文摘

客观的。探索表达式、函数和的可能机制cysteine-rich肠道蛋白1 (CRIP1)在卵巢上皮癌。方法。使用开放微阵列数据集从癌症基因组图谱(TCGA),我们发现卵巢癌的肿瘤发生的基因。然后,我们发现CRIP1表达式在26个通过免疫组织化学方法对卵巢上皮癌组织样本(包含IHC)和CRIP1之间进行了相关分析和临床病理的特点。此外,卵巢癌上皮细胞系A2780和OVCAR3被用来检查CRIP1表达式通过免疫印迹和存在。各种细胞功能进行了实验与肿瘤发生相关的包括CCK8化验、EdU,膜联蛋白V-FITC /π细胞凋亡测定,伤口愈合,Transwell化验。此外,epithelial-mesenchymal过渡(EMT)标记的表达是由免疫印迹检测说明CRIP1和EMT的关系。此外,KEGG通路富集分析和免疫印迹的信号通路进行了揭示CRIP1参与卵巢癌发病机理。结果。CRIP1被确认为TCGA的致癌基因数据库。IHC分数表明CRIP1蛋白表达在一个更高的水平比tumour-adjacent肿瘤组织和与更高的病理阶段,年级,和积极的淋巴转移。在细胞模型中,CRIP1在浆液性卵巢癌上皮中。细胞功能实验表明,击倒CRIP1没有明显影响细胞增殖或凋亡但可能对细胞迁移和入侵,产生抑制作用,也促使EMT标记的变化。此外,KEGG通路富集分析和免疫印迹显示CRIP1能诱导卵巢癌细胞通过激活Wnt /转移β连环蛋白通路。结论。这项研究首次证明CRIP1作为癌基因,可能促进肿瘤转移通过调节EMT-related Wnt /β连环蛋白信号通路,这表明CRIP1可能是卵巢癌转移的重要生物标志物和进展。

1。介绍

卵巢癌,卵巢恶性肿瘤的一种,是最致命的妇科癌以及第五女性癌症死亡率的主要原因(1]。超过85%的卵巢癌来源于上皮细胞(称为卵巢癌上皮,转换端)、浆液性卵巢癌是最常见的组织学亚型(2]。目前,卵巢上皮癌的主要治疗方法是肿瘤细胞减少手术和以铂为基础的化疗,免疫治疗和靶向治疗。虽然这些治疗选项可用,总体5年生存率仍然很低,在30%左右(-40%2]。据估计,22530名患者被诊断为卵巢癌在2019年在美国,其中13980患者死亡(3]。高死亡率可能是由于很多因素,包括缺乏对卵巢癌的症状和检测生物标记物在其早期阶段,遥远的入侵和转移(4,5]。因此,它是非常重要的识别新的早期诊断和预测生物标记有一个更好地了解卵巢癌转移的机制,也是一个紧迫的问题改善卵巢癌治疗的疗效。

有许多因素导致卵巢癌的转移。最近,积累的证据表明,卵巢癌转移的主要驱动力epithelial-mesenchymal过渡(EMT),癌细胞失去上皮的潜力和获得间质表型,允许细胞从原发部位分离,获得的能力metastasise [6- - - - - -9]。此外,研究表明,EMT的活动是由许多不同的信号通路10),其中规范化Wnt /β连环蛋白信号通路对卵巢致癌作用和EMT至关重要。太阳和他的同事们(11]发现高尔基磷酸化蛋白的高表达3 (GOLPH3)在卵巢癌患者可以被视为一个致癌基因与不良预后相关,它可以促进卵巢癌细胞增殖,迁移和入侵通过刺激Wnt /β连环蛋白信号通路和EMT。董et al。12)也报道,PEST-containing核蛋白质(PCNP)促进卵巢癌细胞入侵的能力和metastasise以同样的方式。这些发现不仅强调Wnt /的意义β连环蛋白信号通路在致癌作用和EMT但还透露,一些致癌基因参与卵巢癌浸润和转移。这丰富了我们的知识卵巢癌进展的机制,为癌症治疗提供了基础,已成为更精确,个性化。然而,在这一领域仍然是不完整的信息。由于小数量的关于这一主题的研究,更深入的研究需要进一步揭示卵巢癌浸润和转移的确切机制,进一步提高当前的治疗策略。

作为LIM /双锌指蛋白家族的成员,cysteine-rich肠道蛋白1 (CRIP1)有一个独特的双锌指主题和主要是在小肠中表达的13]。它第一次被认为是一种细胞内运输和锌吸收蛋白质(14]。瘸子也发现在腹膜巨噬细胞等免疫细胞和外周血单核细胞,这表明它可能参与宿主免疫反应(15]。此外,近几十年来,CRIP1的异常表达在一些癌症吸引了越来越多的关注。在转移性结直肠癌(CRC), CRIP1 CRIP1被发现的差别中,对这些基因的抑制细胞迁移和入侵的细胞系SW620和HT2916]。因此,它可能函数作为癌基因调节CRC细胞的迁移和入侵,可能被视为一个新的有前途的生物标志物对于预后不良和结肠癌的转移。类似的结果也发现在宫颈癌17),甲状腺癌(18),和子宫内膜癌19]。相比之下,CRIP1表达了一个有利的结果和更少的转移在骨肉瘤20.和乳腺癌21]。尽管CRIP1似乎有争议的角色在上述肿瘤,我们确定CRIP1,作为癌基因和肿瘤抑制基因,与肿瘤转移有密切的关系。然而,当前的研究CRIP1是有限的和底层CRIP1-mediated肿瘤转移的机制在很大程度上是未知的。此外,卵巢癌和CRIP1尚未之间的关系进行了讨论。

在这项研究中,我们的目的是描述CRIP1表达模式,功能,卵巢癌和可能的机制。首先,我们运用生物信息学方法筛选出的致癌基因在卵巢癌CRIP1 TCGA数据库,显示卵巢癌的高表达CRIP1预后不良。随后,我们用组织样本和细胞模型来验证其表达式。然后,我们执行在体外实验来探索它的功能在入侵,移民和EMT,进一步发现了可能的机制。结果表明,upregulation CRIP1能促进卵巢癌的入侵,转移,EMT通过激活Wnt信号通路,表明CRIP1可能被视为一个有价值的新的卵巢癌生物标记。

2。材料和方法

2.1。遗传筛查

使用在线差异基因表达分析工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/德根),我们分析了卵巢癌的基因差异表达与正常卵巢组织的癌症基因组图谱(TCGA)数据库。通过方差分析差异表达基因决定的。基因与 被认为是调节, 被认为是具有统计学意义。然后,环球数码创意TCGA卵巢癌(OV) mRNA表达FPKM生存数据和临床数据从网站下载https://xenabrowser.net/datapages/),重大生存基因通过“生存”和“SurvMiner”包的R软件( )。通过进一步搜索PubMed,基因在文献中报道不再考虑。在十字路口的三个,目标基因。

随后,目标基因被日志排名₁₀(值)显示的五大基因用于生存的分析和风险比(人力资源)生存分析网站(https://kmplot.com/analysis/)。小时用于识别不同的基因, 表明保护性基因和 表明风险基因。的基因都与总体存活率和显著相关 被确定为关键基因。最后,我们分析了关键基因与卵巢癌的关系通过使用在线基因表达DIY工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/德根)。

2.2。京都基因和基因组的百科全书(KEGG)通路富集分析

中值表达式值的关键基因在卵巢癌样本TCGA数据库被选为最优截止值分类不同的子组的高或低表达,然后被用于KEGG分析。R软件“Limma”包被用于分析基因表达水平癌症样本,然后差异表达基因筛选出来。CRIP1之间的皮尔逊相关分析和差异表达基因进行了使用R语言,和相关的差异基因选择的条件 。我们进行了KEGG通路富集分析这些不同的相关基因在线(http://www.webgestalt.org/)。

2.3。病人和组织样本

石蜡包埋组织样本(癌组织和paracancerous组织)是来自南昌大学第二附属医院,患者与50浆液性卵巢癌样品和25 paracancerous组织样本。患者通过手术病理确诊为浆液性卵巢癌。收集病人的基本资料,包括年龄、病灶大小、临床病理分级、分期、淋巴转移,术前CA125水平。病人化疗、免疫治疗或激素疗法与卵巢癌手术前或结合其他癌症被排除在外。伦理道德委员会批准获得南昌大学第二附属医院。

2.4。细胞系,细胞培养

正常卵巢细胞系IOSE80和人类卵巢癌上皮细胞系A2780和OVCAR3来自上海EK-Bioscience生物技术有限公司有限公司A2780和IOSE80细胞系孵化rpmi - 1640中含10%胎牛血清(penicillin-streptomycin的边后卫)和1% (PS),而OVCAR3 rpmi - 1640中补充20%的边后卫,PS胰岛素的1%,和1%。细胞生长在一个孵化器在37°C公司为5%₂。细胞融合约80 - 90%时,收集细胞处于良好状态并与胰蛋白酶消化为亚文化或冷冻后的实验。

2.5。免疫组织化学

所有组织样本石蜡包埋,切成部分,3 - 5毫米在烤箱加热在72°C 2小时,紧随其后的是二甲苯deparaffinization和乙醇梯度补液。块和灭活内源性过氧化物酶,H部分保持在3%₂O₂在环境温度为15分钟,其次是洗在磷酸盐(PBS)。在柠檬酸缓冲沸腾后,自然冷却,PBS的部分又洗了三次抗原检索。然后,部分被孵化与试剂(正常山羊血清)和anti-CRIP1兔多克隆抗体(Abcepta,猫没有。AP4707b)。幻灯片与PBS洗然后孵化biotin-labelled二级抗原,再冲洗,紧随其后的是链霉亲和素标记辣根过氧化物酶的另一轮的孵化。DAB-H₂O₂可视化是用作显色试剂,苏木精复染色了。然后,软件ImageJ应用计算灰色病理评分值。

一种半定量的方法被用来检测CRIP1蛋白质的表达等级。阳性细胞百分比(0%,1 - 25%,26 - 50%,51 - 75%和76 - 100%)被记录为0,1,2,3,4点,分别。阳性染色强度得分如下:无色(0点),淡黄色(1分),棕色黄(2分)、深棕色(3分)。表达式是由两个年级得分:0 - 5代表低表达和6 - 12代表高表达。

2.6。免疫印迹

标准程序后,我们提取的蛋白质从OVCAR3 A2780和IOSE80细胞样本,然后测量蛋白质含量与BCA蛋白质化验设备。sds - page电泳后,膜被封锁了然后孵化与中小学抗体。x射线曝光的蛋白质含量进行了分析。在这个实验中使用的抗体是如下:β肌动蛋白(猫没有。4970年代),β连环蛋白(猫没有。8084年代),MMP-2(猫没有。87809年代),和MMP-9(猫没有。13667年代)从细胞信号技术(丹弗斯、马、美国);CRIP1(猫15349号- 1 - ap),钙粘蛋白(猫20874号- 1 - ap), N-cadherin(猫22018号- 1 - ap), GSK-3β(猫22104号- 1 - ap),和p-GSK-3β(猫14850号- 1 - ap)买来Proteintech(武汉);波形蛋白(猫没有。bs - 8533 r)从bios(中国,北京)。

2.7。实时逆转录PCR定量

制造商的协议后,我们用试剂盒试剂隔离从OVCAR3细胞总RNA, reverse-transcribed cDNA使用逆转录工具包(豆类,中国)。实时定量PCR进行荧光PCR仪器使用SYBR绿色PCR大师混合包(豆类,中国)。GAPDH被选为内部控制。相对折叠计算使用的关系 。经过重复实验三次,计算平均值。引物都是购买从通用生物(安徽,中国)。表1显示了特定的引物序列。

2.8。siRNA干扰

小干扰rna寡核苷酸三针对CRIP1基因,包括si - 168, si - 229和si - 276,由总体设计和合成生物系统公司(安徽,中国)。列出了三个siRNA寡核苷酸序列如下:si - 168: 5 - - - - - -GCAACAAGGAGGUGUACUUTT-3 ;si - 276: 5 - - - - - -ACGCUGAGCACGAAGGCAATT-3 ;和si - 229: 5 - - - - - -CUGCCUGAAGUGCGAGAAATT-3 。OVCAR3细胞的密度 细胞/毫升到6-well盘子。当细胞汇合的30 - 50%,我们进行转染。OVCAR3细胞转染了20μ米小核RNA)或负控制核(si-NC)(一般生物系统公司安徽,中国)在降低血清中使用Lipofectamine™3000转染试剂(美国热费希尔)。使转染后24至48 h,基因的影响可拆卸的测量通过免疫印迹和存在。

2.9。伤口愈合实验

细胞被播种6-well盘子和孵化24小时或更长时间,直到细胞融合达到80 - 90%,之前刮伤是由10画一条直线μl吸管小费。然后,细胞与PBS冲洗三次,放置在无血清培养基,其次是在孵化器孵化37°C公司为5%₂。图片是在0和24小时。伤口关闭被随机选择在显微镜下量化和测量剩余的已区域使用ImageJ在每个时间点在三个不同的领域。 。

2.10。Transwell化验

消化和后悬挂在无血清培养基,细胞密度的调整 。细胞悬液(100μl)被播种到上层Transwell钱伯斯和下室挤满了500μl 20%的边后卫的媒介。对于入侵的实验,Transwell Matrigel-coated室。然后,在37°C细胞孵化24小时为了评估迁移或入侵。4%多聚甲醛固定后,下表面的苏木精染色,在显微镜下细胞数。

2.11。5-Ethynyl-20-Deoxyuridine (EdU)合并分析

细胞增殖是评估使用一个EdU成像设备(我们光大公司,苏州、中国)。细胞被置于24-well板块 细胞每24小时,其次是暴露1×EdU (10μ在37°C M) 2小时。细胞被固定用4%多聚甲醛和permeabilised Triton x - 100年的0.5%。治疗后与100年μl染色反应的鸡尾酒30分钟,细胞与300年孵化μl 1×赫斯特(5μg / ml) 20 - 30分钟。最后,荧光显微镜下呈现EdU-stained细胞(奥林巴斯)。根据这个公式 ,我们计算的百分比EdU-positive细胞在每组通过任意选择三个字段。

2.12。细胞计数Kit-8 (CCK8)测定

我们使用细胞计数Kit-8(美国GlpBio)来测量细胞的可行性。OVCAR3细胞培养板96 - 100μl培养基的浓度 细胞/好,这道菜就放在孵化器预孵化(37°C, 5%的股份有限公司₂)。24小时后的孵化,10μl转染OVCAR3细胞被加入到菜和孵化1到4天。然后,10μl CCK8的解决方案是添加到每个好,菜是放在孵化器再次1 - 4小时。轨道上的解决方案是混合轻轻摇动1分钟,以确保颜色是均匀分布的。的OD_450年标仪测量。

2.13。膜联蛋白V-FITC /π细胞凋亡测定

细胞凋亡是检查使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备(Dojindo、日本)后,制造商的说明和相关文献[22]。细胞培养在一夜之间6-well板块。与小干扰rna干扰或无治疗后24 h,细胞与EDTA-free trypsinised胰蛋白酶,紧随其后的是三个洗冷PBS。然后,这些细胞被resuspended 1×绑定缓冲达成最终的浓度 细胞/毫升。接下来,100年μl以上细胞悬液的收集和混合5μl的膜联蛋白V-FITC和5μl(π工作解决方案在黑暗中在室温下15分钟。图像被使用一个倒置荧光显微镜(奥林巴斯)。

2.14。统计分析

所有结果的展示 。学生的 - - - - - -测试和单向方差分析是用来确定统计学意义,和皮尔逊卡方( )测试是用来识别的意义的表达之间的相关性CRIP1和组织病理学因素。所有数据分析使用GraphPad棱镜7软件,和 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。关键基因的生物信息学在卵巢癌

确定关键基因负责卵巢癌,TCGA我们使用数据集和在线工具。结果表明,2613个基因明显在卵巢癌组织与正常卵巢组织,TCGA数据库和1378年生存重要基因通过生存分析。与此同时,358个基因在文献中报道不再被认为是。后三个的十字路口,51个目标基因得到最终(图1(一)),它代表不仅微分基因还重要的生存基因。为进一步识别关键基因,我们排名51日志目标基因₁₀(值)。最后,五大关键基因(表中被发现2)。接下来,五大基因用于生存的分析和人力资源在生存分析网站上披露他们的致癌特性。生存的土地建议总体存活率和显著相关的关键基因 CRIP1和PLEK2(图1 (b))。因为CRIP1更为显著和相关的风险更高,这是为下面的选择研究。

接下来,我们证明CRIP1表达卵巢癌及其与疾病的关系。的箱线图显示了显著调节表达CRIP1在卵巢癌组织中与相邻的非肿瘤的组织( 截止:1、价值;截止:0.01, )(图1 (c))。有趣的是,小提琴情节表明CRIP1表达增加与肿瘤病理阶段,建议密切CRIP1表达与卵巢癌年级之间正相关( , )(图1 (d))。这些发现表明,CRIP1基因致癌性质,和CRIP1的高表达可能在卵巢癌预后不良的一个可靠指标。

3.2。CRIP1是在卵巢癌细胞系和肿瘤组织

核实CRIP1在卵巢癌的表达,我们选择两个卵巢癌细胞系(A2780和OVCAR3)和使用正常的卵巢细胞系IOSE80控制。与IOSE80相比,CRIP1的mRNA水平显著调节OVCAR3 ( ),而CRIP1 A2780表达相对不变( ,图2(一个))。免疫印迹也显示同样的结果在蛋白质水平(图2 (b))。此外,CRIP1内容在卵巢癌组织中通过免疫组织化学方法检测(包含IHC),其中包括26对浆液性卵巢癌上皮组织匹配相邻正常组织。包含IHC分数表明CRIP1癌症组织中高度表达,与相邻正常组织没有表达( ,图2 (c))。这个结果是与生物信息学分析的结果一致。

此外,CRIP1表达与临床病理参数之间的相关分析50例浆液性卵巢癌上皮。我们的数据表明,高CRIP1表达密切相关高病理阶段,年级,和积极的淋巴转移,而没有发现随着年龄的关系,肿瘤直径、或CA125水平(表3),表明CRIP1可能促进卵巢癌侵犯和远处转移。鉴于上述实验结果,OVCAR3细胞系被选为后续实验。

3.3。si-CRIP1没有显著影响细胞增殖和细胞凋亡OVCAR3细胞

我们确认一个高水平的表达CRIP1 OVCAR3和卵巢癌组织。确定CRIP1在卵巢癌的作用,我们撞倒CRIP1 OVCAR3细胞使用三种不同的短干扰rna (siRNAs),包括si - 168、si - 229和si - 276。转染效率被存在和免疫印迹(数据验证3(一个)和3 (b))。其中三个siRNAs si - 229显示最好的消声效果,所以选择下面的实验。

接下来,我们评估CRIP1影响增殖和凋亡有或没有CRIP1核。CCK8化验的结果表明CRIP1沉默并不影响细胞生存能力 ,图3 (c))。同样,EdU试验表明CRIP1击倒对细胞增殖没有明显的影响( ,图3 (d))。此外,使用膜联蛋白V-FITC /π化验检测细胞凋亡,我们发现没有区别si-CRIP1转染细胞和si-NC转染细胞,这表明si-CRIP1 OVCAR3细胞没有影响细胞凋亡( ,图3 (e))。

3.4。CRIP1沉默消退在OVCAR3细胞迁移和入侵

伤口愈合实验进行演示CRIP1沉默是否会影响OVCAR3细胞迁移。与si-NC组相比,细胞si-CRIP1显示更广泛的伤口闭合区域(图4(一)),它提出了一个显著减少迁移能力si-CRIP1 OVCAR3细胞( )。类似的结果还发现Transwell化验没有人工基底膜( ,图4(b))。这些结果说明CRIP1沉默抑制细胞迁移。理解CRIP1癌症细胞入侵的作用,我们进行了另一个Transwell试验与人工基底膜。如图4(c),当与si-NC组相比,更少的细胞si-CRIP1集团进入众议院通过Matrigel-coated膜( )。这些结果表明CRIP1抑制的损耗在OVCAR3细胞迁移和入侵。

3.5。CRIP1诱发EMT的Wnt /β连环蛋白通路

上述结果显示之间存在明确的相关性CRIP1表达和细胞入侵。EMT起着至关重要的作用在迁移和入侵的过程中,有必要进一步验证CRIP1和EMT之间的关系。免疫印迹检测EMT的表达进行标记,包括钙N-cadherin,波形蛋白。使用CRIP1 siRNA CRIP1基因沉默后,我们观察到,上皮钙粘蛋白是调节标志,和间叶细胞标记N-cadherin和波形蛋白表达下调(图5 (b))。结合细胞功能实验的结果,我们推断CRIP1参与细胞迁移和入侵的过程中通过调节EMT在卵巢癌。

探索的生物学途径CRIP1参与卵巢癌发病机理,我们进一步进行KEGG通路富集分析。结果表明,Wnt /β连环蛋白信号通路显著丰富(图5(一个))。Wnt /β连环蛋白信号通路对EMT和癌症转移至关重要,我们选择这个途径进行进一步研究和调查的关键蛋白质规范Wnt /β通过免疫印迹连环蛋白通路。我们的研究结果表明β连环蛋白,p-GSK-3β和下游基因,包括基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9) CRIP1沉默后明显下调,而GSK-3β没有改变(图5 (c))。总的来说,这些结果表明,CRIP1调节EMT调制Wnt /β连环蛋白通路。

4所示。讨论

卵巢癌是妇科恶性肿瘤,其死亡率高很大程度上已被证明是转移性癌症的性质造成的。因此,找到一个新的预测生物标志物早期诊断和靶向治疗的重要性。尽管许多基因改变已被证明参与卵巢癌转移的潜在机制仍然是难以捉摸的。CRIP1最近,只有一个LIM领域,研究了在一些恶性肿瘤包括结直肠癌,乳腺癌,宫颈癌,骨肉瘤(20.,21,23,24]。它可以引起不同的结果在不同癌症类型,作为肿瘤特异抑制基因或致癌基因(20.,25]。然而,它的作用还没有被确认在卵巢癌。

在这里,我们显示的功能在卵巢癌CRIP1第一次和它的底层机制。通过分析TCGA的数据库,我们证实CRIP1调节浆液性卵巢癌样本,与肿瘤进展密切相关。然后,我们用组织样本和细胞模型来证实这些结果。我们观察到相同的趋势;即。,that CRIP1 had a markedly higher expression level in ovarian cancer tissues than in normal samples, suggesting an oncogenic property of CRIP1. However, it is interesting to observe that this result was only seen in the serous ovarian cancer cell line OVCAR3, while CRIP1 expression was relatively unchanged in A2780 cells when compared with normal cells. The reason for this may be that A2780 is a mucinous epithelial ovarian cancer cell line that has a different genetic background, and that CRIP1 expression has a close relationship with tumour type. Further research revealed that elevated CRIP1 was closely correlated with a higher pathological stage, grade, and positive lymphatic metastasis of patients, pointing to a link between increased CRIP1 expression and ovarian cancer aggressiveness. Taken together, these findings show that CRIP1 expression is closely related to tumour type, and that as an oncogene, CRIP1 can serve as a biomarker for a specific diagnosis and as an indicator of early metastasis in serous epithelial ovarian cancer patients.

到目前为止,CRIP1在肿瘤中的作用一直存在争议。进一步研究其致癌性质,我们沉默CRIP1的表达和表现在体外实验。结果显示无显著变化在卵巢癌细胞增殖和细胞凋亡,这是符合CRIP1-depleted结直肠癌细胞上最近发表的一项研究[16]。然而,这个结果并不同意研究乳腺癌CRIP1充当一种抑制剂的扩散和入侵过程(21]。这证实了先前的声明,CRIP1函数可以根据不同癌症类型。此外,伤口愈合和Transwell化验表明,CRIP1主要是参与肿瘤转移的过程。

接下来,我们探索CRIP1机制在调节肿瘤转移。EMT是癌症转移的主要因素26),我们进一步验证了CRIP1和EMT之间的关系。结果表明,CRIP1击倒诱导上皮钙粘蛋白标志表达的增加和减少间质标记N-cadherin和波形蛋白的表达。钙粘蛋白是一种信息粘附分子,能够锚上皮细胞通过各种连环蛋白细胞骨架的连接(27]。获取该上皮标记允许癌细胞失去转移能力,呈现一个不那么咄咄逼人表型(27]。N-cadherin也是一种糖蛋白介导粘附和信息,但它激活转移密切相关,许多恶性肿瘤的预后不良(28]。波形蛋白,中间丝(如果)家族中的一员,是一个潜在的预后因子EMT-related蛋白质(29日),也被视为一种间充质标记(30.]。EMT驱动器转换从一个上皮细胞表型间质表型,既可以在生理和病理过程,如胚胎发生,伤口愈合,癌发病机制(31日]。在癌症发病机制,肿瘤细胞通过EMT获得更高的迁移和入侵的能力。因此,我们的研究结果表明,EMT可能是一个不可或缺的过程CRIP1-mediated卵巢癌浸润和转移。

到这个阶段,CRIP1表达之间的相关性和癌症相关的EMT已经确认,但是CRIP1介导这一过程仍不清楚。通过KEGG通路富集分析,我们发现CRIP1明显丰富Wnt /β连环蛋白信号通路。这个途径可以刺激的绑定Wnt蛋白质受体称为卷曲的蛋白质(Frz),导致下游的激活胞质蓬乱的蛋白质(Dsh)块糖原合成酶激酶3β——(GSK-3β-)介导的磷酸化/退化β连环蛋白。这允许的积累β连环蛋白及其进一步易位为细胞核转录因子的结合,导致随后激活下游靶基因(32]。在这个过程中,β连环蛋白是一个核心组件和功能作为一个重要的致癌基因在许多恶性肿瘤(32,33]。我们的研究结果证实,β连环蛋白在卵巢癌细胞相对较高的表达,但表达下调CRIP1撞倒时,表明CRIP1可能激活β连环蛋白。另一个关键分子是GSK-3β,它可以作为一个关键的负调节和促进β连环蛋白磷酸化和泛素化,导致随后的蛋白酶体降解。事实上,在我们的研究中,p-GSK-3水平β,但不是总GSK-3β在卵巢癌表达下调CRIP1沉默的时候。这样做的原因可能是Wnt信号的激活可能会导致GSK-3的磷酸化和失活β,导致细胞质GSK-3β在不影响总GSK-3池失活β水平(34]。

基质金属蛋白酶(MMPs)是重要的下游靶基因的Wnt /β连环蛋白信号通路(35]。Wnt /β连环蛋白/基质金属蛋白酶轴作为转移和恶性肿瘤(EMT的不可或缺的组成部分36]。据报道,基质金属蛋白酶可以降解细胞外基质(ECM)和基底膜,这是肿瘤浸润和转移的第一步。证据表明,基质金属蛋白酶表达在不同癌症类型,和upregulation基质金属蛋白酶与肿瘤进展和有关侵袭性(37,38]。两个关键的MMP的家人,MMP-2和MMP-9也被发现参与EMT和癌症转移(38]。在我们的研究中,当CRIP1在卵巢癌细胞中被淘汰,MMP-2和MMP-9明显下调,以上的差别一起对这些βN-cadherin,连环蛋白和波形蛋白,钙粘蛋白是调节。这些结果表明,CRIP1可能激活Wnt /β连环蛋白信号通路,影响细胞粘附和支持EMT改变细胞迁移能力。

5。结论

本研究第一次表明,CRIP1可能发挥致癌作用浆液性卵巢癌上皮发展和进展,促进迁移和入侵OVCAR3细胞系。特别是,这个过程可能是通过Wnt /β连环蛋白信号通路诱导EMT,表明CRIP1可能是卵巢癌转移和预后的重要生物标志物,以及一个重要分子卵巢癌治疗的目标。

然而,这项研究只验证的效果在卵巢癌OVCAR3 CRIP1细胞系在细胞水平。此外,额外的卵巢癌细胞株,超表达细胞模型和动物模型(在活的有机体内)需要确认CRIP1表达与卵巢癌进展和预后之间的关系。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

伦理批准

伦理委员会批准的这项研究是南昌大学第二附属医院。

同意

知情同意是来自所有参与这项研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81760504)。我们感谢所有的人参加了这项工作。