文摘

背景。视网膜静脉阻塞(RVO)是第二个最常见的该人群视网膜血管疾病。Intravitreal地塞米松移植已应用于治疗黄斑水肿继发于RVO (RVO-ME)。然而,形态特征的变化检测和光学相干断层扫描血管造影(八面体)尚未完全研究RVO-ME患者治疗前后。目标。本研究的目的是确定潜在的治疗靶点综合生物信息学分析和比较了八面体特色RVO患者改变RVO-ME接受注射地塞米松intravitreal植入。方法。生物信息学分析分析了GSE101398从基因表达数据集综合数据库。多个功能富集分析,蛋白质相互作用网络构建可视化的关键节点基因。十一个眼睛RVO-ME与八面体检查之前和之后intravitreal地塞米松植入。八面体参数,包括黄斑厚度、血管密度,视网膜中央凹无血管的区域参数,hyperreflective疫源地的数量(HRF),囊状的水肿,视网膜下液(SRF),进行了比较。之间的相关性进行了分析最佳矫正视力(BCVA)和八面体参数。结果。总共有79个差异表达基因。功能富集分析揭示了丰富炎症RVO事件。RVO-ME,皮尔森相关显示基线BCVA的面积呈正相关,和中央黄斑厚度公司、基线BCVA之间没有相关性检测和HRF号码或囊状的水肿的面积。视力改善,和中央intravitreal地塞米松注射植入后黄斑厚度下降。此外,HRF,囊状的水肿的面积,地塞米松intravitreal注射后明显减轻。结论。视网膜炎症在RVO发病机理中起着至关重要的作用。穆勒RVO的成像生物标记,包括神经胶质细胞内水肿,视网膜色素上皮功能障碍,可以评估在八面体和减毒intravitreal地塞米松有效植入。

1。介绍

视网膜静脉阻塞(RVO)是一种常见的视网膜血管疾病导致视力损害。RVO根据阻塞可以分为两种类型的网站,即。,central retinal vein occlusion (CRVO) and branch retinal vein occlusion (BRVO). Rogers et al. [1)结合十五研究包括68751名个人和报道,BRVO的患病率(4.42 1000)高于CRVO(0.80 1000)在所有种族群体。迄今为止,没有有效的治疗方法可用于预防或治疗RVO。目前的治疗方法主要是集中在RVO并发症,如黄斑水肿(我),新生血管性青光眼、与antivascular内皮生长因子(vegf)代理或激光光凝术。

我视力恶化的主要原因RVO Hayreh [2),著名的黄斑区积液(3]。分解blood-retina壁垒(马上回来)占我形成的主要原因4]。虽然病理生理学RVO仍不完全清楚,血管内皮生长因子(VEGF)是普遍承认RVO的发病机制中发挥重要作用。抗血管治疗已被证明是有效的减少我在大多数RVO病例,提高视力。然而,每月注射vegf奠定了为大多数患者负担;一些,我治疗不能达到满意的效果而言,视力改善和减少,表明其他因素除了VEGF可能参与RVO-ME的发病机制,尤其是炎症包括炎症细胞和炎症相关的细胞因子。类固醇,潜在的抗炎剂,可以减少一些炎症相关的生产和propermeability蛋白质,如VEGF、白介素1,细胞间粘附分子1和单核细胞化学引诱物蛋白1,以及维持马上回来的完整性,从而提供理由steroid-based疗法治疗RVO-ME [5,6]。持续释放皮质类固醇地塞米松intravitreal植入,已被证明RVO-ME患者有益的影响。然而,改变的形态学特性检测和光学相干断层扫描血管造影(八面体),如hyperreflective焦点(HRF),囊状的水肿,视网膜下液,尚未完全研究患者前后RVO-ME intravitreal地塞米松植入治疗。

在这项研究中,我们利用网上数据库,并进行生物信息学分析来确定可能的炎症相关因子参与RVO的发病机制。为了验证这一点,11眼睛从11 RVO-ME被患者和观察前后intravitreal地塞米松植入治疗,并将重点放在了炎症参与RVO的发病机制。初步结果表明,炎症在RVO起到了至关重要的作用,和地塞米松是有效减少炎症RVO患者,如数量的减少hyperreflective焦点(HRF)和视网膜下液(SRF)和穆勒神经胶质细胞内水肿。RVO-ME发病的可能机制和地塞米松对RVO-ME也提出了在当前的研究中。

2。材料和方法

2.1。基因表达数据来源

GSE101398,激光诱导的基因表达分析RVO小鼠模型(7),是来自于基因表达综合(地理,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/),高通量基因表达谱的数据库存储库。三个激光和三个控制被包含在GSE101398 RVO老鼠。平台对GSE101398 GPL15103 (Illumina公司HiSeq 1000[亩骶])。的 (标志基因)集,C2基因集,策划和C5本体基因集从分子特征数据库下载(MSigDB,https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/)[8]。

2.2。(度)的差异表达基因分析

limma [9)包 软件版本4.0.4 (RRID: SCR_001905, R统计计算的基础,维也纳,奥地利)被用来屏幕过滤器的度 和 值< 0.01。的org.Hs.eg.db 包是用来选择两个老鼠和人类的共同基因。随后,度在火山的情节和热图ggplot2可视化 包和pheatmap 包(10),分别。

2.3。功能富集分析

基因本体论(去)11)功能分析,包括生物过程(BP),细胞组件(CC)和分子功能(MF),以及《京都议定书》全书的基因和基因组(KEGG) [12]分析被用来识别特征的生物特性和途径参与RVO的发病机制。结果被clusterProfiler[可视化13)和ggplot2 包中。,条件和途径达到一定的标准 值< 0.01和 值< 0.01被认为大大丰富。

2.4。基因集富集分析(GSEA)和基因变异分析(GSVA)

包clusterProfiler是用来执行GSEA C2策划从MSigDB参考基因集。三个阈值显著富集基因集 值< 0.01, 值< 0.05,规范化浓缩评分( )。5调节和五个表达下调通路显著富集分数可视化使用gseaplot2和ggridges 包中。

此外,GSVA [14)进行确定浓缩途径的差异。标志,和策划KEGG基因集从MSigDB用作参考。一个调整 值0.05和0.05 logFC值被设置为截止识别显著富集之间的通路正常和RVO样本。

2.5。(PPI)蛋白质间交互作用的分析

PPI网络的度进行检索使用搜索工具的相互作用基因(STRING版本11.0 b, RRID: SCR_005223,https://string-db.org/)[15探索度之间的相互作用。与总得分高于0.4的一个过程,是一种广泛使用的阈值,被认为是具有统计学意义。十个基因与大多数节点被barplot选择和可视化 包中。

2.6。病人和Intravitreal注射地塞米松Intravitreal植入

本研究回顾性队列研究,11的眼睛11首次治疗患者RVO-ME都包括在内。研究符合赫尔辛基宣言的原则。所有的参与者参与这项研究被认为在眼科学系,上海综合医院隶属于上海交通大学从2020年10月1日到2021年4月20日。研究中所有个体参与者包括签署书面知情同意参加本研究和发布他们的数据和照片。临床研究协议经伦理委员会批准上海综合医院隶属于上海交通大学(2020 ky205)。

所有个人经历全面的眼科检查基线和随访期间访问,包括最佳矫正视力(BCVA),眼内压(IOP)、裂隙灯检查,眼底摄影,和光学相干断层扫描血管造影(八面体)检查与Angiovue成像系统(RTVue XR阿凡提,Optovue Inc,弗里蒙特,CA,美国)。

入选标准是RVO-ME的诊断,这是基于临床表现包括前膜的存在和intraretinal这种火焰状的圆出血涉及一个或多个象限,扩张而曲折的静脉,黄斑水肿,视网膜下液。主要的排除标准如下:(1)以前的治疗RVO,包括intravitreal注射vegf或皮质类固醇药物和激光光凝术;(2)其他视网膜疾病包括年龄相关性黄斑变性、玻璃体出血、糖尿病性视网膜病变,和脉络膜新生血管形成;和(3)3个月内眼内手术的历史,葡萄膜炎,病理性近视(<−6.0度)、角膜或晶状体不透明的物。

所有的病人都接受intravitreal注射地塞米松intravitreal植入(0.7毫克,OZURDEX®,爱力根公司,都柏林,爱尔兰)。Intravitreal注射管理如前所述[16]。

2.7。结果评估

黄斑 扫描获得了八面体,在所有患者表现地塞米松植入术后一周。以下参数分析八面体AngioVue软件版本2017.1(美国Optovue Inc ., Fremont, CA),包括中央黄斑厚度和血管密度窝从中央凹)(0 - 1毫米直径,parafovea从中央凹)(1 - 3毫米直径,perifovea从中央凹)(3 - 5毫米直径,和视网膜中央凹无血管的区域的报道,以及肤浅的裸体机密图像板,板,视网膜外层板等。边界将手动调整的不精确的分层。《法兰克福汇报》面积,周长,视网膜中央凹血管密度在300μ米宽的《法兰克福汇报》(fd - 300)测量了八面体AngioVue软件。囊状的水肿和分析了SRF使用ImageJ版本1.46 r (RRID: SCR_003070、美国国立卫生研究院的贝塞斯达,医学博士,美国)。对裸体机密图像导入和血管造影图像,合并成一个单一的24位RGB彩色图像,分析ImageJ软件。HRF是手动计算的数量fovea-spanning水平快图片和记录三个板:视网膜表面的板,深板,外板。HRF被定义为hyperreflective点不到30岁μ米直径Bolz和他的同事报道(17]。

2.8。统计分析

所有的统计分析使用 软件,EmpowerStats version 2.0(美国X&Y solutions Inc .,波士顿,MA),和SPSS统计23.0版本(RRID: SCR_019096、IBM、芝加哥,美国)。BCVA的对数转换为最小的角分辨率(logMAR)当量进行分析。双向方差分析(方差分析)与图基的事后测试进行比较HRF在不同的板的数量。成对的学生的 - - - - - -测试是用来比较其他数值参数基线和post-injection之间的差异。皮尔森相关被用来评估视力和八面体特征之间的相关性。 值< 0.05被认为是显示显著差异。

3所示。结果

3.1。研究流程图

本研究包括两部分,即。生物信息学分析和临床研究。流程图如图1。生物信息学分析使用GSE101398数据集。筛选度之后去和KEGG富集分析,以及PPI网络建设,探索重大浓缩通路和基因参与RVO,聚焦在视网膜炎症的影响。GSEA和GSVA实施检测RVO中设置的重要基因。临床研究中执行11 RVO-ME首次治疗患者,接受单intravitreal注射地塞米松intravitreal植入。八面体用于获得各种成像特性包括中央黄斑厚度、血管密度、报道区域,HRF, SRF。


图1
本研究的简要流程图。:基因本体;KEGG:京都基因和基因组的百科全书;RVO:视网膜静脉阻塞;八面体:光学相干断层扫描血管造影。
3.2。识别度的激光RVO小鼠模型

总共有417度提取GSE101398基于定义的标准(图2(一个))。后采用org.Hs.eg.db 方案筛选基因小鼠和人类共享的,79度,包括53调节基因和26个表达下调基因被确定(图2 (b))。

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图2
识别RVO(度)的差异表达基因的小鼠模型。(一)火山块度提取GSE101398矩阵表达式。(b)的热图度共享的人类和小鼠的物种。
3.3。功能富集分析表明,参与RVO炎症相关的事件

如图3(一个)- - - - - -3 (d)浓缩分析表明,BP,度明显富集在接下来的流程,例如,白细胞游走,和附着力,应对甾类激素,和积极的调节白细胞激活和炎症反应,炎症相关(18]。CC,度明显丰富泡腔和颗粒内腔与细胞粘附和迁移19]。关于MF,度明显富集在细胞因子受体结合,趋化因子,生长因子与炎症相关的活动过程(20.]。

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图3
基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG) RVO富集分析。(a)泡沫情节说明在RVO浓缩度方面,包括生物过程(BP)、蜂窝组件(CC)和分子功能(MF)。(b) - (d) ClueGo度和丰富的网络BP (b)、CC (c),和MF (d)。(e)泡沫情节说明浓缩在RVO KEGG度的途径。(f) ClueGo度和丰富的网络KEGG通路。

KEGG通路富集的结果表明度主要富集在核转录因子(NF -κBκB)、肿瘤坏死因子(TNF)和缺氧诱导因子1 (HIF-1)信号通路在很大程度上与炎症级联(数据有关3 (e)和3 (f))。

3.4。GSEA和GSVA显示几个通路相关炎症参与RVO

进一步确定可能的分子或通路参与RVO GSEA应用比较RVO和正常视网膜样本。十个重要的途径,包括5调节和5表达下调,显示在数字4(一)- - - - - -4 (c)。纤维母细胞生长因子受体(FGFR) 1信号通路,FGFR-2信号通路,和γ-氨基丁酸(GABA)受体信号,此前据报道与炎症相关疾病(21- - - - - -24),被证明是显著调节RVO组,表明RVO与炎症的状态密切相关。

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图4
基因集富集分析(GSEA)和基因变异分析(GSVA) GSE101398数据集。(a, b) Multi-GSEA情节显示五个最重要的调节通路(a)和五个最重要的表达下调通路在GSE101398数据集(b)。(c)脊情节显示规范化浓缩得分(NES)以上十通路。(d) - (f)的热图GSVA结果显示GSVA分数的基因集(d), KEGG基因(e),和特征基因集(f)在GSE101398丰富。

GSVA进行评估的基因集富集样品使用非参数的策略。特征基因集,KEGG基因集,集包括GO_BP GO_CC, GO_MF子集作为参考。如数据所示4 (d)和4 (e)GSVA透露,RVO模型,显著调节通路与炎症相关的事件,如肿瘤坏死因子-αnf -κB信号,白介素6(白细胞介素6)信号,机械的雷帕霉素靶激酶complex1 (mTORC1) [25)信号,与GSEA结果一致。

3.5。PPI网络分析

度构造基于字符串的PPI网络数据库,并显示为一个集群组成的62个节点和255个边缘(图5(一个))。十个最边缘节点基因网络进行了探讨并显示在图中5 (b)。大多数的这些基因在炎症反应起着至关重要的作用。

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图5
蛋白质相互作用网络(PPI)。(a) PPI网络,包括62个节点和255年网络边缘,使用字符串构造数据库。十个节点(b)基因与最边缘的PPI网络。检索字符串:搜索工具的相互作用的基因;趋化因子配体1/2/5 CXCL1/2/5: C-X-C图案;CCL5:主题趋化因子配体5;E SERPINE1: serpin家庭成员1;MYC: MYC原癌基因;BHLH:转录因子;CCND1:细胞周期蛋白D1; PF4: platelet factor 4; C3: complement C3; CXCR2: C-X-C motif chemokine receptor 2.
3.6。临床特点

本研究为11 11 RVO-ME患者眼里,包括4例CRVO和BRVO的7例。其中11个眼睛,3例(27.27%)眼睛HRF在一板,2(18.18%)的眼睛在两板,HRF和6(54.55%)的眼睛在所有三个HRF板(视网膜表面板、深板和外板)。基线临床特点总结了11的眼睛在桌子上1。显著改善BCVA intravitreal注射后观察地塞米松intravitreal植入,也就是说, (基线logMAR vs。 (接受logMAR) ( )。所有患者的眼压在正常范围内,并在后续没有不良事件发生。

表1
11名患者的基线特征分类根据HRF分布在不同的板。
3.7。基线BCVA呈正相关,和黄斑厚度

如表所示2在基线,皮尔逊相关性表明BCVA呈正相关,区域公司、中央视网膜厚度,颞parafovea perifovea,鼻parafovea和perifovea parafovea伪劣。然而,基线BCVA之间没有相关性检测和HRF数,以及BCVA之间和囊状的水肿区。

表2
基线BCVA和基线八面体特征之间的相关性。
3.8。基线HRF数字是视网膜中央凹厚度呈负相关

如表所示3,HRF数字基线是视网膜中央凹厚度呈负相关,而之间不存在相关性HRF斑点的数量和其他地区。此外,囊状的水肿的面积和数量与基线HRF无关。

表3
基线HRF数之间的相关性和八面体特征。
3.9。Intravitreal注射地塞米松Intravitreal植入是有效减少HRF号码,囊状的水肿,区域

八面体,HRF数量的变化,囊状的水肿区,SRF面积进行了分析和比较RVO-ME患者基线和接受之间。如图6(一)后显著降低,HRF intravitreal注射地塞米松intravitreal植入。代表图像HRF见图7。此外,囊状的水肿面积显著下降 毫米2(基线) 毫米2(post-injection)(图6 (b))。此外,显著减少的区域被发现治疗后(图6 (c))。

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图6
地塞米松intravitreal植入对RVO-ME患者是有效的。HRF数量的变化(a),囊状的水肿区(b),和SRF区域(c)基线和接受之间的比较。
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图7
代表的图片我二次视网膜分支静脉阻塞(BRVO-ME)之前和之后intravitreal注射地塞米松intravitreal植入。(a)一个62岁的女性患者BRVO-ME。典型的囊状的观察水肿裸体机密图像和快八面体的形象。HRF(黄色箭头)和囊状的水肿(黄色星号)指出在快八面体的形象。(b)裸体机密和快的图像表现出非凡的囊状的水肿减轻,减少HRF(黄色箭头)治疗后。(c, d)合并图像血管显像仪和裸体机密图像(低)基线(c)和post-injection (d)。交叉区域的灰度值水平线条,由ImageJ生成软件,是显示(上)。HRF: hyperreflective疫源地。
3.10。视网膜血管密度和视网膜厚度改变后地塞米松Intravitreal植入治疗

我们进一步分析了视网膜血管密度,视网膜厚度,《法兰克福汇报》,《法兰克福汇报》周边,视网膜中央凹血管密度在300μ米宽的《法兰克福汇报》(fd - 300)。除了中央和上级perifovea面积,血管密度无显著差异被发现在其他地区治疗前后(图8(一个))。此外,多数黄斑区视网膜厚度显著减少除了劣质perifovea区域(图8 (b))。《法兰克福汇报》的统计显著增加(图8 (c)),而《法兰克福汇报》周边(图没有明显变化8 (d)(图)和fd - 3008 (e))被检测到。

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图8
对比船舶密度和其他相关参数。视网膜血管密度(a, b)的变化(a)和(b)视网膜厚度在不同地区的黄斑基线和post-injection之间。(c) - (e)的比较《法兰克福汇报》(c),《法兰克福汇报》(d)、和fd - 300 (e)基线和post-injection之间。ns:不显著;《法兰克福汇报》:视网膜中央凹无血管的区域;fd - 300:视网膜中央凹血管密度在300μ米宽的报道。

4所示。讨论

RVO,估计全世界有1640万年患病率(1),是第二个最常见的该人群糖尿病视网膜病变视网膜血管疾病后,由于没有有效的治疗方法为视网膜静脉闭塞。因此,目前的治疗,我和新血管形成等并发症,是非常重要的。vasopermeability细胞因子VEGF,被广泛用作RVO的一线疗法治疗。然而,每月intravitreal注射抗剂似乎不那么有效的随着时间的推移在少数患者,建议其他因素的参与,例如,炎症相关的因素,RVO的发病机理。因此,炎症的作用参与RVO已成为一个越来越感兴趣的话题。地塞米松治疗RVO-ME intravitreal植入了有利的结果;然而,类固醇诱导性复杂青光眼和白内障不容忽视(26]。因此,其他潜在的治疗靶点的识别RVO患者将受益。

由于更少的机会获得视网膜样本RVO患者高通量测序,动物模型模仿RVO似乎更实用的临床特点。例如,激光光凝术与曙红Y或玫瑰红光敏剂用于建立动物模型(7,27]。在我们的研究中,结合生物信息学分析显示差异基因在各种炎症活动丰富的基因表达分析激光RVO小鼠模型(GSE101398)。有趣的是,GSVA和KEGG分析发现,肿瘤坏死因子-α信号、规范促炎的旁分泌和内分泌调停人,RVO的一个重要途径。学前等人报道一个病人的情况下,中心凹厚度RVO-ME 8静脉注射英夫利昔单抗后下降了53.42%,肿瘤坏死因子-α抗体,而英夫利昔单抗的黄斑水肿在停药后复发,表明TNF -α炎症因子,参与RVO-ME[的发病机制28]。此外,肿瘤坏死因子-α证明是上游调节器的VEGF信号级联(29日,30.]和撒谎的相声血管增生和炎症,建议具体的封锁TNF -α将是一个不错的选择。

除了肿瘤坏死因子-αC-X-C主题趋化因子配体1(处于)拥有最边缘的PPI网络,可能是另一个潜在的目标。处于是一种趋化因子分泌免疫和多发地细胞(31日]。处于促进炎症反应通过交互C-X-C主题趋化因子受体(CXCR) 1和受体CXCR2 [32]。处于也对血管生成的影响通过调节VEGF-A表达式(33]。集体提供针对生物信息学分析作为一个潜在的治疗RVO视网膜炎症。

HRF最初描述的糖尿病黄斑水肿(测距装置)病人,显示高度反光的点在光谱domain-OCT图像(17]。以前的出版物猜测HRF可能对应于活化的小胶质细胞(34- - - - - -36)并提出HRF炎症的生物标志物在年龄相关性黄斑变性患者37和测距装置38]。之间的相关性研究基线BCVA HRF数字显示有争议的结果。赖et al。39)和西格尔et al。40]发现贫困患者BCVA HRF更多,而其他人没有得到这个结论(36,41- - - - - -43]。在我们的研究中,没有发现相关基线BCVA和HRF之间通过皮尔逊相关分析,但HRF的数量明显减少,BCVA改善在收到intravitreal注射地塞米松intravitreal植入,表明地塞米松抑制小胶质细胞的抗炎效果。

正如前面提到的,我的是视网膜中央窝周围的流体积累的结果(44]。流体积累可能是细胞外的形式(导致囊状的水肿的形成空间),细胞内(导致Muller细胞的肿胀),或视网膜下(导致视网膜下的累积空间)。Muller细胞的细胞内水肿,改变细胞离子分配,形成囊状的空间八面体图像,大大有助于我。王等人。45]发现之初可以减轻Muller细胞细胞内水肿糖尿病条件下通过upregulation K+频道4.1 (Kir4.1)和水通道蛋白4与VEGF-A绑定。糖皮质激素应用于减轻细胞外和细胞内水肿,因此改善临床结果急性缺血性中风后(46]。在目前的研究中,显著减少后的囊状的空间观察地塞米松治疗,表明地塞米松intravitreal植入穆勒在缓解神经胶质细胞内水肿可能是有益的。

视网膜下积液经常与RPE障碍和外部同事马上回来崩溃。底层机制可能是炎症相关的细胞因子和因素,如肿瘤坏死因子-α和NF -κB,是调节,导致炎症反应和RPE的障碍47]。在这项研究中,发现视网膜下液的重要消耗intravitreal注射地塞米松intravitreal植入后,表明地塞米松可能有助于保护RPE的功能。综上所述,我们假设在RVO视网膜炎症调节,导致小胶质细胞激活(HRF),穆勒胶质细胞内水肿(囊状的水肿),和RPE功能障碍(SRF)由八面体作为证据。地塞米松intravitreal植入可以扭转这种不利影响视网膜炎症(图9)。


图9
原理图描绘了视网膜炎症参与RVO-ME,和地塞米松intravitreal植入是有效减轻炎症和改善临床结果。HRF(黄色箭头),囊状的水肿,视网膜下液(黄色星号)。

有一些限制在当前的研究中。首先,提出的两个目标:TNF -α基于公共数据库和分析了CXCL5和缺乏动物模型验证。第二,临床研究的样本量相对较小,可能影响结果进行了比较。最后,囊状的水肿空间是三维的。但是由于方法论问题,我们只有量化的面积最大的部分快形象。

5。结论

视网膜炎症在RVO发病机制中扮演着重要的作用,引起崩溃马上回来,小胶质细胞激活,穆勒胶质细胞内水肿,和RPE功能障碍,这可能是评估在八面体成像生物标志物。因此,抗炎治疗建议发起RVO-ME的诊断后不久,和八面体特征可以作为治疗生物标志物。

数据可用性

所有相关数据已经提交的手稿。请求或数据可以解决的问题(电子邮件保护)或(电子邮件保护)。

的利益冲突

作者都没有冲突要申报的东西。

确认

本研究upported由国家重点研发项目(2017 yfa0105301),中国国家自然科学基金(82171062、82171062和82171062),上海医院发展中心(SHDC2020CR2040B),上海市科学技术委员会(19495800700),培养计划的国家自然科学基金杰出青年(20202 zdb01014)和关键程序江西省青年科学基金(20202 acbl216009)。