逍遥散网络药理学治疗卵巢癌的机制及豆甾醇对PI3K/Akt通路的影响

摘要

目的．本研究旨在通过网络药理学分析和实验验证，探讨逍遥散及其主要化合物豆甾醇在卵巢癌(OC)生物网络和信号通路中的调控机制。方法．利用中药系统药理学数据库及分析平台(TCMSP)对其活性成分及作用靶点进行研究。利用GeneCards和OMIM数据库筛选XYS治疗OC的常见靶标。结合STRING数据库和Cytoscape 3.6.0，获得了XYS的核心化合物和靶标。利用Metascape和DAVID数据库对核心靶基因进行GO和KEGG通路富集分析。利用AutoDock Vina程序实现分子对接，讨论XYS处理OC过程中核心靶点和化合物的相互作用。采用CCK8和创面愈合实验检测豆甾醇对细胞增殖和迁移的影响。Western blot和qRT-PCR检测菌柱醇处理后PI3K、Akt、PTEN蛋白和mRNA的表达。结果．从OC相关的975个靶点和XYS作用的239个靶点中，共获得了113个XYS治疗OC的共同靶点。XYS的主要化合物有槲皮素、柚皮素、异鼠李素、豆甾醇等，主要调控TP53、Akt1、MYC和PI3K/Akt、p53等靶标及细胞周期信号通路。同时分子对接表明，Stigmasterol与Akt1具有良好的对接构象。豆甾醇在体外抑制OC细胞增殖和迁移，降低PI3K/Akt信号通路蛋白和mRNA的表达。结论．豆甾醇是XYS的主要化合物之一，通过PI3K-Akt信号通路抑制OC细胞活性。

1.介绍

卵巢癌(OC)是妇科癌症中诊断最频繁和死亡率最高的一种。5年总生存率约为40%，大多数患者在发现时较晚，因为缺乏症状不明显[1.,2.］.目前，OC的治疗主要是手术、以铂为主的化疗和放疗。在一项临床研究中，30-45%的BRCA1/2突变患者对PARP抑制剂奥拉帕尼有反应。但复发和转移被认为是由于耐药性和毒性。因此，如何提高有效率，减轻副作用仍有待完成。多项临床试验显示，中药与化疗或放疗相结合可使慢性阻塞性肺疾病患者获益[3.–5.］.

平仁药房方剂中的XYS具有疏肝养血、健脾和心的功效。主要用于肝郁、脾虚、血虚证。然而，XYS治疗OC的机制尚不清楚，需要进一步讨论。

随着生物信息学、系统生物学和多药理学的快速发展，基于网络的药物发现被认为是一种经济有效的药物开发方法[6.］.近年来，越来越多的证据表明，许多药物可以通过调节多个靶点来刺激其治疗活动[7.]由于中草药成分丰富，疾病相关分子变化复杂，大多数中药及其衍生物在复杂疾病中的作用机制尚待阐明。

在该研究中，使用几种药物靶预测数据库来分析XYS，并且构建了OC治疗中XYS的主要靶标的蛋白质 - 蛋白质相互作用网络（PPI）以探讨其主要的生物功能和信号传导途径。最后，通过体外细胞实验验证了Stigmasterol对PI3K / AKT信号传导途径的影响，该细胞实验验证了XYS及其复合Stigmasterol的开发和应用的新基础。

2.材料和方法

2．1．主要药品及试剂

胎牛血清(FBS)取自HyClone(美国)，RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640培养基，青霉素、链霉素等试剂均取自GIBCO(美国)。豆甾醇(纯度:98%，APExBIO Technology LLC)溶解在DMSO中，-20℃保存。培养物中DMSO终浓度≤0.1% ( )．

2.2.XYS治疗OC的常见目标

中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://www.tcmspw.com/tcmsp.php.以柴胡、白芍、当归、白术、茯苓、甘草、生姜、薄荷为主要活性成分。采用ADME评价体系筛选XYS组分中的活性化合物及其靶标，其主要评价指标为口服生物利用度( )和drug-likeness ( )．通过STRING数据库(https://string-db.org/) [8.]，所收集的XYS靶标名称为标准化基因id，物种来源为人类(“智人”)。GeneCards (https://www.genecards.org/)及OMIM (https://omim.org/)收集OC相关基因和靶标[9］.通过绘制Venn图获得113个常见的OC和活性组件的目标（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)(图1.)．

２．３．蛋白质相互作用(PPI)网络

通过STRING从以上113个共同靶点得到PPI网络，并选择“Homo species”。最小相互作用阈值选择为“中等置信度>0.4”。使用Cytoscape 3.6.0软件对网络的核心靶标进行分析，输出“PNG”格式(图1.)．前3个靶点(TP53, Akt1, MYC)被鉴定为XYS治疗OC的枢纽基因，后续研究中使用了这些靶点。获得前3个靶标的表达量https://www.helixlife.cn/．

２.４.基因本体(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)途径富集分析

利用Metascape数据库(http://metascape.org/)及DAVID资料库(https://david.ncifcrf.gov/）; 意义重大。

2．5．中药活性物质-靶标网络的构建

Cytoscape 3.6.0用于构建OC治疗中XYS的“草药活性化合物靶”网络。我们将前10种活性化合物鉴定为XYS的核心化合物。

2.6.分子对接

利用分子对接技术检查了XYS治疗OC过程中核心化合物与靶点之间的相互作用。靶点蛋白质结构可从PDB网站下载(http://www.rcsb.org/)，并从TCMSP数据库下载核心化合物的三维结构。在AutoDock Vina中进行了分子对接和构象评分。

热图由GraphPad Prism 8获得。PyMOL和Maestro 11.9被用来绘制最佳对接结果的结构。

2.7。Akt1 mRNA水平与OC患者生存结局的关系

我们使用了R3.6.3软件来执行接收器操作特征曲线（ROC曲线）和Kaplan-Meier曲线（KM曲线）富集分析。我们在TCGA的卵巢浆液膀胱癌（OV）项目中编制了RNASEQ数据和临床资料（https://portal.gdc.cancer.gov/)，将其转化为TPM (transcripts per million read)格式，然后根据分子表达进行分析。

2.8。OC细胞系的培养

A2780和SKOV3细胞系在含10%的RPMI1640培养基中培养( )胎牛血清和100 U/ml青霉素/100 mg/ml链霉素在37°C的5% CO_2.的气氛。

2.9。细胞增殖实验

将卵巢癌A2780和SKOV3细胞接种成96孔板，梯度浓度（0 μM、 十, μ25米,μM，50 μM、 一百 μM、 和500 μM） 柱头甾醇在37°C下培养24、48和72小时。用10%细胞计数试剂盒-8（CCK8；北京佐曼生物技术有限公司，中国北京）替换OC细胞，用正常培养基稀释并培养1小时 H使用Motic数字医学图像分析系统（莱卡DM2500，德国海德堡）在450℃下测量每个孔的吸光度 纳米。所有测试重复三次[10］.

2.10。豆甾醇的准备

豆甾醇溶于DMSO中，混合后经0.22过滤μm过滤器。储备溶液的温度为10 制备mM浓度，并将其储存在-20°C的冰箱中，使用前用1640完全培养基解冻并稀释至所需浓度。

2.11。伤口愈合实验

伤口愈合测定的细胞培养区域的比较由一个10产生 μA2780和SKOV3细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养，不加或加25和50μm stigmasterol分别。Leica DM2500，Heidelberg，德国Leica DM2500使用了动机数字化学图像分析系统[11］.

2.12。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（美国Life Technologies）分离上述细胞的总RNA。在260℃下通过分光光度法评估RNA浓度和纯度 纳米。总共1 μ使用Prime Script RT试剂盒（美国Takara有限公司）将g RNA转化为cDNA。使用实时PCR系统（美国Bio-Rad有限公司）在反应混合物（25）中进行qRT PCR μl)含有cDNA，引物对(表1.)和TB Green Premix Ex Taq II (Takara Co. Ltd.， USA)。

2.13。免疫印迹(WB)

用豆甾醇处理A2780和SKOV3细胞48 h。PBS洗涤3次后，用冰裂解细胞30分钟，离心 4°C保存5分钟。使用ND-1000分光光度计(NanoDrop, Wilmington, Delaware, USA)对细胞裂解液中分离的蛋白质含量进行定量。等量的蛋白样品通过10% SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)进行电泳，然后转移到PVDF膜(Millipore, Bedford, Massachusetts, USA)。5% BSA阻断2小时后，在4°C下用一抗免疫印迹过夜。主要抗体包括p-Akt (gb13012 - 3,1: 500)、Akt (GTX28805, 1: 800)、p-PI3K (GTX132597, 1: 800)、PI3K (ab40755, 1: 1000)、PTEN (et1606 - 43,1: 800)等β-actin (AC026, 1: 10000)。然后，用山羊抗兔IG二抗(KPL074-1506, 1:5000稀释)在37℃下孵育1 h。通过执行融合FX5光谱(Fusion, France)估计蛋白质条带的强度。

3.结果

3.1. XYS在OC治疗中的PPI网络

在图中1.，显示了用于治疗具有113个节点和1805个边缘的OC相互作用网络的XYS。采用Cytoscape获得了相互作用的前3个枢纽靶点，包括TP53、Akt1和MYC。因此，Akt1和TP53在OC组织中的表达高于正常组织，而MYC的表达低于正常组织（图1）1.)．

３．２．GO和KEGG通路富集分析

XYS靶点在OC治疗中的GO和KEGG通路涉及338个信号通路，包括PI3K-Akt信号通路、膀胱癌、胰腺癌、乙肝、癌症中的microRNAs、HIF-1信号通路。前20条路径如图所示2.．

３．３．Herb-Active Compound-Target网络

该网络图直接通过多组区和多元协同作用进行了XYS治疗XYS的机制。Herb-Active复合靶网络已经显示出在oc的治疗中的前10种活性化合物，包括槲皮素，kaempferol和stigmasterol（表2.)．

3.4。分子对接

XYS的前10个主要化合物与Akt1、TP53和MYC蛋白结构对接。结果表明，豆甾醇对Akt1和Vina评分( )是-10.60 kca1/mol（图2.)．分子对接显示，Stigmasterol与Akt1通过LEU264、VAL270、LEU210和LEU264等位点的疏水相互作用(图)2.)．

3．5．Akt1 mRNA水平与OC患者生存结局的关系

我们进一步探讨了Akt1在OC患者生存中的临界效率。OC中Akt1的ROC曲线分析确定ROC曲线的AUC为0.702。Kaplan–Meier曲线和对数秩检验分析显示Akt1 mRNA水平的增加与OC患者的总生存率（OS）显著相关（图2.)Akt1的高表达表明总生存期较长。

3.6。豆甾醇对A2780和SKOV3细胞增殖的影响

CCK8实验结果表明，豆甾醇可显著抑制A2780和SKOV3细胞增殖，且呈剂量依赖性( )．的集成电路₅₀值显示在表格中3.．用25μM和50. μm持48小时。

3.7。豆甾醇对A2780和SKOV3细胞迁移的影响

随着复合液甾醇的结果显示出对卵巢癌A2780和Skov3细胞系的显着细胞毒性活性，伤口愈合测定表明，Stigmasterol抑制A2780和SKOV3细胞的迁移（图3.)．

3.8。豆甾醇通过qRT-PCR抑制A2780和SKOV3细胞中PI3K-Akt信号通路mRNA的表达

qRT-PCR结果显示，与对照组和DMSO组相比，Stigmasterol显著降低PI3K和Akt1的mRNA表达。豆甾醇组PTEN mRNA表达增加( )（图3.)．

3.9。Western Blot检测豆甾醇抑制A2780和SKOV3细胞中PI3K-Akt信号通路蛋白的表达

与对照组和DMSO组相比，p-PI3K/PI3K和p-Akt/Akt蛋白表达显著降低，PTEN表达增加( )（图3.)．这一结果表明，Stigmasterol可有效抑制人A2780和SKOV3细胞中的PI3K-Akt信号通路。

4.讨论

在中药中，XYS已经提出了抗癌活动，用于通过加强气并滋养血液来治疗乳腺增生，乳腺癌和OC。XYS是一个经典的中文处方，首先在宋代和平仁慈药物处等级的处方中描述（A.D.1151）。

在本研究中，XYS作为网络药理学的结果，具有多成分、多靶点协同治疗OC的作用。该网络中XYS的主要活性化合物包括槲皮素、β谷甾醇、山奈酚和豆甾醇。既往研究表明，槲皮素具有抗癌活性，可下调RAS、BCL-2、突变P53、上调BAX [12］.研究表明β谷甾醇具有广泛的抗癌特性，如在结肠癌、卵巢癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌中诱导细胞凋亡和抑制增殖、侵袭、转移和血管生成。β-Sitosterol通过雌激素重吸收施加针对卵巢癌的溶胶。还，β-谷甾醇降低了β-Catenin，PCNA（增殖细胞核抗原）和结肠癌中的BCL-2 [13］.山奈酚可降低OC细胞磷酸化Akt蛋白的表达。它抑制人OC细胞的细胞迁移和血管生成，诱导细胞凋亡和ROS的产生，从而抑制人OC细胞的生长发育[14];Stigmasterol通过抑制TNF-2，VEGFR-2和P-AKT，PCL和FAK的表达，有效地靶向肿瘤内皮细胞[15］.

OC治疗中XYS的PPI网络表明核心目标包括AKT1，TP53和MYC。因此，我们使用该数据库分析OC组织和正常组织中上述3个枢纽基因的表达。结果表明，在OC组织中高度表达AKT1和TP53，MyC表达在OC组织中低于正常组织。在OC治疗中，XYS的GO和KEGG途径浓缩分析还发现PI3K / AKT信号通路在OC信号通路中起作用。从分子对接结果来看，Stigmasterol展示了与AKT1的强烈相互作用。同时，AKT1在OC的表达与临床患者的OS密切相关。因此，我们预测AKT1可以是用于治疗OC的Stigmasterol的潜在核心目标。

在临床研究中，70%的OC中发现PI3K/Akt信号通路失调，包括PTEN缺失和PIK3CA突变[16］.遗传改变和AKT的异常激活是由于卵巢细胞癌。有研究表明AKT通路参与癌细胞迁移、侵袭和自噬，被认为是OC治疗的潜在治疗靶点[16–19]PI3K/Akt/mTOR通路抑制剂成为临床应用的新型肿瘤靶向药物[18］.

基于这些结果，我们进一步验证了Stigmasterol对OC细胞系A2780和SKOV3中PI3K-Akt信号通路的影响。CCK8实验和创面愈合实验结果表明，豆甾醇能显著抑制A2780和SKOV3细胞的增殖和迁移。此外，豆甾醇可降低A2780和SKOV3细胞中PI3K和Akt的水平，增加PTEN的表达。本研究不仅为进一步深入研究提供了理论和实验基础，而且为一系列中药有效成分作为抗肿瘤药物的合理利用提供了有效方法。

5.结论

总之，作为XYS的主要活性化合物的柱甾醇可以通过靶向PI3K / AKT信号通路来预测OC治疗中的候选化合物。

数据可用性

数据可在直接请求到相应作者时获得。

的利益冲突

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

致谢

该研究得到了河北省科技科技科技科技科技科技科技部的主要基本应用项目（授予No.1596730d）至Z.W.

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