ANGPTL3过表达通过Wnt/抑制肾细胞癌致癌特性的发展β-Catenin信号通路并预测良好的预后

摘要

据报道，血管翅蛋白样3（Angptl3）参与新的血管生长，以表现在许多不同癌症中的ABNROAMA1表达。然而，很少报道Angptl3肾细胞癌（RCC）的表达模式和功能。在该研究中，我们观察到，AngptL3表达在来自TCGA数据集和细胞系的rcc标本中明显下调。存活测定还揭示了患有低安普拉3表达的患者表现出较短的整体存活率和无病的存活率，而不是具有高安普拉表达的患者。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定，菌落形成测定和流式细胞术显示，Angptl3的过度表达明显抑制了RCC细胞的增殖，并促进了凋亡。Transwell测定和伤口愈合测定显示，Angptl3上调抑制了RCC细胞的迁移和侵袭。然后，我们探讨了安普尔3的失效量是否影响了WNT /的改变/β- 使用顶部/ FOP闪存报告器测定和Western印迹的卡替素信号传导。结果表明，Angptl3的过表达明显抑制了Wnt /的活性/β-总的来说，我们的结果证实ANGPTL3的过度表达与RCC患者的恶性程度和良好预后有关，并且ANGPTL3的上调通过Wnt抑制肿瘤的增殖和转移/β-ANGPTL3可能是RCC患者的一个新的治疗靶点和预后生物标志物。

1.介绍

肾细胞癌（RCC）占成人肿瘤的4%以上，是成人最常见的肾脏恶性肿瘤，死亡率约为45%[1.,2.].肾细胞癌的最大亚型是透明细胞癌（>70%）[3.］.RCC包括几种具有明显生物特征和临床结果的组织学亚型[4.].早期发现对肾细胞癌患者的长期生存有显著益处，诊断为器官局限性疾病的患者的五年生存率>85%[5.–7.]然而，对于转移阳性的患者，5年生存率仅为10%左右[8.］.因此，对于这种侵略性恶性肿瘤，对新的生物标志物和有针对性的疗法进行了重要意义。

血管生成素样蛋白3（ANGPTL3）位于1p31.3上，也称为血管生成素-5，与脂质代谢紊乱密切相关[9］.ANGPTL3的功能由c端纤维蛋白原样结构域定义，该结构域已被证实通过调节Tie2受体发挥调节功能[10］.上述功能允许ANGPTL3增强血管生成中涉及的几个基本事件[11]近年来，越来越多的研究表明，ANGPTL3在调节各种生命活动中起着关键作用，如造血功能、血管生成和脂质代谢[12,13]此外，据报道，一些病理变化，如肝脏疾病、糖尿病、癌变和动脉粥样硬化，也受到ANGPTL3失调的调节[14–16］.近年来，越来越多的研究证实ANGPTL3在几种类型的肿瘤中表达失调，并对肿瘤的发生发展具有调节作用[17–19]这些发现提示ANGPTL3是肿瘤患者的一种新的生物标记物和治疗靶点。

此前研究发现ANGPTL3在RCC中低表达，并通过抑制VASP磷酸化抑制RCC细胞的转移[20］.此外，证明了Angptl3可以通过抑制FAK介导的P53泛素化来调节Sorafenib在RCC中的敏感性[21]然而，关于ANGPTL3在肾细胞癌中的表达模式、功能和潜在机制的报道很少。在本研究中，进一步的证据表明ANGPTL3在肾细胞癌中的表达降低。然后，我们进一步探讨了ANGPTL3在肾癌进展中的肿瘤相关功能和分子机制。

2.材料和方法

2.1.细胞培养和转染

人肾小管上皮细胞系(HK-2)和人RCC细胞系(786-O, Caki-1, A498)均购自中国上海细胞研究所。DMEM含10% (v/v)胎牛血清，100 U/ml青霉素，100μ.使用G / mL链霉素用于维持细胞，在湿润5％CO中培养_2.在37°C的大气中。细胞在80%至90%的融合率下传代培养。为了在RCC细胞中表达ANGPTL3，对ANGPTL3的表达质粒进行PCR扩增并亚克隆到pcDNA3.1载体（中国湖北武汉宜浦PPL50117-2a）中.使用空pcDNA 3.1载体作为对照。根据制造商的协议，使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市赛默飞世尔科技公司）转染ANGPTL3。

2.2. 总RNA的提取及qRT-PCR

用1mL Trizol（Invitrogen）提取总RNA，并通过Primescript RT试剂盒（Takara，杭州，中国）逆转到CDNA的总RNA。基于产品指南，应用PRIME SCRIPT-RT试剂盒和SYBR预混物extaq（Takara，浙江，中国）以进行PCR测定，以检测Angptl3表达。引物如图所示：Angptl3意义：5'- attttagccaatggcctccttc-3';Angptl3反义：5'- ctggtttgcagccgatagatcata-3';GAPDH感觉：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTAC-3';GAPDH反义：5'-agggggccatccacagtctcca-3'。使用2评估数据^{-ΔΔ计算机断层扫描}方法。

2．3.CCK-8化验

为了评估细胞增殖，使用细胞计数Kit-8（CCK-8）（CCK-8）（Dojindo，Japan）。在96孔板上接种的过表达转染的786-O和A498细胞，培养为0h，24小时，48小时，72小时，96小时。在特殊点及时，共10次 μ.将CCK-8 regent（Sigma，中国广东深圳）的l添加到相应的孔中，然后在450℃下培养6小时 纳米波长，使用微型平板阅读器检查OD。

2.4.菌落形成试验

A 3.5 cm细胞培养皿（康宁，成都，四川，中国）用于接种细胞 μ.每2天向培养皿中添加含有10%FBS的L DMEM，作为挥发到培养箱中的培养基。2周后，菌落肉眼可见。接下来，使用95%甲醇固定细胞，并使用甲基紫（C0089，宝曼生物，徐汇，上海，中国）进一步染色。在IX71倒置显微镜下，我们的研究组计数肿瘤集落（>50个细胞）。

2.5。细胞凋亡测定

通过FACScan流式细胞仪（BD Biosciences，中国）检测细胞凋亡，用碘化丙啶（PI）和膜联蛋白V（BestBio，中国）对收集的细胞进行染色。

2.6.Transwell分析

24间孔板Boyden腔室带有8个孔膜 μ. m用于786-O和A498.40的侵袭试验检测 μ.l Mattigel用于涂覆膜。1×10^4.细胞放置在每个Transwell. 0.5的上腔室μ. 将g/mL培养基添加到下Boyden腔。24小时后，我们清除未侵入的细胞。随后，我们固定过滤器，然后应用结晶紫染色进行染色。应用倒置显微镜对细胞进行计算。

2.7.伤口愈合试验

六孔板用于孵育细胞。当细胞粘附达到85％时，一个10 μ.L无菌移液管尖端用于划伤蜂窝层。在旧培养基被遗弃后，使用PBS用于清洗梭菌细胞。伤口倾向的时间被认为是0h，并且施加具有相机的显微镜用于伤口闭合照片。imagej 1.50v用于量化迁移单元格所涵盖的区域。所有实验均在3次重复。

2.8.TOPFlash荧光素酶分析

将细胞种植在24孔板中。Wnt/β-Catenin topflash质粒（yiqiao生物学，Yizhuang，北京，中国）和突变体Fopflash质粒（Addgene，Cambridge，Ma，U.S.A.）和Renilla Tk-Luciferase Vector（Promega，Haidian，北京，中国）一起被转移到细胞中。随后，应用荧光素酶检测试剂盒（Promega，Haidian，北京，中国）评估细胞荧光素酶活性。

2.9.蛋白质印迹分析

通过使用RIPA缓冲液收集细胞总蛋白，并使用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白相关浓度，通过SDS/PAGE分离相同数量的蛋白并转移至0.22 μ.m pvdf膜。在孵化之前β-catenin, cyclin D1和C-myc在4°C过夜，这些膜被阻断。然后用酶标抗小鼠或-兔二抗在室温下孵育1 h。ECL试剂盒观察蛋白带。

2.10。统计分析

GraphPad Prism 5用于统计分析。数据以平均值表示 ± 采用SD学生t检验比较各组之间的差异 <0.05有统计学意义。

3.结果

3.1. 肾细胞癌中高水平的ANGPTL3及其预后价值

为了筛选可能参与肾细胞癌进展的功能调节因子，我们搜索了“GEPIA”（一种分析TCGA数据集的在线工具）[22]发现与非肿瘤肾标本相比，肾细胞癌标本中ANGPTL3的表达明显降低（图1（a）)．然后，我们对RCC细胞株进行RT-PCR，发现与HK-2细胞相比，RCC细胞中ANGPTL3水平明显降低(图)1（b）)．通过分析TGCA数据集(515例RCC患者)的生存数据，探讨ANGPTL3在RCC中的预后价值。结果显示，ANGPTL3表达高的患者总生存期较短(p =0.0014，图1（c）)无病生存率（p =0.00084，图1（d）)与ANGPTL3表达较低的患者相比。我们的发现提示ANGPTL3是肾细胞癌预后相关的调节因子。

3.2. ANGPTL3的过度表达抑制了肾细胞癌细胞的增殖和转移

然后，进行功能增益分析，以确定ANGPTL3上调是否影响RCC能力。通过使用pcDNA-ANGPTL3，ANGPTL3在A498和786-O细胞中过度表达，RT-PCR证实了这一点（图2（a）)．CCK-8检测结果显示，pcDNA-ANGPTL3转染的A498和786-O细胞在450nm处的OD值明显低于空载体转染的细胞(图)2（b）).菌落形成试验也证实ANGPTL3过表达明显增加了菌落数量（图2（c）)．流式细胞术的结果表明，与空载体转染的RCC细胞相比，Angptl3过表达786-O和A498细胞显示凋亡率增加（图2 (d))．此外，为了探讨Angptl3对RCC细胞转移能力的影响，进行伤口愈合测定和Transwell测定。如图所示3(一个)，我们观察到用PCDNA-Angptl3转染的RCC细胞的迁移比明显减少，而不是用空载体转染的那些。此外，还观察到Angpt13的过表达以减少侵入性细胞的数量（图3 (b))．总体而言，我们的研究结果表明，Angptl3在RCC中用作肿瘤促进剂。

3.3.ANGPTL3的过度表达抑制Wnt的活性/β-连环蛋白途径

为了研究Angptl3在RCC进展中的机制，我们深入研究了WNT /的功能β-RCC细胞中的连环蛋白途径。我们首先使用786-O细胞进行TOP/FOP flash reporter分析。我们的数据显示，与空载体转染的RCC细胞相比，pcDNA-ANGPTL3过表达的RCC细胞的荧光素酶活性明显降低（图4（a）)然后，我们进行RT-PCR以研究ANGPTL3过度表达对Wnt的影响/β-观察到ANGPTL3过表达明显抑制Wnt相关蛋白的表达（A498和786-O细胞中的Cycline D1、c-myc、B-Caternin）（图4（b）)western blot分析也证明了这一点（图4（c）)．我们的研究结果表明Angptl3可以通过调制Wnt /来表现出RCC中的致癌作用β-连环蛋白途径。

4。讨论

肾癌发病率在过去20年里一直在增加[23].目前的治疗工具对早期诊断的患者有效，但对晚期患者的治疗选择有限[24,25］.为了改善肾细胞癌患者的预后，研究肾细胞癌的预后因素尤为重要，因为这些预测因素有助于指导临床治疗[26,27］.在本研究中，我们发现TGCA数据集标本和细胞系中ANGPTL3水平下调。此前，在卵巢癌中也观察到ANGPTL3明显下调。然而，在口腔癌、食管癌和肝癌中均可观察到其表达上调，表明其在肿瘤发展中的多样性[18,19,28］.我们分析了TCGA数据集以研究rCC患者的Angptl3的预后价值，发现具有较高的Angpt13表达的患者表现出较短的rcc患者的OS和DFS。对于RCC患者，Angptl3可以是一种新的预后生物标志物。然而，需要具有存活测定的更多临床样品来深入探索RCC患者ANGPTL3的预后价值。

近年来，许多研究揭示了ANGPTL3在肿瘤进展中的作用。例如，通过ROC分析发现ANGPTL3在口腔癌中表现出较高水平，具有潜在的诊断价值。在功能上，ANGPTL3的敲低显示通过激活ERK/MAPK途径抑制口腔癌细胞的增殖[18]Yu博士和他的研究小组报告说，ANGPTL3在肝细胞癌中过度表达。他们观察到，ANGPTL3的下调抑制了细胞增殖，减少了肝细胞癌细胞的侵袭[29］.这些发现表明Angptl3作为上述肿瘤中的癌基因。然而，Zhao等人之前的研究。据报道，Angptl3的过度表达导致rcc细胞转移的明显避免[20］.在这项研究中，我们还发现Angptl3过表达抑制RCC细胞的活性，例如增殖，迁移和侵袭。这些发现与以前的发现一致。

Wnt信号通路是包括胚胎发育、分化、增殖和成体组织维持在内的多种生物学进展的关键调控通路[30]在多种肿瘤中发现Wnt信号过度激活，使细胞具有增强致瘤性、持续增殖和增强转移潜能的能力[31,32].Wnt/β-catenin信号通路在RCC发病机制中非常重要[33］.在这项研究中，我们使用了顶级/ FOP闪存报告器测定，证实了Angptl3的过表达抑制了Wnt /的激活β-catenin信号传导。然后，我们检查了Angptl3失效对Wnt /的影响β连环蛋白信号通路，发现ANGPTL3的过度表达抑制c-myc、细胞周期蛋白D1和β-我们的发现提示ANGPTL3可能通过调节Wnt发挥致癌作用/βCatenin信号传导。

5.结论

总之，ANGPTL3在肾细胞癌中低表达，并预测肾细胞癌患者预后不良。ANGPTL3的过度表达通过抑制Wnt抑制肾细胞癌的进展/β连环蛋白信号。这项研究揭示了ANGPTL3在肾细胞癌发展中的重要意义。然而，需要更多的标本来进一步证实我们的发现，并且ANGPTL3功能的潜在机制需要进一步研究。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从相应作者处获得。

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

张玉建，曹启峰:研究概念与设计，进行实验，准备手稿，获得资助。张玉建，张林，冯飞:进行实验，数据分析，数据准备。曹启峰:研究设计，获得资助。所有的作者阅读并批准了最终的手稿。张玉建、张林对这一工作做出了同样的贡献。

致谢

这项工作得到了大丰人民医院医学基金会的资助（SA-082-2019号）。

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