文摘
客观的。本研究旨在探讨阿司匹林和可能的神经保护机制的影响细菌内毒素脂多糖(LPS)在脑ischaemia-reperfusion (CIRP)受伤。方法。我们建立了三个动物模型:CIRP,有限合伙人,CIRP + LPS模型。死亡率、受伤的大脑区域和梁行走测试被用来估计在老鼠脑损伤的程度。免疫组织化学和免疫荧光检测活化的小胶质细胞,矩阵metalloproteinase-3 (MMP-3)和骨桥蛋白(OPN)。结果。受伤的大脑区域和死亡率大大降低( ),和梁行走测试分数升高( )乙酰水杨酸(ASA)组与对照组相比。小神经胶质细胞的数量、MMP-3, OPN-positive细胞也增加了。此外,GSI-B4 OPN,和MMP-3细胞减少ASA组与对照组相比。LPS刺激后,小胶质细胞的数量在24小时达到高峰;在7 d,这些细胞消失。ASA组中,小胶质细胞的数量小得多( ),特别是在24小时( ),相比LPS组。此外,受伤的大脑区域和死亡率显著增加,梁行走测试分数降低( )在有限合伙人CIRP后仿真。受伤的程度ASA组与对照组。然而,MMP-3-immunoreactive神经元或小胶质细胞的数量明显大于对照组( )。ASA组,MMP-3表达式也大大减少( )。结论。迅速CIRP之后,小胶质细胞激活和MMP-3和OPN的表达显著增加。在再灌注对大鼠注射LPS,受伤的大脑区域和死亡率也显著增加,神经障碍的恶化。然而,亚撒CIRP损伤过程中表现出神经保护效应。此外,亚撒可以反向LPS-induced脑损伤和抑制CIRP损伤后的炎症反应。
1。介绍
的病理生理机制动脉缺血再灌注(I / R)损伤是相当复杂的,涉及到一系列的损伤级联,如氧化应激、兴奋性氨基酸毒性、Ca2 +过载、凋亡基因表达和炎症反应(1]。过度炎症反应后的脑组织脑I / R (CIRP)是再灌注损伤的主要原因之一,也是一种性脑缺血继发损伤的重要病理生理机制。的积累炎症细胞和炎症因子的释放的早期阶段I / R导致过渡从缺血性损伤炎症损伤2]。乙酰水杨酸(ASA),也被称为阿司匹林,是一种非甾体类抗炎药物具有广泛的药理作用和多个站点的行动。近年来,亚撒已经发现大脑有直接的保护,除了在缺血性中风的治疗(抗血栓形成的影响3,4]。在这项研究中,一只老鼠大脑中动脉闭塞模型被用来分析ASA的影响小胶质激活和矩阵的表达式metalloproteinase-3 (MMP-3)和骨桥蛋白(OPN)基因在CIRP和探索ASA的神经保护机制。
2。材料和方法
2.1。实验动物及分组
健康男性Sprague-Dawley (SD)大鼠体重介于240 g和280 g的医学动物,沈阳军区总医院,中国,被用于本研究的三个动物模型:CIRP,脂多糖(LPS)和CIRP + LPS模型。CIRP模型,66 SD大鼠随机分为三组:虚假的组( )手术均顺利完成,术后给予生理盐水对照组( )被溶剂后CIRP, ASA集团( )是80毫克/公斤ASA CIRP之后。每组进一步分为5个亚组根据执行时间:6小时,24小时,3 d、5 d, 7 d组。对于PS模型,35 SD大鼠随机分为三组:LPS组( )腹腔内注射2.5毫克/公斤有限合伙人,对照组( )与生理盐水治疗相同的体积,和ASA集团( )是腹腔内注射2.5毫克/公斤有限合伙人ASA + 80毫克/公斤。每组同样分为五组根据时间点:6小时、24小时、3 d、5 d, 7 d组。对于CIRP + LPS模型,PS组( )CIRP后是1毫克/公斤有限合伙人和有限合伙人+ ASA集团( )给出了有限合伙人1毫克/公斤+ 80毫克/公斤ASA CIRP之后。两组也分成两个子组根据时间:24小时和7 d组。从麻醉觉醒后,老鼠回到笼子里他们可以自由吃喝的地方。老鼠从每组都牺牲在适当的时间点来获得必要的标本。这项研究是聊城人民医院伦理委员会的批准。
2.2。动物模型制备
CIRP模型,大鼠手术前禁食12小时,曝露了戊巴比妥钠(50毫克/公斤)腹腔内接种,然后接受手术使用修改后的玉蜀黍属巴隆的方法(5]。虚假的操作组的老鼠只有接受麻醉和血管分离,和缝线没有介绍。老鼠筛查肢体神经赤字分数据Bederson 5方法,和那些分数CIRP 1 - 3被认为是积极的。LPS模型,大鼠腹腔注射LPS的2.5毫克/公斤(6]。对于CIRP + LPS模型,CIRP模型再灌注期间,1毫克/公斤LPS腹腔内注射到老鼠后立即提取螺栓。
2.3。梁行走测试
感觉运动协调功能的恢复是评估使用梁行走测试(BWT)欧胜et al。7,8]。培训前一周每天30分钟1操作实施,使老鼠稳步走在横梁上。四个分数记录24小时,3 d、5 d, 7 d后手术。
2.4。死亡率的计算
死亡是用来计算死亡率在观察期间,CIRP手术后24小时开始。
2.5。脑损伤范围的决心
老鼠犀牛与戊巴比妥钠(50毫克/公斤)腹腔内接种在I / R后24小时,和大脑灌注在老鼠后取出NS。四到五冠状切片获得使用大脑切片机(第一刀是在前面的中点的大脑和交叉的线,第二刀在视交叉,第三刀处理的漏斗,漏斗之间的第四刀和后叶的尾巴)。部分是孵化1%氯化三苯基四氮唑溶液在黑暗中在37°C 30分钟,然后浸泡在福尔马林的10%。Image-Pro + 6.0软件用于计算每个片的梗死面积和面积,并表示为梗死区总面积的百分比。
2.6。免疫荧光染色
大脑样本进行免疫荧光染色得到节中描述2。5。与蔗糖梯度洗脱后,大脑受到常规脱水,透明,打蜡,嵌入,其他步骤,获得5μ米厚的部分。石蜡切片脱蜡,反复洗0.01 PBS缓冲。小胶质细胞凝集素的免疫组织化学染色GSI-B4,生物素化的凝集素GSI-B4(稀释0.01 PBS缓冲的最终浓度5μg / mL)被添加到样本1 h在37°C;然后,凝集素是替换0.01 PBS缓冲是一种消极控制。免疫组织化学染色的OPN和MMP-3,适当的稀释的主要抗体(OPN抗体,1:400;MMP-3抗体1:100)添加到样本。这些样品是孵化1 h在37°C;然后,相应的抗体主要是替换0.01 PBS缓冲消极的控制。随后,添加相应的biotin-labelled二级抗体,样本在37°C孵化20分钟。荧光显微镜用于观察和获取照片(9,10]。大脑切片分析了半定量的使用ImageJ软件。
2.7。统计分析
所有数据都表示为 。单向方差分析是用来分析多个组之间的差异,以及 - - - - - -测试是用来分析两组之间的差异。多个比较样本之间的意思是使用SNK-q测试分析。卡方检验是用于比较大鼠死亡率和OPN-positive细胞率。统计学意义是 ,和 被认为是非常重要的。SPSS软件(版本20.0)是用于数据分析。
3所示。结果
3.1。梁行走测试
如表所示1sham-operated集团并没有表现出症状的神经缺陷在所有时间点。LPS组得分最低和最严重的神经赤字,这明显不同于对照组( )。ASA组神经赤字水平是最低的,这个同样明显不同于对照组( )。此外,没有显著差异的程度有限合伙人之间的神经恢复+ ASA组和对照组。
3.2。有限合伙人和ASA在脑损伤的程度
如表所示2和图1,有限合伙人明显增加脑损伤的程度在治疗大鼠相比,对照组( )。ASA组的脑损伤范围明显小于对照组( )。相比之下,有限合伙人的脑损伤范围+ ASA组与对照组相当,但明显低于LPS组( )。
3.3。有限合伙人和亚撒对死亡率的影响
如表所示3期间,有限合伙人的死亡率显著增加大鼠CIRP相比对照组( )。然而,ASA组的死亡率显著低于对照组( ),和有限合伙人+ ASA组与对照组相似。
3.4。在不同的时间点变化Isolectin B4-Positive细胞
Isolectin B4-positive nonischaemic脑组织细胞没有检测到的老鼠和老鼠CIRP sham-operated。在缺血性梗塞面积,小胶质细胞的形态和数量随时间后CIRP和缺血性区域位置。如图2,只有少量的isolectin B4-positive细胞中发现对照组CIRP后梗死中心6 h内,和观察到的细胞主要是杆状和圆的细胞。peri-infarction地区小神经胶质细胞的数量达到一个峰值后24 h CIRP,这明显不同于6 h(数量 ),和大多数细胞high-branched。圆的数量和阿米巴小胶质细胞梗死中心进一步增加3 - 5 d CIRP之后。此外,小胶质细胞的数量减少梗死面积,但依旧很高。CIRP后第七天,圆形或阿米巴观察小胶质细胞的最大数量在整个的缺血性梗死区。
3.5。亚撒对Isolectin B4-Positive细胞
如表所示4,小胶质细胞的数量在ASA治疗组低于对照组CIRP后在每个时间点。在24 h, ASA组的小神经胶质细胞的数量明显不同于对照组( )。此外,在梗塞核心区域,小胶质细胞的数量明显减少从24 h - 7 d相比对照组( )。
3.6。OPN的表达和MMP-3 ASA的影响
OPN-positive细胞没有贴上标签在正常大鼠,sham-operated组,或脑缺血组。OPN表达OPN-positive中可观察到细胞缺血性梗塞面积CIRP后6 h - 7 d。细胞形态和表达时间进程是一致的与isolectin B4-positive细胞。如图3对照组,OPN-positive细胞仅限于peri-infarction区域CIRP后6 h。此外,我们观察到的只有一小部分细胞,低免疫反应强度,光染色。在CIRP 24 h后,我们观察到大量OPN-positive细胞包围了梗塞,这明显不同于6 h。OPN-positive细胞,主要是圆和amoebic-like细胞,也开始出现在梗死区。High-branched细胞也在外围地区。在3 d CIRP后,梗死中心OPN-positive细胞的数量明显增加,细胞逐渐增加。在5 d,这些细胞成为典型的球状细胞:胞体扩展到一个球状的外观,严重染色细胞核和细胞膜,细胞质是轻或不染色。在5 - 7 d,在梗死OPN-positive细胞显著减少,主要是amoebic-like和圆形细胞,观察。从CIRP后第三天,大量的OPN蛋白粒子被发现在细胞外空间,第七天,OPN蛋白颗粒在细胞外基质成为显著降低。梗死区主要由球状细胞。
如表所示5和6,ASA-administered OPN-positive细胞群的数量略低于对照组;然而,这种差异不显著。因为isolectin B4-positive小胶质细胞在ASA组明显低于对照组,OPN的积极率小胶质细胞( )ASA组显著高于对照组( )。
MMP-3表达式和ASA的影响,未发现MMP-3-positive细胞在正常和sham-operated老鼠的脑组织。MMP-3更广泛表达于神经元缺血性和nonischaemic CIRP 6 h - 7 d后,尤其是在大脑皮层。如图4对照组显示大量MMP-3-positive细胞peri-infarction CIRP后6 h和中部地区,成为最明显的在24小时3 d。这些细胞的细胞质和细胞核浓缩和有一个三角形的外表,这是一致的,一个典型的缺血性神经元。从3 d CIRP之后,更多的圆和阿米巴MMP-3-positive小胶质细胞出现在peri-infarct区域。这些细胞达到最大数量,也成为表达在梗死中心7 d。此外,MMP-3表达于血管周的细胞和基底膜CIRP后24小时至3 d。MMP-3也表达了海马体和脑室脉络丛的缺血性在5到7 d。
如表所示7,与对照组相比,MMP-3-positive缺血性神经元的梗塞的面积ASA治疗组显著降低,与最显著减少3 - 7 d ( )。
3.7。活化的小胶质细胞在LPS模型组和ASA的影响
Isolectin B4-positive小胶质细胞没有老鼠的脑组织中发现对照组。如图5小神经胶质细胞的免疫染色LPS组明显后6 h有限合伙人管理。他们的形态是high-branched,突触是细长的,他们没有完全激活。细胞的数量并没有显著改变在24小时;然而,他们的形态学改变。突出成为收回,形成循环活化的小胶质细胞,和isolectin B4染色强阳性。第三天,小胶质细胞的形态是一样的,在6 h,高度支化。5 d后,小胶质细胞的数量明显减少。第七天,isolectin B4-positive小胶质细胞消失。
如表所示8,isolectin B4-positive细胞ASA组明显低于LPS组( )在24小时( )。这时间很短,激活观察注射LPS后的第五天。小胶质细胞几乎消失了,这是早于LPS组(第七天)消失。
3.8。小胶质细胞的表达和MMP-3 CIRP + LPS模型组和ASA的效果
LPS腹腔内注射后,小胶质细胞的数量和免疫反应强度的老鼠变得比对照组明显不同,以及与周边地区相比。如图6,大量的圆和阿米巴细胞被认为在梗塞核心CIRP 24 h后,泡沫细胞也明显。大量的阿米巴和高度支化的细胞被认为在该地区周围的梗塞。7 d,泡沫细胞分布在整个缺血性梗塞面积,和这些细胞的数量明显不同于对照组( )。
见表9,小胶质细胞的数量的ASA治疗组明显低于LPS组和他们的数量和形态与对照组。
LPS腹腔内注射后,在脑梗死面积扩大和缺血性神经元的数量显著增加。相应的MMP-3-positive神经元也变得显著增加与对照组相比,和MMP-3-positive缺血性神经元的形态学变化更加明显。胞体变得极其凝聚(图和一个细杆的形状变得明显7)。
见表10,MMP-3 ASA-treated组表达明显低于LPS组,但与对照组相似。
4所示。讨论
小胶质细胞广泛分布在中枢神经系统和巨噬细胞在大脑中固有的。性脑缺血后几个小时,炎症反应在大脑受损的地区开始了几天,这加剧了延迟性脑缺血引起的脑损伤和神经细胞恶化的生物功能11]。胶质细胞是重要的免疫炎症反应;因此,小胶质细胞在脑缺血性损伤的作用已经得到越来越多的关注(12]。在我们的实验中,模型建立了瞬态脑动脉阻塞的缝合方法。小胶质细胞激活后CIRP通过免疫组织化学观察。CIRP后,观察小胶质细胞的形态和数量有一个与时间和缺血性区域。Isolectin B4用于标签五种不同形式的活化的小胶质细胞,包括灭活、高度支杆状,充分激活轮和阿米巴细胞,晚期吞噬坏死组织细胞泡沫细胞。peri-infarction地区,大量的小胶质细胞出现CIRP后6 h,和这些细胞带状梗死中心。活化的小胶质细胞的数量达到了一个峰值在24 h,及其范围扩大。Semiactivated high-branched小胶质细胞也开始出现在缺血性外围和脑组织的正常区域。peri-infarction地区小神经胶质细胞的数量减少在3 - 7 d,但仍在一个较高的水平。此外,它的激活增加,大多数是圆和阿米巴。 The appearance time and peak time of microglia in the central part of the infarction were significantly later than that in the infarction area, and by the seventh day, these cells filled the necrotic area. Studies have found that microglia participate in the process of ischaemic neuron damage at the early stage of ischaemia and that they may play an important role in promoting repair during the late stages of brain injury [13]。我们的实验证明了ASA在小胶质细胞激活的抑制作用三个方面。首先,CIRP后,亚撒显著抑制的数量和形态影响isolectin B4-positive小胶质细胞缺血性半影或梗死中心。第二,ASA表现出显著的抑制作用LPS-induced小胶质细胞的激活。第三,ASA逆转CIRP损伤引起的小胶质细胞的激活和有限合伙人双重因素的对照组。与ASA的神经保护机制和小胶质激活的机制,可以推断,ASA通过至少两个抑制小胶质细胞的激活途径。第一个是抑制的关键转录因子NF -κB和炎性因子TNF -α和il - 1β在急性炎症反应。第二个是通过减少缺血性神经元的激活,尤其是神经元细胞凋亡的产生,减少受伤神经元的信号,从而抑制小胶质细胞的激活。因此,亚撒可能有大量的对小胶质激活抑制性影响。ASA可能作为监管机构减轻炎症级联的恶性循环集中在CIRP后小胶质细胞,发挥神经保护作用。
基质金属蛋白酶是一组zinc-dependent蛋白水解酶降解各种细胞外基质成分的功能。在病理条件下,基质金属蛋白酶能促进发展的许多疾病,如肿瘤入侵和渗透,动脉粥样硬化,多发性硬化症,阿尔茨海默氏症、恶性神经胶质瘤,和其他中枢神经系统疾病(14,15]。在这项研究中,采用免疫组织化学方法观察MMP-3 CIRP后表达。我们发现MMP-3主要表达在神经元和胶质细胞缺血性梗塞面积,类似于以前的结果(16]。中部的梗塞,MMP-3-positive神经元主要出现在24小时和3 d后消失,这是与大多数神经元的坏死和解体的梗死区。peri-infarction地区,MMP-3-positive神经元表现出强烈的免疫反应,大量,和一个很长的过程,达到一个峰值在第三天继续,直到第七天。我们发现MMP-3可以表示在缺血性坏死的神经元和神经元延迟细胞凋亡发生。据报道,MMP-3积极的小胶质细胞主要存在于梗死中心4 - 7 d性脑缺血再灌注后大鼠50分钟再灌注模型(17]。此外,它也被发现,MMP-3也是血管周的细胞中表达,基底膜,和脑室脉络丛的梗死面积,可能参与脑缺血后血管基底膜的降解,破坏BBB,导致血浆蛋白漏入脑实质或脑水肿。最近的研究还发现,亚撒是基质金属蛋白酶的特异性的抑制剂。ASA可以抑制细胞MMP-2活动在不同类型的疾病18- - - - - -20.]。在目前的研究中,我们观察到,ASA可以减少MMP-3-positive缺血性神经元的作用在peri-infarction区CIRP的老鼠和亚撒也可以反向LPS诱导以及高MMP-3表达式。亚撒的抑制作用性脑缺血后MMP-3表达可能是由于以下原因。首先,ASA直接抑制MMP-3的表达一些意思,类似于其他基质金属蛋白酶。第二,ASA CIRP抑制神经细胞凋亡后,这样的缺血性神经元数量减少,MMP-3-positive神经元的数量成为相应减少。然而,亚撒的抑制作用性脑缺血后MMP-3表达需要进一步调查。我们的研究表明,ASA抑制MMP-3性脑缺血的早期阶段。一方面,它在BBB减轻基质金属蛋白酶的破坏效应,另一方面,它减弱MMP-3对小胶质细胞的激活,从而发挥神经保护作用。
OPN是一个组件的正常中枢神经组织的细胞外基质和组织修复的关键因素和中枢神经系统损伤后的细胞外基质重塑。在这项研究中,通过免疫组织化学OPN表达CIRP评估后,我们发现OPN表达主要是小胶质细胞。表达很明显主要peri-infarction地区6 h 3 d和达到24 h。5 - 7 d后,它存在于梗死。在核心区域,大量的OPN蛋白颗粒被分泌到细胞外基质从第三天开始。体外实验表明,OPN可以激活星形胶质细胞的迁移过程,促进星形胶质细胞通过绑定到整合素受体αVβ3 (21]。这些结果表明,在缺血性脑损伤后,OPN和其受体促进激活、迁移和疤痕形成的局部脑梗死后神经胶质细胞,参与组织修复过程。在我们的研究中,我们观察到OPN-positive细胞的数量减少后ASA政府与对照组相比。OPN表达CIRP主要是观察小胶质细胞后,亚撒在小胶质细胞有显著的抑制作用。因此,这些因素可能与观察到的OPN细胞的数量减少。研究表明OPN可以对缺血性损伤发挥保护作用通过多种细胞内途径和下游效应器蛋白,包括减少伊诺表达式,激活蛋白激酶Akt,凋亡bcl - 2蛋白的表达增加,激活磷脂酰肌醇3-kinase (PI3-K) / Akt和P42/44 MAPK通路(22]。
细菌内毒素LPS,通常是用作多克隆免疫刺激免疫反应研究中模拟身体的免疫状态。它是一种常见的模型为研究免疫系统之间的信息交换和神经系统(23]。我们的研究调查后小胶质细胞的可塑性变化一腹腔内注射LPS在正常大鼠和CIRP老鼠。小胶质细胞被激活几个小时有限合伙人在正常大鼠腹腔内注射后,最高的数量从6小时到3 d,延续到注射后的第七天。在24小时,小胶质细胞表现出一个圆形的外观和完全激活,表明2.5毫克/公斤LPS可导致形态的变化。与有限合伙人CIRP大鼠腹腔内注射后,t小胶质激活成为更重要;不仅小神经胶质细胞的数量增加,形态大macrophage-like细胞也被观察到。体外实验表明,有限合伙人不施加直接毒性损伤神经元。有限合伙人对中枢神经系统的影响是由小胶质激活。活化的小胶质细胞可以产生炎症或肿瘤坏死因子等细胞毒性因素-α,伊尔-βcox - 2,进气阀打开,过氧化物,从而损害周围神经元(24,25]。因此,这个过程通常用于反向小胶质激活引起的有限合伙人作为客观指标评估神经保护(26,27]。在我们的实验中,有限合伙人是用来模拟系统感染后大脑的炎症过程。结果表明,有限合伙人加剧小胶质激活和MMP-3 CIRP表达式后,加重脑缺血后炎症级联,从而导致继发性炎症性脑损伤,加重急性中风后神经赤字。这个实验的结果还显示,亚撒一个腹腔内注射后CIRP施加显著的神经保护作用和建议ASA至少部分神经通过抑制CIRP损伤后的炎症反应。
总之,这个实验使用了一些动物模型从几个方面来研究小胶质激活,MMP-3和OPN表达,亚撒在这些过程的影响。由于应用动物体内研究的局限性,免疫组织化学只用于半定量的研究。亚撒的作用机制中观察到我们的实验应该被体外实验证实,如细胞培养方法从细胞和分子水平的研究。此外,进一步讨论ASA的神经保护机制不仅可以提供临床治疗也基本理论依据ASA的修改,也就是说,所谓的超级阿司匹林的建设。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
我们声明没有利益冲突。
作者的贡献
Depeng冯和陈Dezhe co-first作者。