RNA结合基序蛋白11（RBM11）作为一种预后生物标志物，促进卵巢癌的进展

摘要

卵巢癌是女性最致命的妇科恶性肿瘤之一。由于缺乏有效的靶向治疗，晚期卵巢癌患者的总体生存率仍然很低。阐明决定卵巢癌进展的分子机制对于开发新的治疗药物至关重要。在这里，我们发现RNA结合基序蛋白11（RBM11）与正常卵巢相比，卵巢癌组织中RBM11的表达高度升高，而卵巢癌细胞中RBM11的缺失导致细胞生长和侵袭受损。此外，在A2780卵巢癌异种移植模型中，RBM11的敲除也阻碍了肿瘤的生长。机械上，我们发现RBM11正调控Akt/mTOR信号通路因此，这些结果表明RBM11是一种新的致癌蛋白和卵巢癌预后生物标志物。

1.导言

卵巢癌是女性妇科肿瘤死亡的主要原因之一，每年诊断出超过300000例新的卵巢癌病例[1.]尽管癌症研究进展迅速，但卵巢癌的五年生存率仍然很低（<47%），因为其进展迅速且经常复发[2.,3.]了解卵巢癌进展的机制和识别决定卵巢癌恶性程度的新分子开关对于开发这种致命疾病的新疗法至关重要。

RNA结合蛋白(rbp)是与RNA分子结合并参与RNA功能转录后控制的蛋白质[4.–6.]．rbp在各种细胞过程中发挥重要作用，如RNA剪接、RNA稳定、RNA运输、RNA定位和RNA修饰[7.,8.]已有超过2000种蛋白质被鉴定与RNA转录物相互作用，被认为是RBPs。RBPs参与多种生理和病理过程，包括发育、代谢、增殖、多能性、肿瘤和免疫[9–11]近年来，RBPs在癌症中的作用已被广泛研究[6.]在不同的人类癌症中，RBPs可能发挥致癌或肿瘤抑制作用[12]．例如，rna结合蛋白Nova1和NELFE促进肝细胞癌(HCC)细胞的肿瘤生长[13,14]，而RBM47和RBM43已被证明可抑制HCC生长[15,16]．

RNA结合基序蛋白11（RBM11）是一种在氨基末端（N末端）含有RNA识别基序（RRM）的RNA剪接因子，其表达已在多个正常人体组织中观察到，包括大脑、睾丸和脾脏[17]．虽然RBM11的生理功能尚未被明确定义，但由于其21号染色体的位置，它被认为与唐氏综合征有关[17]最近，在胶质母细胞瘤中观察到RBM11蛋白水平上调，RBM11可促进胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭在体外和体内［18]尽管如此，RBM11在胶质母细胞瘤以外的其他癌症类型中的致癌作用仍需进一步研究。在这里，我们研究了RBM11在卵巢癌中的功能，发现RBM11在卵巢癌组织中过度表达，并通过激活Akt/mTOR信号在卵巢癌中发挥致癌作用。因此，这些结果ts证明RBM11是癌症中的致癌蛋白。

2.材料和方法

2.1.细胞培养和转染

人卵巢癌细胞A2780和OVCAR-3从美国类型培养物收集中心（ATCC）获得，并在罗斯维尔公园纪念研究所（RPMI-）1640培养基中培养，添加10%胎牛血清（FBS；Hyclone）.细胞每两个月检测一次支原体污染。根据制造商的说明，使用lipofectamine 3000试剂（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）将质粒DNA转染细胞。

2．2.质粒和抗体

RBM11和对照shrna购自Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)，其靶向序列如下:RBM11 shrna -1,5 -GTT CCG AAA GTC TAA GAA GAA-3 ;RBM11 shRNA-2,5 -CCC AGC TCA TAT AAA TGG ACT-3 .flag-RBM11质粒购于中国生物股份有限公司(中国北京)。抗rbm11 (17220-1-AP)抗体购自Proteintech公司(中国武汉)，抗pakt S473(#9271)、抗akt(#4691)、抗pmtor S2448(#5536)、抗mtor(#2972)抗体购自Cell Signaling Technology公司(Beverly, MA, USA)。反β-肌动蛋白（sc-47778）和抗flag（sc-166355）抗体购自圣克鲁斯生物技术公司（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）。

2.3. 稳定RBM11基因敲除细胞的建立

用lipofectamine 3000转染试剂将RBM11 shRNA与慢病毒包装载体psPAX2和pCMV-VSV-G共转染293FT细胞。转染72h后，离心收集含病毒培养液上清。用慢病毒感染OVCAR-3和A2780细胞μ聚凝胺的g / ml。经嘌呤霉素筛选后，通过western blot验证RBM11的抑制作用。

２.４.集落形成实验

将表达对照或RBM11 shRNA的细胞接种于6孔板，密度为 细胞每口井。细胞培养10天;固定无性系，用0.5%结晶紫染色，在20%甲醇中计数菌落数。相对集落形成的百分比以标准化细胞表达对照shRNA。

2.5.跨井侵入试验

transwell插入器(Corning, NY, USA)的上腔室用基质凝胶(1:10稀释)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)在37℃下涂敷1小时。细胞饥饿24小时后，在采摘和悬挂 /ml，无血清培养基。然后,200年μL细胞悬液被播种到基质包被的插入腔上部。底部的插入腔被放置在一个24孔的500孔板中μl培养基含有10%胎牛血清。37℃培养24 h后，取出插入的transwell，用棉签擦拭上膜上的细胞，用20%甲醇中结晶紫染色并计数。

2.6。异种移植肿瘤的生长

肿瘤异种移植的建立如前所述[19简要介绍4～6周雌性裸小鼠取自GePHOMATECH（南京，中国），所有动物实验均获西安交通大学第一附属医院动物护理与使用委员会批准，A27 80异种移植物已获报道。20];简单地说, 将表达对照或RBM11 shRNA的A2780细胞皮下植入小鼠侧翼。监测肿瘤生长，肿瘤长度( )和宽度( )每5天测量一次，肿瘤体积( )由公式计算 .

2.7。免疫组织化学分析

卵巢癌组织及癌旁正常卵巢组织购自中国西安Alenabio公司。肿瘤切片首先用100%二甲苯去脂，然后用梯度乙醇复水(100%，95%，70%，30%，0%)。用3% H钝化内源过氧化物酶_2.O_2.根据制造商的说明，使用R.T.U Vectastain试剂盒（Vector Laboratories，Burlingame，CA）对热诱导回收抗原进行IHC染色。Ki67（abcam，ab15580）抗体稀释至1 : Ki67阳性细胞的百分比由三个不同的区域确定。

2.8.蛋白质印迹分析

如前所述进行Western blot。简单地说，细胞裂解物中的蛋白质在SDS-PAGE上解析，并在电泳后转移到PVDF膜上。在PBS中5%的牛奶中封闭后，膜依次与第一抗体和第二抗体孵育，随后通过增强化学发光（ECL）进行条带检测使用穿孔™ ECL蛋白质印迹底物（GE Healthcare Bio Sciences）。

2.9.统计分析

双面未配对的学生 -测试用于计算差异的统计显著性。结果在 .所有数据显示为 (S.D.)，从至少三个复制。

3.后果

3.1.RBM11在卵巢癌组织中过度表达

RBM11已被证明在胶质母细胞瘤细胞中发挥致癌作用[18];为了研究RBM11在卵巢癌中的作用，我们首先从癌症基因组图谱(TCGA)数据库中检测了RBM11 mRNA的表达及其在卵巢癌组织中的基因拷贝数，发现尽管RBM11拷贝数不常被扩增，但RBM11 mRNA在卵巢癌组织中的表达水平很高(图)1（a）及补充数字1.)为了进一步验证卵巢癌组织中的RBM11蛋白水平，我们进行了免疫组织化学（IHC）染色，结果如下（图1（b）和1 (c))显示与正常卵巢相比，RBM11蛋白在卵巢癌组织中明显过表达。此外，高水平的RBM11与卵巢癌患者的低生存率相关(图)1 (d)）.

３．２．RBM11促进卵巢癌细胞生长

为了检测RBM11在卵巢癌进展中的作用，我们使用针对RBM11编码区的两个不同的shRNA下调了卵巢癌细胞中RBM11的表达，包括OVCAR-3和A2780(图)2(一个))有趣的是，我们发现RBM11的沉默显著抑制了OVCAR-3和A2780细胞的生长（图2（b）)此外，克隆形成试验还进一步显示，RBM11的缺失显著降低了OVCAR-3和A2780细胞的集落形成能力（图2（c）)这些结果表明RBM11是卵巢癌细胞增殖所必需的在体外.

３．３．RBM11增强卵巢癌侵袭

除了增殖之外，癌细胞的侵袭能力也是影响癌症患者预后的重要因素。因此，我们进行了transwell分析，以评估RBM11在卵巢癌侵袭中的作用，如图所示3（a）；表达RBM11 shRNA的侵袭OVCAR-3和A2780细胞的数量明显少于表达对照（ctrl）shRNA的细胞。为了进一步证实RBM11对卵巢细胞侵袭的影响，我们将标记有flag的RBM11异位表达到OVCAR-3和A2780细胞中（图3 (b)）.同样，过表达flag-RBM11可显著增强细胞侵袭(图)3 (c))因此，这些结果表明RBM11对卵巢癌的侵袭和转移也是必不可少的。

3.4.RBM11增强卵巢癌细胞中Akt/mTOR的激活

Akt作为卵巢癌细胞中最常激活的信号通路之一，在卵巢癌的增殖和侵袭中起关键作用[21]．Akt通常被磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)激活，并通过mTOR激活下游信号，促进参与细胞增殖和侵袭的靶基因的翻译[22]．为了探索RBM11在卵巢癌细胞中发挥致癌作用的分子机制，我们检测了RBM11是否影响Akt信号通路。如图所示4(一)，我们检测到表达RBM11 shRNA的细胞中Akt磷酸化和mTOR磷酸化显著降低，这表明RBM11可能正调控Akt信号激活。为了进一步证实RBM11在Akt信号中的作用，外源性RBM11在OVCAR-3和A2780细胞中异位表达（图4（b）)与RBM11基因敲除一致，RBM11的过度表达导致Akt的磷酸化和mTOR的磷酸化增加（图4（c）)这些结果表明RBM11通过刺激Akt/mTOR信号通路促进卵巢癌的进展。

3.5.RBM11基因敲除抑制卵巢癌生长体内

验证RBM11在卵巢癌中的致癌作用体内，我们用表达对照（ctrl）或RBM11 shRNA的A2780细胞构建异种移植模型在体外结果，我们发现在A2780异种移植模型中，RBM11基因敲除显著抑制肿瘤生长（图5（a）)同时，与表达对照shRNA的肿瘤相比，RBM11基因敲除的A2780异种移植肿瘤中Ki67蛋白水平（一种明确的增殖标记物）显著降低（图5 (b))因此，这些结果表明RBM11促进卵巢癌生长体内.

4.讨论

卵巢癌是妇科恶性肿瘤的主要致死原因。虽然早期诊断预后较好，但大多数卵巢癌患者在晚期发现时5年生存率仅为30-40% [1.]．目前高级别上皮性卵巢癌患者的一线治疗主要是手术后加卡铂、紫杉醇等传统化疗[3.]除化疗外，在晚期卵巢癌患者的维持治疗中，PARP抑制剂如奥拉帕利和鲁加帕利显示出良好的疗效[23];然而，PARP抑制剂只批准和有效的BRCA1/2突变患者，占不到40%的卵巢癌病例[24]因此，迫切需要为高级别卵巢癌患者开发新的靶向治疗。在本研究中，我们发现RBM11在卵巢癌组织中特别表达，但在正常卵巢组织中不表达，这表明RBM11是未来卵巢癌治疗药物设计的可行靶点。然而，作为药物相互作用口袋的RBM11的功能域需要进一步鉴定。

RNA代谢的调节对于维持正常的细胞和生理环境非常重要。RNA结合蛋白（RBPs）通过选择性剪接参与转录组的转录后控制[25]，RNA修饰[26和RNA稳定性[4.]．越来越多的证据表明，RBP功能异常导致的RNA代谢异常在发育中起着至关重要的作用[27]，豁免权[9]，以及神经功能[28，以及癌症进展[9,12,23]．然而，这组蛋白在卵巢癌中的作用却鲜有报道。在这项研究中，我们发现了一种通过RBM11调控卵巢癌进展的新机制。RBM11增强卵巢癌的增殖和侵袭在体外和体内强调了RBP在卵巢癌进展中的重要性。

在rna结合蛋白的成员中，RBM11的生化和生理功能尚未明确。此前有报道称，RBM11蛋白在胶质母细胞瘤组织中上调，促进胶质母细胞瘤细胞进展[18]然而，RBM11在癌细胞中致癌作用的潜在机制尚未确定。在我们目前的研究中，我们研究了RBM11在卵巢癌中的功能。与胶质母细胞瘤研究一致，我们还发现RBM11在卵巢癌组织中高度升高，并正调节卵巢癌的生长和分化此外，我们证明RBM11影响Akt/mTOR信号通路，这为RBM11促进癌细胞进展提供了证据和解释。

5.结论

RBM11在卵巢癌组织中升高，通过激活Akt/mTOR信号通路促进卵巢癌生长和侵袭。我们的发现确定了RBPs在卵巢癌进展中的功能作用，并为卵巢癌治疗提供了一个新的分子靶点。

数据可用性

用于支持本研究结果的所有数据均包含在文章中，并可根据相应作者的要求提供。

的利益冲突

作者声明，他们没有已知的可能影响本文所述工作的相互竞争的经济利益或个人关系。

作者的贡献

C.F和Z.M构思并设计了实验。C.F、M.Y、G.L、X.Z和W.C进行了实验并分析了结果。Z.M撰写了手稿。J.S修改了手稿。所有作者都阅读并批准了最终手稿的内容。

致谢

本研究由西安交通大学第一附属医院基础研究基金资助。

补充材料

补充图S1:使用UCSC Xena在线软件分析TCGA卵巢癌数据库中RBM11拷贝数(https://xena.ucsc.edu/）.(补充材料)

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