文摘
背景。有证据表明,免疫系统起着关键关键作用在心肌梗死(MI)的发病机制。然而,与免疫相关的确切机制还没有系统地揭示。方法。本研究使用加权基因coexpression网络分析(WGCNA)和CIBERSORT算法分析MI表达基因表达数据综合数据库,然后识别模块与免疫细胞浸润有关。此外,我们建立了coexpression网络和蛋白质相互作用网络分析来识别基因中心。此外,中心基因之间的关系和NK细胞休息GSE123342验证通过使用另一个数据集。最后,接受者操作特征(ROC)曲线分析被用来评估中心验证基因的诊断价值。结果。单核细胞和中性粒细胞明显增加,T细胞CD8 T细胞CD4天真,CD4记忆T细胞休息,休息和NK细胞明显减少心肌梗死组与稳定冠状动脉疾病(CAD)组。WGCNA结果表明,粉红色的模型相关性最高的NK细胞休息渗透水平。我们确定了11个中心与NK细胞基因的表达相关休息渗透水平,其中7中心基因(NKG7、TBX21 PRF1, CD247, KLRD1, FASLG,和加工)在GSE123342成功验证。这些7基因诊断价值区分MI和稳定的CAD。结论。NKG7、TBX21 PRF1、CD247 KLRD1, FASLG,加工可能是一个诊断的生物标志物和治疗目标与NK细胞渗透在MI休息。
1。介绍
心肌梗死(MI)是心脏事件和最严重的表现仍然是全球死亡率的主要原因(1]。它会导致心肌细胞的损失,左心室重构、心功能下降,和潜在的心脏衰竭。心肌梗死与多种因素有关,包括性别、年龄、吸烟、高血压和糖尿病并发症(2]。微阵列是一种广泛使用的战略分析检测的新生物标志物诊断、预测疾病的严重程度,确定新的药物靶点3]。目前,许多研究发现生物标志物,基于微阵列分析法区分MI与正常对照组和RNA序列。例如,几个循环基因(MAX、BCL3 NCOA7 CCL5, GTF3C2,等等)是潜在的生物标记物,区分MI和正常对照组和可能扮演了一个重要的角色在MI发展(4]。赵等人发现,八个基因,IFIT3, mx₁, HLA-DQA1, RORA基因,PTGDS, CRIP2, COL6A2, S100P,可能被视为生物标志物MI和正常对照组之间。冠状动脉疾病(CAD)是心血管疾病的主要类型,导致全球(沉重的经济和社会负担5]。心肌梗死是一种最严重的表现稳定的CAD和从全球非传染性的疾病死亡的主要原因。据我们所知,很少有研究探讨生物标志物,区分MI和稳定的CAD。那里,它是一个迫切需要新的生物标志物之间实现早期诊断敏感性和特异性高的MI和稳定的CAD。
浸润细胞表现出特定的时空分布和活动模式,同时参与活动,相互连续的相声和其他心肌细胞心肌细胞(6]。这形成了一个高度复杂的监管模式,起了至关重要的作用在心肌梗死后心脏的正常愈合(7,8]。炎症过程也能导致肥大、纤维化和其他类型的心脏损伤可以导致心脏衰竭(9]。心肌梗死引起无菌性炎症,表现为招聘和先天和适应性免疫系统细胞的激活6]。因此,免疫调节疗法有很大潜力在加速心脏修复和改善心肌梗死后左室重构。为了找到最佳的免疫调节治疗,有必要揭示MI后免疫细胞积累的时序动态。在以前的研究中,免疫组织化学方法检测免疫细胞依赖一个标记来识别特定子集的免疫细胞,但获得可怜的免疫组织化学结果时发现了少量的细胞或细胞类型可能有错误(10- - - - - -12]。因此,全面了解MI和稳定的CAD之间的免疫反应是必要的。
广泛应用和生物信息学技术的不断发展,许多算法被开发了发现新的生物标记(13]。加权基因coexpression网络分析(WGCNA)是系统生物学方法,广泛用于建筑coexpression模块和寻找生物标记基因在转录水平(14,15]。最近,一种新型反褶积算法,称为程控鉴定评估相对子集的RNA转录(CIBERSORT),建立用于近似免疫细胞的细胞组成。这个分析工具被应用于量化的免疫细胞浸润水平一些癌症,如前列腺癌、结直肠癌、胃癌、肾细胞癌(12,16- - - - - -18]。
目前,这是一个紧急的问题找到诊断心肌梗死之间的生物标志物和稳定的CAD和全面理解MI和CAD之间的免疫反应。本研究的目的是揭示的几种生物标志物的诊断心肌梗死和稳定通过从基因表达的基因表达数据综合CAD (GEO)数据集。探索免疫细胞的作用和识别潜在生物标志物MI和稳定的CAD,我们使用WGCNA MI和稳定的CAD过程的基因表达数据。然后,免疫细胞的渗透计算应用CIBERSORT样品。此外,我们确定了关键模块和中心与NK细胞水平相关的基因渗入休息,最后验证这些基因通过数据库的免疫学和临床特点分析。据我们所知,这是第一次,WGCNA已被用于识别NK细胞resting-related生物标志物在MI。这项研究提供了一个理论基础寻找生物标志物早期诊断和免疫治疗心肌梗死的目标和未来CAD。
2。结果
2.1。数据预处理
2地理数据集的矩阵表达式(GSE59867和GSE62646)包含139 MI患者和60 CAD控制样本下载。样品2地理数据集被合并成一个训练数据集包含了18837个基因。与战斗批量效应校正后,我们得到了矩阵表达式从199年样本在训练数据集(图1(一))。
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2.2。评价免疫细胞的渗透
免疫细胞浸润的微分MI和稳定的CAD组之间被CIBERSOFT评估算法。免疫渗透细胞的分布在两组显示在图中1 (b)。我们发现单核细胞,中性粒细胞,T细胞CD8 T细胞CD4天真,CD4记忆T细胞休息,休息和NK细胞明显改变了MI和稳定的CAD组之间,而B细胞天真,记忆B细胞、浆细胞、CD4记忆T细胞激活,T细胞监管(亚)、巨噬细胞M0,巨噬细胞M1, M2巨噬细胞、树突状细胞激活,肥大细胞休息,肥大细胞激活,嗜酸性粒细胞组之间没有显著改变。其中,单核细胞和中性粒细胞明显增加,T细胞CD8 T细胞CD4天真,CD4记忆T细胞休息,休息和NK细胞明显减少心肌梗死组较稳定的CAD组。这些结果表明,心肌梗死的发生和发展密切相关的免疫细胞。
2.3。加权模块识别基因Coexpression网络建设和中心
探索功能模块之间的关系和MI患者的免疫细胞渗透,我们选择前25%差异基因,包括WGCNA 4709个基因。139个样本的样本系统树图和特质的热图这项研究呈现在图2(一个)。构造一个无标度网络的力量 选择对振动截止标准电源(图2 (b))。动态树切割方法被用来合并不同的模块< 25%,最后,确定15个模块(数据3(一个)和3 (b))。eigengenes之间的相关性分析每个模块和免疫细胞(图3 (c))。与其他模块相比,淡青色模块与浆细胞浸润水平高度相关。( , ),粉红色的模块与NK细胞休息渗透水平显著相关。( , ),绿色模块与单核细胞浸润程度高度相关( , ),和青色模块与单核细胞( , )和嗜中性粒细胞( , )分别渗透水平。其中,粉红色的模型状态相关性最高的NK细胞渗透水平。因此,我们选择了粉色模型进行后续分析。我们执行一个粉色intramodular分析模块,模块成员和基因意义显示一个非常有意义的关联( 和 ),表明粉色的160个基因模块往往非常与NK细胞渗透水平(图3 (d))。那里,粉色的模块被确认为中心模块与MI。发现基因的影响功能集中在粉红色的模块,我们进行了使用Metascape工具和KEGG通路。20最高浓缩方面都提出了几种条款和图4(一),三个最高纯度的条款免疫调节淋巴和nonlymphoid细胞之间的相互作用,PID IL12 2通道,自然杀伤细胞介导的细胞毒性。
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2.4。基因识别和验证中心
高度与粉红色的基因模块与NK细胞水平休息渗透进行了研究。根据截止阀值( 和 ),共有43个基因被定义为候选基因(图中心3 (d))。基于PPI网络的粉红色模块,该基因 被确定为中央节点,我们获得23中央节点和可视化这些结果使用Cytoscape(图4 (b))。总共有11个基因中选择两个基因(图分析指定为中心4 (c);表1)。来验证这些基因11个中心之间的关系和NK细胞休息,我们下载GSE123342分析NK细胞水平渗透,休息休息,结果表明,NK细胞渗透水平显著降低心肌梗死和稳定CAD组,这是符合我们之前的分析(图5(一个))。相关分析结果显示正相关的11个基因的表达值水平渗透的NK细胞休息(相关系数> 0.6的所有基因除了GZMA GZMB, KLRF1, NCR1;图5 (b))。例如,在图5 (c),我们表现出的散点图NKG7表达式和NK细胞渗透水平。结果验证了识别中心基因与NK细胞休息渗透水平高度相关,MI的发展中扮演关键的角色。
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2.5。层次聚类和接受者操作特征(ROC)曲线分析验证中心的基因
7验证基因的层次聚类分析(NKG7、TBX21 PRF1, CD247, KLRD1, FASLG,和加工)呈现在图5 (d)。我们也评估NKG7的诊断价值,TBX21, PRF1, CD247, KLRD1 FASLG,加工MI。结果表明,NKG7 ( ),TBX21 ( ),PRF1 ( ),CD247 ( ),KLRD1 ( ),FASLG ( ),和加工( )能够识别MI和稳定的CAD(图6)。
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3所示。讨论
MI是一个严重的全球疾病发病率和死亡率高,影响病人的健康和生命19]。在过去的几年中,MI患者的数量逐年增加。心肌梗死的早期诊断是迫切需要有效的管理和选择适当的治疗的患者。虽然传统上可用的生物标志物可以帮助在心肌梗死的诊断,他们仍然缺乏特异性高。因此,它是非常紧急的识别新的诊断标志物和治疗靶点与最小的不良反应的风险和最大的敏感性和特异性。
与多因子的交互MI是一种炎症性疾病,包括免疫、环境因素和遗传因素。寻找生物标志物的血清、唾液、组织和外周血释放炎症状态吸引了研究人员的注意。例如,galectin-3的表达在牙周炎患者血清和唾液和牙周炎+冠心病显著高于冠心病患者和健康对照组,表明galectin-3血清和唾液中可能被用作预测牙周炎和牙周炎和冠心病的标志(20.]。的浓度NLRP3牙周炎患者血清和唾液的II型糖尿病和牙周炎+均高于健康对照组和II型糖尿病患者(21]。牙周炎患者的唾液中il - 6浓度明显高于健康受试者,唾液和il - 6水平与牙周炎患者的临床参数(22]。Th2细胞标记已报告在外周血敏感症状恶化哮喘患者和可能被用作生物标记对哮喘恶化[23]。由于心肌梗死心肌细胞损伤的一个关键原因,心肌肌钙蛋白已经成为心肌梗死诊断的重要因素24]。的心肌肌钙蛋白检测外周血表明心肌细胞损伤。目前周边血液生物标志物已报告作为心肌梗死的诊断生物标记。微rna - 1291,结合微rna - 217,微rna - 455 - 3 - p,和微- 566 MI患者外周血中可以作为一个新的和潜在的生物标志物早期诊断心肌梗死的(25]。循环microRNA-19a MI患者的外周血中调节与控制,可以作为一个新的生物标志物的诊断心肌梗死(26]。在目前的研究中,我们使用三个基因表达数据集从外围MI患者的血液和外周单核细胞发现心肌梗死之间的几种早期诊断标记和稳定的CAD。
这里,我们确定了11个中心基因的表达与NK细胞休息渗透水平,表明一个潜在的机制,通过这些基因可能参与心肌梗死发展。确定了11个基因的7中心基因(NKG7、TBX21 PRF1, CD247, KLRD1, FASLG,和加工)在GSE123342成功验证。和这些7基因诊断价值区分MI和稳定的CAD。
自然杀手细胞颗粒蛋白7 (NKG7)是17 kDa类型III积分膜蛋白局部包含细胞毒性颗粒囊泡(27]。NKG7首次发现在NK细胞和T细胞16,但是分子研究到目前为止(28]。最近的一项研究表明,NKG7是淋巴细胞颗粒胞外分泌的调节器和下游在许多疾病,炎症和NKG7表达自然杀伤细胞对肿瘤启动的控制至关重要,进展、转移(29日]。陈等人发现NKG7 MI组和对照组之间的表达下调(30.]。在这里,我们的研究结果表明,NKG7表达式与NK细胞休息渗透水平呈正相关。此外,ROC分析结果表明,NKG7有诊断价值,能够区分MI和稳定的CAD。那里,我们推断,NKG7可能被认为是心肌梗死诊断生物标记。
穿孔素(PRF1)属于膜攻击复杂/公关(FMACPF)总科,一个高度保守的NK细胞可以分泌的糖蛋白,CTL细胞,调节性T细胞(30.,31日]。基于其关键作用的免疫监测和监管,PRF1故障报告与许多疾病有关(32]。一项研究表明,PRF1可以诱导网格蛋白dynein-dependent内吞作用,并抑制这种内吞作用途径可能导致细胞凋亡细胞死亡(33]。PRF1中表达下调MI组与对照组相比,PRF1的异常表达可能是左心室功能障碍的恶化的主要原因在MI (30.]。目前的研究发现PRF1表达水平呈正相关,NK细胞渗透水平,休息和PRF1有诊断价值,可以区分MI和稳定的CAD。我们推测,PRF1可能参与心肌梗死的发展,这可能是一种新的生物标志物的诊断心肌梗死。因此,需要进一步的实验来确认一下。
Fas配体(FASLG)是肿瘤坏死因子超家族的成员和主要激活凋亡通路绑定在心肌梗死(肿瘤坏死因子受体34]。吴等人报道,FASLG中表达下调MI组与正常组(35]。T-box 21变体叫做T-bet (TBX21)编码转录因子,其主要功能是块Th1 Th2细胞分化[36]。减少T-bet漂流Th1 / Th2细胞变化,导致心肺复苏后心肌组织的免疫失衡在猪模型心脏骤停的37]。杀伤细胞lectin-like D1受体(KLRD1),也叫CD94, NK细胞抗原表达优先。KLRD1表达式与症状严重程度负相关38]。陈等人报道,TBX21中表达下调和KLRD1 MI组与正常组(30.]。
,我们的研究结果显示,FASLG TBX21, KLRD1表达式与NK细胞休息渗透水平呈正相关。此外,FASLG TBX21, KLRD1有诊断价值,可以区分MI和稳定的CAD。因此,我们怀疑FASLG、TBX21 KLRD1可能是小说对心肌梗死的诊断生物标记。
4所示。结论
总之,我们的研究是第一次来识别NK细胞resting-related MI使用WGCNA和CIBERSORT算法的生物标志物。11个中心基因被确定与NK细胞水平的渗透。通过生物信息学的验证、NKG7 TBX21, PRF1, CD247, KLRD1, FASLG,加工作为一个潜在的诊断的生物标志物和MI免疫治疗的目标。然而,我们的研究有一些局限性。需要额外的样本数据来验证当前的发现,和这些基因在心肌梗死的具体机制需要进一步研究在体外和体内。
5。材料和方法
5.1。原始数据收集
基因表达谱的心肌梗死(MI)从GEO数据库(下载http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo在国家生物技术信息中心(NCBI)。本研究样本包括心肌梗死患者和对照组患者稳定的冠状动脉疾病(CAD)。三个数据集(GSE59867 GSE62646和GSE123342)包括这项研究(表2)。数据集GSE59867收集从外周血单核细胞含有111 MI患者和46个稳定CAD患者,使用GPL6244平台Affymetrix人类基因第1.0位数组。GSE62646,基于GPL6244平台Affymetrix人类基因第1.0位数组,包括14名稳定的CAD患者和28 MI患者外周血单核细胞。GSE123342,以前研究使用GPL17586平台2.0 Affymetrix人类转录组阵列,包括22名患者和67 MI患者外周血和作为一个独立的验证队列。
5.2。数据预处理
使用R语言的原始数据预处理(v.3.6.3)。益生元包R语言用于规范化数据处理的原始数据。调查数据转化为相应的基因表达水平值。对于多个映射到相同的基因,我们应用平均值来表示该基因的表达。股东价值分析R语言包的战斗功能也被用于消除基因表达数据之间的异质性。
5.3。评价免疫细胞的渗透
程控鉴定评估相对子集的RNA转录(CIBERSORT)是一种硅方法,已经被fluorescence-activated证实细胞可以利用排序和评价22类型的免疫细胞浸润批量样品的组成(39]。CIBERSORT优于其他算法在免疫细胞的识别和精心设计的部门40]。基因表达数据上传到CIBERSORT门户网站(http://cibersort.stanford.edu/),该算法运行使用LM22签名和5000排列。的Wilcoxon rank-sum测试是利用比较差丰度之间的免疫浸润MI和稳定的CAD组。免疫细胞的分布在两组展出的ggplot2包R语言。最后,免疫细胞的比例在每个样本被选为WGCNA特征数据。
5.4。加权基因Coexpression网络建设
WGCNA方法的聚类基因表达模式的基础上,系统地分析基因模块之间的关系和特征,和基因功能分类41]。我们选择前25%差异基因,其中包括139 MI样本基因表达矩阵,构建一个使用WGCNA coexpression网络包R语言。首先,单个文本的表达水平转化为基于相似矩阵之间的皮尔逊相关值成对基因。接下来,相似矩阵转化为一个邻接矩阵。当价值12岁的时候,当时邻接矩阵转化为一个重叠拓扑矩阵。为了eigengenes基因相似的表达模式划分为不同的模块,进行动态混合切割方法,最小模块大小截止值是30。层次聚类树被用来显示结果。
5.5。识别的临床重要模块和富集分析
所有基因进行的主成分分析在每个模块和主成分的价值一个用作模块eigengenes。那时,皮尔逊相关分析计算模块之间的相关性eigengenes和浸润的T细胞水平和识别模块的意义。模块的绝对值 被认为与T细胞显著相关。此外,我们进一步计算和可视化模块的不同特征基因,所选模块树形图的切割线,并合并一些模块。此外,我们选择感兴趣的免疫细胞和最高的模块相关系数和识别出这是一个中心模块。进一步探索基因的生物功能中心模块,我们使用在线工具Metascape (http://metascape.org)执行基因本体论(去)分析和基因和基因组学的《京都议定书》百科全书(KEGG)通路富集分析。
5.6。基因鉴定中心
我们确定了候选基因中心根据模块化的连通性和临床特征的关系的每个基因中心模块。模块连接的绝对值衡量皮尔森的相关性(模块成员(MM))。临床特征的关系被定义为皮尔逊的绝对值的每个基因之间的相关性和性状(基因的意义(GS))。的 和 被选为中心基因的鉴定的标准。此外,所有基因中心模块选择和用于构建蛋白质相互作用(PPI)网络相互作用的基因的使用搜索工具来检索(String)数据库(https://string-db.org/)和Cytoscape (v 3.7.2章)被用来可视化网络。该基因与 被认为是中央节点。我们使用一个在线工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行维恩分析候选基因中心和PPI网络的中心节点,和十字路口的基因被认为是中心的基因。
5.7。中心基因的确认
GSE123342数据集被用来验证中心基因和免疫细胞之间的关系。首先,我们应用CIBERSORT评估每个MI NK细胞样本的内容。然后,中心之间的斯皮尔曼相关基因和NK细胞免疫细胞计算,休息和ggplot2包(v 3.1.1) R语言被用来可视化结果。
5.8。层次聚类和接受者操作特征(ROC)曲线分析验证中心的基因
验证中心基因的层次聚类分析是利用R语言。为了评估中心基因的诊断价值,“pROC”包生成民国,执行和ROC曲线下的面积(AUC)代表的诊断价值。AUC值大于0.6时,中心基因被认为能够区分MI和稳定CAD具有良好的特异性和敏感性。
缩写
| 小姐: | 心肌梗死 |
| 地理: | 基因表达综合 |
| 中华民国: | 接受者操作特性 |
| WGCNA: | 加权基因coexpression网络分析 |
| 计算机辅助设计: | 冠状动脉疾病 |
| 走: | 基因本体论 |
| KEGG: | 京都基因和基因组的百科全书 |
| PPI: | 蛋白质相互作用 |
| MM: | 会员模块 |
| g: | 基因的意义 |
| NKG7: | 自然杀手细胞颗粒蛋白7 |
| PRF1: | 穿孔素 |
| FASLG: | Fas配体 |
| TBX21: | T-box 21变体 |
| KLRD1: | 杀手细胞lectin-like受体D1。 |
数据可用性
中使用的数据集和分析当前的研究可从公共数据库基因表达综合库。加入的数量在当前研究中使用的数据集是GSE59867, GSE62646和GSE123342基因表达的综合(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
LZ的概念研究。QW和XX进行数据分析。QW写手稿和XX贡献显著。所有作者阅读和批准最终的手稿。