文摘

客观的。调查的杀死作用rukangyin (RKY)激活γδT细胞在乳腺癌细胞mda - mb - 231,并提供一个依据中医结合免疫疗法对乳腺癌。方法。因此,研究分离外周血单核细胞(PBMC),并使用CCK8乳康饮料,选择最优的浓度ZOL (zoledronic酸)和PHA激活(phytoagglutinin)γδT细胞。有8个组包括①PBMC对照组,②RKY集团,③ZOL集团,④PHA集团⑤RKY + ZOL集团⑥RKY + PHA集团⑦ZOL + PHA集团和⑧RKY + ZOL + PHA组。在0和14天的文化、细胞生存能力γδ通过流式细胞仪检测T细胞扩张。放大的8组γδT是cocultured与乳腺癌mda - mb - 231细胞与荧光染料CFSE标记比10:1确定的杀伤力γδT细胞在乳腺癌mda - mb - 231细胞。结果。最优浓度RKY ZOL, PHA激活γδT细胞增殖是4.5 mg / l, 3μ60 M,μ分别g / ml。0天的文化,值( ,%)γδT细胞在组织①⑧ , , , , , , ,和 ,而当一个对比组, 和 ;组间无显著差异。此外,当被培养14天,值( ,%)γδT细胞在组织①⑧ , , , , , , ,和 。然后,基于组之间的比较, 和 ,有明显统计学差异。此外,扩张的值γδT细胞比较之前和之后的文化为0到14天。的集团①组⑧值分别为2.072,12.051,41.641,29.015,27.777,18.972,59.836和79.622。除了PBMC对照组( ),有显著统计学差异( )。的数量γδT细胞扩张在14天RKY + ZOL + PHA组> ZOL + PHA组> RKY + PHA组> PHA组> RKY + ZOL组> ZOL组> RKY组>对照组PBMC。从集团①组⑧,γδT细胞扩张倍数 , , , , , , ,和 ,分别,而组间比较 和 。至于放大系数,RKY + ZOL + PHA组> ZOL + PHA组> RKY + PHA组> RKY + ZOL组> PHA组> ZOL组> RKY组>对照组PBMC。在杀害实验中,谋杀率( ,%)集团①集团⑧ , , , , , , ,和 ,而组间比较 和 。在杀死率方面,有RKY + ZOL + PHA组> ZOL + PHA组> RKY + PHA组> RKY组> RKY + ZOL组> PHA组> ZOL组>对照组PBMC。结论。Rukangyin可以增加的杀伤力γδ对mda - mb - 231细胞的T细胞激活的扩散γδT细胞,它提供了一种依据中医结合免疫疗法对乳腺癌。

1。介绍

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤,严重威胁着妇女的健康,甚至生命。三阴性乳腺癌的发病率(TNBC、ER、PR、her - 2都是消极的)约占-20%,15%的乳腺癌。乳腺癌死亡率最高和最糟糕的预后。传统的治疗方法主要有手术、放疗和化疗、内分泌治疗、靶向治疗。然而,大量的病人仍有转移或复发,这可能与免疫系统有关,如抗肿瘤、癌基因激活,细胞途径激活。我们之前的研究表明,乳康煎剂(主要活性成分是saikosaponin (C₄₂H_68年O₁₃),curcumol (C₁₅H₂₄O₂)、pachymic酸(C₃₃H₅₂O₅),astragaloside-II (C₄₃H_70年O₁₅)、橘皮苷(C₂₈H₃₄O₁₅),coixenolide (C₃₈H_70年O₄)可以抑制增殖和诱导凋亡的三阴性乳腺癌细胞mda - mb - 231,验证复方中药的疗效是舒缓的肝脏和脾脏在乳腺癌的治疗1- - - - - -4]。T细胞分为αβT细胞和γδT细胞按照不同的细胞类型。γδT细胞只占成人外周血[0.5 - 5%5,6),主要分布在粘膜和皮下组织和占据一个重要的角色在抗菌,寄生虫,和肿瘤免疫(7- - - - - -13]。在这项研究中,rukangyin (RKY) zoledronic酸(ZOL)和植物凝集素(PHA)适当的浓度被用作兴奋剂对PBMC采取行动。此外,诱导和扩散γδ收集T细胞为效应细胞。人乳腺癌细胞株mda - mb - 231作为靶细胞观察造成的影响γδT细胞在乳腺癌细胞株mda - mb - 231,旨在探索使用rukangyin诱导和激活γδT细胞在乳腺癌免疫治疗应用。

2。材料和方法

2.1。材料和方法

2.1.1。实验材料和设备

mda - mb - 231细胞(Sai Baikang货号:Icell-h133),乳康饮料(自制),ZOL(多国评价,文章编号:hy - 13777 - a), PHA(多国评价,文章编号:HY-N7038),人类外周血淋巴细胞分离的解决方案(Solarbio,货号:P8610), CFSE(多国评价,文章编号:HY-D0938)细胞γ/δPE (Biolegend,文章编号:331209),CD3 PerCP (Biolegend,文章编号:300325),CCK8检测工具(注册机,货号:KGA317) R1640完全培养基(ScilenCell,文章编号:1001),D trypsin-ETA消化解决方案(Solarbio,货号:T1300) PBS (BI,货号:02 - 024 - 1 - acs),绿色链霉菌素混合物(100 x) (Solarbio,货号:P1400)的边后卫(BBI生命科学,文章编号:e600001 - 0500), DMEM完全培养基(KGM货号:kgm12800s - 500)。NovoCyte™流式细胞分析仪(爱森生物科技(杭州)有限公司,有限公司模型:NovoCyte 2060 r)和有限公司₂孵化器(上海逸恒科学仪器有限公司,模型:症- 80 - cw)。

2.1.2。主要试剂的制备

(1)乳康阴,加入100毫升蒸馏水沸腾9 g的每一个药包,完全溶解和过滤;倒入100毫升无菌蒸馏水稀释和过滤器准备解决方案与45毫克/毫升的浓度;然后根据实验的需要稀释。(2)ZOL,我们准确称量3.5毫克,添加3.5毫升的PBS溶解它,准备一个溶液浓度为3.45 mM,并根据实验需要稀释它。(3)对PHA、5毫克正是加入1毫升的PBS解散它。然后,它将准备好一个解决方案5毫克/毫升的浓度和稀释根据实验的需要。(4)CFSE, 10毫克正是加入1毫升的DMSO浓度的解决方案准备解决方案根据实际需要17.9385毫米和稀释

2.2。方法

2.2.1。分离PBMC

执行当前的研究根据赫尔辛基宣言,伦理委员会批准山东第一医科大学第二附属医院。早上,新鲜健康志愿者外周血从空腹和稀释1:1与磷酸盐(PBS)。此外,PBMCs分离与聚蔗糖密度梯度离心法使用。

2.2.2。CCK8检测细胞增殖和屏幕的药物浓度

(1)消化细胞resuspended和统计。不同浓度的药物组合和镀,细胞密度 /好。(2)细胞生长的24小时后,我们替换96孔板的细胞进行测试使用相同的介质,与100年μl每增加10μl CCK8试剂都好,在孵化器孵化2小时。(3)标检测每个在450纳米波长的吸光度。根据细胞增殖,rukangyin的最佳浓度,ZOL, PHA激活γδT细胞就会被筛选出来。有8个组包括①PBMC对照组,②RKY集团,③ZOL集团,④PHA集团⑤RKY + ZOL集团⑥RKY + PHA集团⑦ZOL + PHA集团和⑧RKY + ZOL + PHA集团文化测试后14天

2.2.3。测试用台盼蓝细胞生存能力

根据原则,台盼蓝染料无法用完整的细胞膜进入细胞,它只能积累在细胞受损或死亡细胞膜和现在的蓝色在显微镜下对细胞生存能力的统计数据。步骤如下:(1)收集细胞的液体,离心机,丢弃上层清液,添加resuspending thefresh媒介,统计,和准备一个单细胞悬液,(2)把细胞悬液和0.4%台盼蓝溶液的比例9:1。在三分钟,我们生活和死细胞在显微镜下计数。之后,可以染色蓝死细胞,活细胞则不可见。统计细胞生存能力可以计算如下: 。

2.2.4。流仪检测γδT细胞扩张时期

(1)我们收集 - - - - - - 细胞,离心去除上层清液,加入1毫升PBS洗一次在1500 rpm,使离心5分钟,最后,抛弃上层清液。(2)我们添加50μl PBS resuspending细胞和加5μl抗体识别γ/δ体育和CD3 PerCP分别。轻轻搅拌后,我们在室温下孵化20分钟在黑暗中。(3)加入1毫升PBS,离心5分钟,每分钟500转,丢弃上层清液;我们增加500μl PBS resuspending细胞,拌匀,并检查流量计上的放大系数: 。

2.2.5。复苏的乳腺癌mda - mb - 231细胞

(1)细胞复苏所需的准备培养基我们。在干燥温度的恒温加热器39°C和预热半小时。(2)我们把细胞从液氮中恢复过来,转移通过干冰框。然后,细胞被放入干式恒温加热器并迅速解冻后放在超净表。(3)细胞都被转移到离心管,标志和离心机(1000转3分钟),并丢弃的上层清液。(4)新鲜培养基被添加到离心管resuspend细胞转移到细胞培养瓶,并放置在一个37°C, 5%的公司₂孵化器继续培养。

2.2.6款。流仪检测γδT细胞杀伤率

的放大PBMCs集团①组⑧cocultured与乳腺癌mda - mb - 231细胞与荧光染料CFSE标记比10:1。与PBS洗涤后,这些细胞被resuspended并添加7-AAD避免光。15分钟的孵化后,流式细胞仪是用于确定的杀伤力γδT细胞在乳腺癌mda - mb - 231细胞: 。

2.2.7。统计分析

所有数据被SPSS19.0统计分析。显著差异是由SPSS单向方差分析。此外, 被认为是显著性差异。

3所示。结果

3.1。药物浓度的筛选

在不同的药物浓度,根据扩散γδT细胞,最优rukangyin浓度为4.5 mg / l, ZOL浓度是3μM, PHA浓度是60μ克/毫升。

3.2。台盼蓝检测细胞的可行性

PBMCs每组被台盼蓝染色计数天0到14天。结果如表所示1和数字1和2。PBMC之前添加到药物文化、细胞生存能力为100%,条件很好。经过14天的添加药物,每组是90%以上的细胞生存能力良好。

3.3。流仪检测γδT细胞扩张时期

从集团①组⑧,扩张的结果γδT细胞在0和天14日文化如表所示2和数字3- - - - - -5。当培养0天,γδT细胞值之间的比较组( , ),和存在的组之间无显著差异。当培养14天,γδT细胞值之间的比较组( , )。此外,有显著的统计差异组。γδT细胞扩张值RKY + ZOL + PHA组> ZOL + PHA组> RKY + PHA组> PHA组> RKY + ZOL组> ZOL组> RKY组>对照组PBMC。的比较γδT细胞扩张值之前和之后的发展γδT细胞在每组每天0和14显示显著统计学差异除了PBMC对照组。经过14天的文化扩张的倍数γδ每组T细胞如表所示3和图6。每组之间的比率 , ,并存在显著差异。与对照组相比,每组的放大系数增加,放大系数是RKY + ZOL + PHA组> ZOL + PHA组> RKY + PHA组> RKY + ZOL组> PHA组> ZOL组> RKY组>对照组PBMC。

3.4。流仪检测γδT细胞杀伤率

从集团①组⑧+ mda - mb - 231细胞,造成的结果如表所示4和数字7- - - - - -9。基于对比组( , )。可以找到显著差异。杀率RKY + ZOL + PHA组> ZOL + PHA组> RKY + PHA组> RKY组> RKY + ZOL组> PHA组> ZOL组>对照组PBMC。

4所示。讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。TNBC的病理亚型乳腺癌。由于缺乏适当的内分泌和靶向治疗药物,手术,放疗,化疗是目前推荐作为主要的治疗方法14]。手术后免疫疗法是一个新兴的肿瘤治疗模式,放疗和化疗。刺激或调节人体的免疫系统,增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力,从而控制和杀死肿瘤细胞。因此,它有望成为肿瘤治疗领域的一个创新。肿瘤抗原的存在是一种抗原T细胞激活的先决条件。肿瘤突变负担在不同亚型乳腺癌之间的差异显著,其中TNBC突变负担最高(15]。γδT细胞是T细胞抗原受体(T细胞受体(TCR))。T细胞组成的γ和δ链。他们广泛分布在身体的外周血和粘膜组织(16]。他们是连接天然免疫在抗肿瘤免疫和适应性。激活γδ可以发挥他们的细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的影响通过各种方式和具有良好的抗肿瘤作用在体内和体外17]。γδT细胞免疫治疗技术,作为一种新的肿瘤治疗,具有良好的应用前景。

激活γδT细胞有直接杀死肿瘤细胞。他们的细胞毒性与CD8 +细胞毒性T细胞和NK细胞。他们可以分泌穿孔素和granzyme B破坏细胞膜或表达凋亡诱导因素,如CD95配体和TNF-related凋亡诱导配体(TRAIL)杀死肿瘤细胞(18]。针对多个抗肿瘤机制γδT细胞,人们采用两种策略使用γδT细胞对肿瘤免疫疗法:隔离和体外扩大Vγ9 vδ2 T细胞过继注入到患者和/或体内应用Vγ9 vδ2如zoledronic酸T细胞激活增强抗肿瘤活性γδT细胞。除此之外,有两个收养注入的方法γδT细胞:一是收集外周血单核细胞(PBMC)肿瘤病人,隔离γδT细胞,利用平衡和2放大并激活它们,然后返回到病人,或者换句话说,抗肿瘤的活性γδT细胞用于治疗肿瘤,而第二个是收集肿瘤患者PBMC的隔离αβT细胞,细胞转移γδDNA注入αβT细胞,使αβT细胞表达细胞γδ体外,从而被放大,然后输回患者(19]。我们的研究小组使用结核分枝杆菌低分子量多肽抗原(Mtb-Ag)放大和激活γδT细胞,可以快速获得足够的γδT细胞(5]。

以前,RKY抑制乳腺癌淋巴转移和扮演了一定的角色在乳腺癌治疗通过调节PI3K / AKT和其他信号通路,抑制乳腺癌细胞增殖,诱导细胞凋亡1,2]。根据目前的研究,RKY, PHA, ZOL可以刺激的扩散γδT细胞在适当的浓度。CCK8来检测RKY PBMC在不同浓度的扩散。这是筛选,当RKY浓度为4.5 mg / l, PBMC的扩散是最高的。PHA是糖蛋白和蛋白质的混合物从植物中提取。它可以引起红细胞的凝集和获得它的名字。它还可以促进PBMC的扩散(20.]。在目前的研究中,PHA的浓度是0到60之间μg / ml, PBMC的扩散是最高的60岁μ克/毫升。与PHA浓度的增加,细胞增殖率逐渐增加,这是符合报告王et al。21]。ZOL是一种第三代二磷酸盐的药物。这是drugwhich可以用于治疗骨质疏松症和肿瘤骨转移。应用程序的扩散γδ在许多报道[T报道22,23]。在目前的实验中,CCK8被用来检测单核细胞与不同浓度的扩散ZOL。此外,它是筛选的细胞增殖率ZOL达到最大浓度为3μ从0到20μ米,随着ZOL的浓度增加,单核细胞的增殖率增加,减少在高浓度。在扩散方面,当培养0天,γδ每组T细胞占3%单核细胞总数的-5%,这是与报道一致γδT细胞占0.5% -5%的PBMC。经过14天的文化γδ每组T细胞占总数的-35% 25% PBMC。与对照组相比,每一组都显著增加的倍数扩张。与对照组相比,膨胀倍数的每组都显著增加,表明乳康煎煮,PHA, ZOL施加刺激效应的扩散γδT细胞。

中药的抗肿瘤机制一直是一个重要的临床探索的领域。人们普遍认为,中药在体内会产生一个免疫调节效应通过调节T, B淋巴细胞,单核巨噬细胞,免疫细胞因子,树突细胞和肿瘤。浸润淋巴细胞和其他细胞分子可以起到抗肿瘤免疫作用[24]。特别是,中药的有效成分是一个热门研究课题。据报道,槲皮素可以显著促进扩散γδT细胞的表达granzyme B,穿孔素以及杀死结肠癌HCT116细胞的能力。信号通路的机制可能是通过p-ERK和p-Akt25]。中药多糖可以产生强大的抗肿瘤免疫的调节免疫反应γδT细胞。例如,黄芪多糖和云苓多糖可以显著抑制肿瘤生长的肿瘤小鼠和显示存在剂量依赖的相关性特征(26]。机制研究发现的能力γδT细胞的多糖治疗组中医是增强。与此同时,细胞因子的分泌正-γ肿瘤坏死因子-αgranzyme显著增加,Fas-L在细胞表面的表达增加。

本实验研究表明,RKY结合γδT可以增加杀戮的乳腺癌mda - mb - 231细胞。一般来说,肿瘤细胞并不敏感γδ独自T细胞(27]。因此,其他药物经常补充增加乳腺癌细胞的敏感性γδT细胞,它提供了一个有效的方法来改善其功效。黄(28)使用一种天然多酚药物白藜芦醇结合γδT细胞对癌细胞的行为。研究证明白藜芦醇能表达下调c-FLIP的表达在乳腺癌细胞和增加乳腺癌细胞的反应γδT细胞。的敏感性γδT细胞乳腺癌mda - mb - 231细胞增强。元的研究等。29日)表明,葛根素能促进人类的扩散γδT细胞,增加的杀人活动γδT细胞对肝癌smmc - 7721细胞。郑等进行的研究。25)表明,槲皮素可以增强的扩散γδT细胞并杀死结肠癌HCT116细胞体外的功能。此外,机制可能是通过p-ERK p-Akt信号通路。因此,在乳康煎剂的成分,推测槲皮素(25),黄芪多糖、茯苓多糖(26],甚至curcumol [30.),薏苡仁脂(31日],saikosaponin [32发挥了协调作用。因为有许多中药有效成分化合物具有不同的内容,这些成分的有效工作浓度是不同的。此外,进一步的研究需要拆卸的公式完全揭示复方中药的机理对乳腺癌细胞增殖和细胞凋亡。简而言之,与药物补充提高造成的影响γδT细胞在肿瘤细胞过继免疫治疗是有效的,这为肿瘤免疫治疗提供了更有效的策略和创意。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

所有程序中执行研究涉及人类受试者按照道德标准机构和国家研究委员会和《赫尔辛基宣言》及其修正案晚些时候或类似的道德标准。这项研究是根据赫尔辛基宣言和执行是伦理委员会批准山东第一医科大学第二附属医院。

同意

书面通知同意了从所有受试者加入了我们的研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突相关的手稿。

作者的贡献

研究设计的概念是由李克强王先生和李象棋。王Zaiwang陈和化工进行研究。作者分析了所有数据。手稿草案是由Zaiwang陈,李克强王,象棋。重要的修订手稿是由所有作者。所有作者阅读和批准最终的手稿。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(批准号81473687 (X.-Q.L。)),山东省自然科学基金(批准号ZR2020MH357 (X.-Q.L。)和ZR2020MH312 (K.-Q.W。)),和泰安科技计划(批准号2020 ns129 (K.-Q.W。))。