胞可以药物诱发全球复活hypermethylated methyl-CpG目标基因的转录激活(元)方法。元压制LNCaP-derived细胞的生长,诱导细胞凋亡。微阵列分析表明PYCARD(PYD和卡域包含)编码的凋亡诱导因子是调节治疗元后65倍或更多。我们分析了DNA甲基化状态使用50 microdissected原发性前列腺癌组织和发现一个极高频的肿瘤特异性启动子甲基化的PYCARD(90%,45/50)。此外,DNA甲基化状态与格里森评分显著相关( );肿瘤特异性甲基化的频率为96%(44/46)和格里森肿瘤 ,而在肿瘤格里森评分6 25% (1/4)。免疫组织化学分析使用这些50例表明只有8%(4/50)的癌组织表达PYCARD,而80%(40/50)的相应正常前列腺上皮和/或PYCARD基底细胞表达。此外,没有关系PYCARD疣状和格里森评分在癌组织和周围的正常组织。诱导表达PYCARD抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。这些结果表明,异常甲基化PYCARD是一个独特的特性和格里森的前列腺癌吗 并可能发挥重要作用在前列腺肿瘤发生的逃避凋亡。

1。介绍

癌细胞获得恶性肿瘤的特征通过连续畸变控制系统生长抑制增殖信号,细胞能量,细胞死亡,基因组稳定、血管生成、侵袭和转移,肿瘤促进炎症反应,不灭,和对免疫系统的反应1]。癌细胞获得这些特征和稳定传播他们的女儿细胞,主要通过遗传和表观遗传变化(2]。DNA甲基化和组蛋白的化学修饰特定形式的两个主要机制在表观遗传转录控制。其中,异常的DNA甲基化在基因的启动子区域甲基化或hypomethylation是其中一个最明确的癌症细胞的表观遗传变异和与不恰当的某些基因的表达3,4]。常见的异常甲基化的基因主要在启动子区域有被描述到目前为止,但每一个启动子甲基化之间的关系及其对肿瘤发生的贡献仍有待阐明。

对于男人来说,前列腺癌是第二个最常见的癌症,全世界癌症死亡的第五大原因5]。强烈的研究探讨原发性前列腺癌的分子基础和发现多个基因和表观遗传改变6]。前列腺癌最常见的改变是融合的5未翻译的TMPRSS2,雄激素调节丝氨酸蛋白酶基因的致癌ETS家族转录因子ERG或ETV1(7),最常见的突变基因SPOP,TP53,FOXA1,PTEN(8]。虽然在前列腺癌已经广泛探索表观遗传变化,这些变化的意义仍然是难以捉摸的。谷胱甘肽S-transferaseπ1 (问题)是most-characterized hypermethylated基因在前列腺癌(9];它编码一种解毒作用的酶活性亲电中间体(10]。启动子hypermethylation-mediated沉默的问题只有在上皮内瘤发现,前列腺腺癌,液体(血浆、血清、精液和尿液)患者的前列腺癌,但从未发现良性上皮(9,11- - - - - -13]。虽然问题有这样有前途的功能作为一个癌症特异性生物标志物,它尚未应用于临床;虽然特异性问题启动子甲基化远高于前列腺特异性抗原(PSA)的敏感性问题低于PSA (14]。此外,问题没有函数作为一个肿瘤抑制基因在使用LNCaP前列腺癌细胞在体外和在活的有机体内(15]。因此,确定一种新型生物标志物与更高的特异性和敏感性前列腺癌的早期诊断和预后仍然是等待。

在目前的研究中,我们第一次试图阐明表观遗传沉默在前列腺癌的生物学意义,然后发现hypermethylated基因前列腺肿瘤发生中扮演很重要的角色,运用我们之前开发的方法称为methyl-CpG目标转录激活(元)16- - - - - -19]。元可以在全球范围内重新激活hypermethylated基因包括转录沉默癌症相关基因。细胞系LNCaP作为代表的前列腺癌。因为芯片加上元(MeTA-array)可以搜索hypermethylated基因利用完全不同的机制从DNA脱甲基基于代理的方法,它使我们能够推出未被发现hypermethylated基因。

在目前的研究中,我们确定PYCARDDNA hypermethylation-mediated沉默基因,在细胞生长抑制起着关键作用,主要是通过诱导细胞凋亡。异常的启动子甲基化的PYCARD随着stage-specific的方式观察抑制蛋白表达在绝大多数前列腺癌标本。

2。材料和方法

2.1。菌株和质粒

大肠杆菌应变DH5αF被用来传播所有的质粒。pcDNA6 / TR质粒表达载体,卡尔斯巴德、钙、美国)被用来建立稳定表达的细胞株春节阻遏。允许tetracycline-regulated表达式,我们使用三个结构。一个包含一个0.9 kb NF的片段κB(广告)-MBD 3 xflag标签的n端(16克隆到的)生态RI /Xho我网站pcDNA4 / / myc-His向量(表达载体)和命名为pcDNA4 / / NFκB -MBD(广告)。其他两个构造包含cDNA片段对应整个编码区域PYCARD变体1和2,0.61 kb的片段PYCARDv1和0.56 kb的片段PYCARDv2。这两个片段克隆到欣dIII /Xba我网站pcDNA4 / / myc-His向量和命名为pcDNA4 / / PYCARDv1和pcDNA4 / / PYCARDv2,分别。我们PCR放大这两个变种cDNA片段使用汇集人类cDNA混合[20.)作为模板。核苷酸序列的引物用于cDNA克隆中描述表S1。

2.2。细胞培养、转染和免疫印迹

人类前列腺癌细胞系LNCaP和正常前列腺上皮细胞系RWPE-1从美国购买类型文化集合(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。LNCaP细胞生长在rpmi - 1640中(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)补充10%胎牛血清(表达载体),和RWPE-1细胞生长在角化细胞无血清培养基补充牛脑垂体提取物和重组人表皮生长因子(表达载体)。春节阻遏细胞建立了稳定转染pcDNA6 / TR LNCaP质粒,如前所述[20.),分别被命名为TR9和TR15。然后,pcDNA4 / / NFκB(广告)-MBD稳定转染成TR9或TR15细胞获得TR9_MeTA14和TR15_MeTA5细胞。pcDNA4 / / PYCARDv1或pcDNA4 / / PYCARDv2转染到TR15细胞建立稳定转染子tetracycline-regulated PYCARD-expressing细胞。空pcDNA4 / / myc-His向量也稳定转染到TR15细胞建立控制TR15_Vec细胞。所有这些细胞系都维护在rpmi - 1640中包含7.5μg / ml杀稻瘟菌素和500年μ克/毫升zeocin。免疫印迹分析如前所述[21]。一个抗体标记(F 1804;1:1000年,Sigma-Aldrich)、PYCARD (D086-3;1:1000年,MBL,名古屋,日本),或β肌动蛋白(a - 5441;1:3000年,Sigma-Aldrich)使用。

2.3。一(rt - pcr)

从提取细胞总rna提取小球由RNeasy迷你包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)。每一个整除2μg总RNA的反向转录,单链cDNA使用高容量cDNA逆转录合成装备(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。使用intron-spanning rt - pcr扩增引物进行描述(22),而B2M作为内部控制(23]。PCR分析了产品3%琼脂糖凝胶,用溴化乙锭染色和乐队。DNA引物是购自集成技术(美国IA珊瑚镇),和他们的核苷酸序列如表所示S1。

2.4。细胞增殖实验

细胞被播种在24-well盘子的密度 细胞每在第一天,试验开始在天0。第一次试验后,细胞治疗有或没有1μg / ml四环素为2、4、6天。细胞生存能力是决定每隔一天用alamarBlue(英杰公司)如前所述24]。实验一式四份,重复三次。

2.5。细胞周期分析

细胞被播种在10厘米的菜肴,有或没有治疗1μg / ml四环素为2、4、6天。Tetracycline-containing介质是每隔一天更换一次。细胞周期分布的样本由流仪结果(FACSCanto II;美国加利福尼亚州圣何塞BD生物科学,)如前所述25]。

2.6。末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)测定

凋亡细胞被量化使用细胞凋亡原位和光,检测设备(kouichi大阪,日本)。细胞与0.1%柠檬酸钠和0.1% permeabilized Triton x - 100在冰上2分钟。dna与末端转移酶标记,内在的过氧化物酶灭活与3% H₂O₂。最后,细胞被孵化peroxidase-conjugated抗体。过氧化物酶活性在每个样本应用程序可视化的轻拍(3 3 - - - - - -diaminobenzidine tetrahydrochlorideσ)。

2.7。微阵列分析

根据前面描述的方法(微阵列分析18]。从TR9_MeTA14和TR15_MeTA5细胞总rna有或没有四环素治疗4天准备,和Cy3-labeled cRNA杂化是一个安捷伦整体人类基因微阵列( K)。2倍upregulation受雇的截止值选择的基因。

2.8。亚硫酸氢钠测序

我们进行基因组dna的亚硫酸氢钠修改RWPE-1或TR9_MeTA14 TR15_MeTA5细胞有或没有四环素治疗4天使用亚硫酸氢EpiTect工具包(试剂盒)和测序的启动子区域PYCARD和TNFRSF25基因ABI棱镜310音序器BigDye终结者v3.1循环测序工具包(应用生物系统公司)。引物用于亚硫酸氢钠测序分析中描述表S1。

2.9。免疫荧光染色

TR15_PYCARD细胞有或没有四环素治疗两天洗了PBS,固定和孵化兔子反TMS1抗体(EU107, 1: 1000)26]。间接检测抗体主要是通过60分钟孵化1:1000稀释二次抗体:Cy3-labeled山羊anti-rabbit免疫球蛋白(Abcam ab6939)。0.5细胞被染了10分钟了μ4克/毫升 ,6 - - - - - -diamidino-2-phenylindole (DAPI)。图片是如前所述[20.]。

2.10。组织标本

共有50个前列腺癌组织从患者获得根治性前列腺切除术在东北大学医院(宫城县仙台日本)从2008年到2011年期间进行了分析。都是亚洲人。没有人接受放疗、化疗或手术前雄激素剥夺疗法。生化复发被定义为术后PSA 最低点PSA ng / ml ng / ml。石蜡包埋组织标本formalin-fixed (FFPE),和评估通过苏木精和伊红染色(他)。组织病理学诊断证实的病理学家授权的日本社会病理学(y),和分类的分期是根据国际癌症控制联盟(UICC) TNM分期系统。前列腺癌患者的临床和组织病理学特点归纳在表格1。从所有的病人获得书面知情同意。本研究经伦理委员会批准加入东北大学医学院的2015-1-475和2015-1-475的数量。

2.11。激光显微解剖(LMD)和Methylation-Specific聚合酶链反应(MSP)

FFPE部分(10μ2.0米厚)是准备和安装在μ米厚的钢笔膜幻灯片(MicroDissect GmbH, Herborn,德国)。部分deparaffinized,然后沾他的一节评估所需的形态质量准确的显微解剖。其他部分与苏木精染色认识到细胞核。小心干燥后,癌和良性前列腺细胞(~ 15毫米²)分别收集到200年的上限μl PCR管使用徕卡LMD7000(徕卡Microsystems GmbH是一家位于德国)。

DNA从microdissected FFPE样本直接bisulfite-treated使用亚硫酸氢EpiTect快速DNA工具包(试剂盒)。MSP的分析PYCARD与表中描述的引物进行S1。PCR进行了40周期30年代在94°C, 30年代在68°C (unmethylated引物)或30年代在70°C(甲基化引物)和30年代在72°C。甲基化和unmethylated带强度被ImageJ量化软件(马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院、美国)(27),每个methylated-to-unmethylated比例计算;双重的或更高的水平相比,肿瘤与相应的正常样本定义为肿瘤特异性甲基化。每个PCR产品装上4%琼脂糖凝胶,溴化乙锭染色可视化。

2.12。免疫组织化学

Four-micrometer滑动部分准备,deparaffinized二甲苯,在乙醇脱水。像之前描述的那样进行免疫组织化学(28)使用兔子反TMS1抗体(EU107, 1: 1000)。免疫反应性评价两个病理学家授权的日本社会病理学(y和AG)没有任何有关病人的信息。在这项研究中,彩色肿瘤细胞10%以上和50%以上的免疫反应性细胞质或细胞核被归类为阳性(+),双阳性(+ +),分别;肿瘤较低的百分比被归类为负(-)。

2.13。统计分析

确切概率法是用于甲基化状态或疣状之间的关联PYCARD和临床病理的参数。小动物——一张长有学生 - - - - - -测试是用于甲基化状态之间的联系或疣状PYCARD和PSA。用于评估kaplan - meier分析和生存率较生化recurrence-free生存患者之间的差异,没有肿瘤特异性PYCARD甲基化或PYCARD蛋白表达。小于0.05的值被认为是重要的。所有分析使用人民币(SAS研究所卡里、数控、美国)。

3所示。结果

3.1。NFκB(广告)-MBD诱导显著抑制细胞生长,诱导细胞凋亡

探索通过重新激活hypermethylation-mediated灭活基因表型的改变,我们首先构造tetracycline-regulated NFκB(广告)-MBD-inducible细胞系使用前列腺癌症细胞系LNCaP和一个两步过程。首先,pcDNA6 / TR引入建立两个春节阻遏细胞称为TR9和TR15。然后,pcDNA4 / / NFκB(广告)-MBD n端(国旗标签)介绍了建立两个稳定的细胞系称为TR9_MeTA14和TR15_MeTA5。显示在图S1使用anti-FLAG抗体,免疫印迹分析表明tetracycline-induced NFκB(广告)-MBD TR9_MeTA14和TR15_MeTA5细胞蛋白表达检测感应后直到6天。换句话说,诱导元是有效至少6天。

全球复活hypermethylated基因可能影响肿瘤细胞的生长。我们下一个使用一个alamarBlue化验检查我们的细胞增殖能力建立NF LNCaP-derived细胞反应κB(广告)-MBD感应(图1(一))。春节repressor-expressing父母的细胞系,TR9 TR15,没有任何增长差异无论四环素治疗。另一方面,NFκB(广告)-MBD-inducible细胞系TR9_MeTA14和TR15_MeTA5显著增长抑制四环素加法后4 - 6天。有趣的是,我们观察到细胞收缩和固缩在tetracycline-treated TR9_MeTA14 TR15_MeTA5细胞(数据未显示);这些特征是典型的凋亡细胞。然后我们进行流式细胞术分析如图1 (b);sub-G1分数TR9和TR15四环素前后没有变化,而sub-G1分数TR9_MeTA14和TR15_MeTA5细胞进一步增加四环素加法后,逐步增加随着时间的推移,这表明G1, G2 / M期细胞随时间逐渐下降。TUNEL分析添加和支持诱导细胞凋亡的结果与流式细胞仪(图1 (c))。一些具体的和强烈的信号代表观察凋亡细胞只在细胞治疗四环素:没有这样的观察是在那些没有明显四环素。这些结果表明,细胞凋亡,随之引起的生长抑制NFκB(广告)-MBD融合蛋白。换句话说,在LNCaP元诱导细胞凋亡。

3.2。NFκB(广告)-MBD诱导上调一些凋亡诱导基因的表达

然后我们探讨hypermethylated在细胞凋亡基因微阵列加上元,称为MeTA-array [19]。TR9_MeTA14 TR15_MeTA5细胞有或没有使用四环素,和结果总结在表2。由以下五个候选基因选择标准:(1)两个或多个upregulation TR9_MeTA14和TR15_MeTA5四环素诱导的细胞和(2)基因参与细胞凋亡诱导。所有五个基因包含CpG岛(cgi)在±1000 bp的转录起始站点(TSS),这表明这些基因的启动子区域可能代表元的目标。因为PYCARD和TNFRSF25是调节10倍或更多TR9_MeTA14和TR15_MeTA5细胞,我们进一步分析了这两个基因。如图1 (d),rt - pcr分析表明,两者兼而有之PYCARD和TNFRSF25实际上是调节在四环素的存在。PYCARD有两个剪接变体,PYCARDv1和PYCARDv2外显子2的,后者窝藏在坐标系删除编码一段19个氨基酸共享相同的启动子。这两个PYCARDv1和PYCARDv2包含功能PYD和卡域。这两个PYCARD变体被四环素除了调节类似。亚硫酸氢基因组测序还证实hypermethylated推动者PYCARD和TNFRSF25在(图S2)不管四环素治疗TR9_MeTA14和TR15_MeTA5细胞。这些测序结果示意图总结在图1 (e)。值得注意的是,启动子区域PYCARD在RWPE-1 unmethylated nontumorigenic前列腺上皮细胞系,但TNFRSF25表明甲基化。基于这些结果,我们关注PYCARD作进一步鉴定。

3.3。肿瘤特异性的甲基化PYCARD启动子和格里森频繁在前列腺癌

接下来我们分析启动子区域的甲基化状态PYCARD原发性前列腺癌标本。结果使用50 dna配对癌和相应的正常前列腺组织图所示2(一个)和总结在表S2。异常甲基化的PYCARD检测肿瘤特异性的方式在90% (45/50);这些结果表明的异常甲基化PYCARD启动子是频繁的原发性前列腺癌。因此,之间的关系PYCARD启动子甲基化和格里森评分等临床病理参数T阶段,lymphovascular入侵,PSA值进行了分析(表1)。有趣的是,甲基化状态PYCARD启动子与格里森评分显著相关( )或年级组( ):前列腺癌与格里森 (年级 )但不是格里森评分6(组1级)显示肿瘤特异性甲基化(格里森 :96%,44/46,格里森评分6:25%,1/4)。然后将患者格里森评分7分成格里森评分 (组2)级和格里森评分 (年级组3)因为患者格里森评分 已经知道有更好的预后比格里森评分吗 患者格里森评分7 (29日]。我们检查了年级组3和2之间的联系PYCARD甲基化状态,但没有发现明显的关联( )。手术后的患者死亡。因此,无论存活率是100%PYCARD基因的表达。此外,PYCARD甲基化与PSA recurrence-free生存没有任何关系(图S3)。

3.4。免疫组织化学分析显示PYCARD蛋白质的损失在大多数主要的前列腺癌

我们首先分析了PYCARD蛋白的表达在正常前列腺上皮细胞系RWPE-1前列腺癌和三个细胞系,LNCaP, du - 145、曲泽(图S4)。RWPE-1显示强烈的PYCARD乐队,而失去了PYCARD LNCaP和du - 145细胞蛋白质表达和曲泽显示微弱的乐队。这些结果表明,PYCARD表达式是抑制前列腺癌细胞系。因此,我们接下来进行免疫组织化学分析FFPE部分来自50个前列腺癌患者使用anti-PYCARD抗体看到PYCARD蛋白表达。结果总结在表S2。在大多数的主要前列腺癌标本(72%,36/50),PYCARD蛋白表达在正常上皮和/或基底细胞,但不是在肿瘤细胞。四个病人显示积极的疣状癌和正常细胞,但正常细胞染色更强烈的肿瘤细胞在3 4例。PYCARD组织化学染色,在剩下的10个前列腺癌标本是负的正常和肿瘤细胞。代表结果,免疫组织化学染色如图2 (b),结果在图进行了总结2 (c)。这些结果表明,PYCARD表达强烈抑制肿瘤细胞在大多数情况下,但的状态PYCARD启动子甲基化并非完全一致的状态PYCARD表达式。这种状态可能是管制不仅由异常的DNA甲基化,而且其他未知的机制。此外,我们分析了PYCARD表达与临床病理参数之间的关系,但我们可以不遵守任何协会(表1)。

3.5。PYCARD作为细胞凋亡诱导因素的作用

为了研究PYCARD在前列腺癌细胞的生物学意义,我们首先转染PYCARDv1表达向量到TR15生产tetracycline-regulated PYCARDv1-inducible细胞。稳定转染细胞系的混合物称为TR15_PYCARD成立。使用这个TR15_PYCARD代表免疫印迹和免疫荧光分析的结果在第二天图所示3(一个)和3 (b)。表示PYCARD蛋白质形式speck-like蛋白质复合物。然后,alamarBlue化验有或没有使用TR15_PYCARD四环素诱导进行(图3 (c));感应的PYCARD引起显著的增长抑制4和6天之后四环素。相比之下,empty-vector稳定转染细胞系TR15称为TR15_Vec没有造成任何增长抑制不论四环素治疗(图3 (c))。我们接下来进行流式细胞仪分析TR15_PYCARD是否抑制增长PYCARD诱导细胞周期的影响。结果流式细胞术分析TR15_PYCARD如图3 (d);sub-G1分数TR15_PYCARD增加早在两天后四环素随着时间的推移,逐渐增加更多,但在TR15_Vec没有观察到这种变化。我们还建立了一个PYCARDv2诱导稳定转染细胞系混合物和做了相同的实验;结果从那些没有本质上揭示任何差异PYCARDv1 -转染TR15_PYCARD(数据没有显示)。

4所示。讨论

Apoptosis-mediated程序性细胞死亡作为天然屏障恶性病变的发生和发展。因此,收购的能力逃脱这些机制是癌症的一个主要特征(1]。肿瘤细胞使用多种策略来限制或绕过细胞凋亡。他们可能会通过增加凋亡实现这一监管机构和生存信号,通过减少proapoptotic因素,或逃避ligand-induced死亡通路。最常见的策略是TP53功能的障碍;大约一半的癌症有灭活突变的肿瘤抑制基因。

在这项研究中,我们寻找致病基因,诱导细胞凋亡LNCaP前列腺癌细胞逐MeTA-mediated全球hypermethylated基因的激活;我们确定了五个候选人凋亡诱导基因表中列出2。在这其中,PYCARD被选作进一步鉴定。PYCARD,也称为ASC或TMS1介导大信号复合物的组装炎症和凋亡信号通路通过半胱天冬酶的激活30.];异常的启动子区域甲基化已在前列腺癌和许多肿瘤包括癌症乳腺癌、肺癌、肾、以及黑色素瘤和胶质母细胞瘤26,31日- - - - - -37]。马尼等人报道PYCARD32的甲基化被认为在41%(13)小细胞肺癌组织中,40%(70)28日的非小细胞肺癌组织,和32%的63年(20)的乳腺癌组织(32]。另一方面,PYCARD甲基化会缺席在良性的肺组织(18 0%,0),罕见的良性的乳腺组织(7%,2 30)。一般而言,相关信息PYCARD甲基化和减少蛋白质的表达。町田等人利用免疫组织化学和报道,PYCARD表达减少所有肺癌类型(75%,30 40)而不是10蔓延前的病变(33]。PYCARD甲基化尤其与后肺腺癌的肿瘤阶段;只有14%(7 50)的阶段我但61%(31)19日后期肿瘤显示甲基化。关等人免疫组织化学分析PYCARD表达式,发现PYCARD表达式中缺失或减弱62.5% 32(20)的黑色素瘤,而所有18个良性melanocytic痣显示强烈PYCARD表达式(34]。虽然我们专注于PYCARD作为诱发细胞凋亡的基因发现使用LNCaP元,元也移植其他候选人凋亡诱导因素列入表中2。这些其他因素以及集体PYCARD可能引发细胞凋亡的过程。

我们在50前列腺癌标本进行了分析,PYCARDhypermethylated在原发性前列腺癌肿瘤特异性的方式,与先前的研究一致(35- - - - - -37]。值得注意的是,我们观察到显著差异甲基化频率与格里森评分。尽管羽衣甘蓝等。35和Das et al。36]报道癌症特异性的甲基化PYCARD启动子在65.5%(38/58)和63.6%(42/66)的情况下,这些研究并没有发现任何的甲基化状态之间的关系PYCARD和格里森评分。然而,在我们的研究中,绝大多数的癌症标本(90%,45/50)显示的甲基化PYCARD启动子。另外,我们观察到的一个重要的甲基化之间的联系PYCARD启动子和格里森评分7或更高(格里森 :25%,1/4,≥7:96%,44/46)。尽管格里森的样本大小 样品是有限的,我们认为这一发现是非常重要的。进一步分析将给我们更多有用的信息对前列腺癌患者的临床管理。

虽然PYCARD经常被甲基化与损失PYCARD蛋白在前列腺癌标本,如图2 (c)和表S2,PYCARD甲基化水平并不总是与PYCARD表达式。尤其是,在这项研究中,失去PYCARD蛋白质被认为在正常上皮和/或在10例基底细胞,尽管甲基化水平PYCARD启动子是极低的。类似的关系PYCARD启动子甲基化和表达也被观察到具有原发性黑色素瘤(34和恶性胶质瘤26]。有几种可能性来解释这些结果。首先,尽管PYCARD启动子是unmethylated, PYCARD蛋白质表达水平可能是由转录因子的激活程度和局部微环境。事实上,PYCARD是调节肿瘤坏死因子等细胞因子-α和白介素- 1 (IL)β(38,39]。第二,组蛋白修饰和染色质重塑除了PYCARD甲基化可能导致PYCARD蛋白表达。在这种背景下,组蛋白H4 16赖氨酸乙酰化作用(H4K16Ac)被认为是重要的维护PYCARD基因活性(40]。

据报道,PYCARD甲基化被不仅在前列腺癌,而且在前列腺癌前病变称为高档前列腺上皮内瘤(HGPIN) [35,37]。启动子甲基化的PYCARD似乎出现在早期阶段致癌作用,前列腺癌的发病机理和甲基化水平逐步提高。因为肿瘤特异性PYCARD格里森评分6甲基化并不是频繁的标本,分析PYCARD甲基化在HGPIN应该添加更多有价值的信息澄清的作用PYCARD在前列腺肿瘤发生甲基化。此外,Alumkal等人表明,启动子的甲基化CDH13单独或结合PYCARD独立associates生化复发的风险增加根治性前列腺切除术后(41]。所有这些研究表明,启动子甲基化PYCARD可以潜在生物标志物在临床设置。目前,PSA的测量已被广泛用作早期前列腺癌检测血液测试,但是这个测试仍然是一个引起争议的正确使用42]。因为PSA表达在正常细胞和肿瘤细胞,真正的肿瘤特异性生物标志物(s)负责前列腺癌的发生和发展需要;最好,应该被液体活检。PYCARD是这样的候选人之一,前列腺癌的诊断;还需要进一步的分析来阐明其作用和实用价值。

5。结论

使用methyl-CpG目标转录激活(元)方法,我们发现凋亡诱导PYCARD作为DNA hypermethylation-mediated沉默基因,特别是前列腺癌,格里森 。我们目前的结果表明,启动子甲基化PYCARD可能在前列腺癌的临床肿瘤特异性生物标志物。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果可在GEO数据库(GSE74743)或从相应的作者。

信息披露

Yoichi Arai目前的地址是泌尿外科学系宫城癌症中心医院,47-1 Medeshima-Shiote-aza-Nodayama,名,日本宫城县981 - 1293。彰Horii目前的地址是萨卡人总医院16:5,Nishiki-cho, Shiogama,宫城985 - 0024年,日本。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

确认

我们感激B.L.S.皮尔斯博士(美国巴尔的摩马里兰大学大学)的编辑工作准备的手稿和生物医学研究核心(日本仙台东北大学医学院)的技术支持。这项工作是支持的补助金(批准号从日本18 k07061)促进社会科学(jsp)。

补充材料

补充1。图S1: NFκB(广告)-MBD感应四环素。

补充2。图S2:代表重亚硫酸盐测序结果PYCARD(左)和TNFRSF25(右)启动子区域。

补充3。图S3: PSA recurrence-free率之间的关系和PYCARD表达式或PYCARD肿瘤特异性甲基化。

补充4。图S4: PYCARD表达在正常前列腺上皮细胞系,但很少在三行前列腺癌细胞表达。

补充5。表S1:核苷酸序列的引物和探针用于这项研究。

补充6。表S2: PYCARD的DNA甲基化和免疫染色分析的结果。

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