lncRNA LINC00355作为一种新的生物标志物，通过调节miR-1225/FNDC3B来促进胶质瘤的生物活性

摘要

背景．越来越多的证据表明，长链非编码rna (lncrna)在胶质瘤进展中起着重要作用。本研究旨在探索一种新型lncRNA LINC00355在胶质瘤中的潜在作用，并阐明其潜在机制。方法．RT-PCR检测LINC00355在胶质瘤细胞株和标本中的相对表达。统计分析LINC00355在胶质瘤患者中的临床病理和预后意义。为了确定细胞活性，我们进行了CCK-8、克隆检测、流式细胞术、迁移和侵袭检测。通过生物信息学分析和荧光素酶报告基因研究了LINC00355的作用机制。结果．在胶质瘤细胞系和标本中LINC00355表达增加，较高的LINC00355表达预示胶质瘤患者的临床进展和总生存期和无病生存期降低。在功能上，LINC00355缺失可促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，并诱导胶质瘤细胞凋亡，而LINC00355上调则在体外产生相反的效果。机理分析显示LINC00355作为miR-1225抑制III型纤连蛋白结构域3B (FNDC3B)表达的海绵。结论．我们的研究结果揭示了LINC00355在胶质瘤进展中的肿瘤促进作用，提示LINC00355通过调节miR-1225/FNDC3B轴表现出ceRNA功能。

1.介绍

胶质瘤是男性和女性中最普遍和最致命的脑肿瘤，>占原发性颅内脑肿瘤的75% [1]。与所有其他胶质瘤类型相比，胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)的发病率明显更高，由于其强化转移和异质性的细胞遗传学和分子变态，其长期生存期不佳，小于8个月[2，3.]。此外，由于对其潜在发病机制的探索进展缓慢，对该肿瘤有效的治疗策略有限[4]。因此，探索肿瘤转移的可能机制，对于进一步确定敏感的临床生物标志物和潜在的治疗靶点具有重要的科学和临床价值。

非编码rna被认为具有有限的蛋白质编码能力，如tRNA、snoRNA、mirna等其他类型的rna [5]。长链非编码rna (Long noncoding RNAs, lncRNAs)是一类新出现的非编码rna，其包含超过200个核苷酸，并已被明显证明在基因组中广泛转录[6，7]。长期以来，lncrna被认为是“转录噪声”。然而，近年来越来越多的证据表明lncrna在DNA复制、转录和基因表达中是必不可少的调控因子[8，9]。在细胞功能中，lncrna被证实在许多生物学过程中发挥着重要作用，包括干细胞的多能性、细胞分化、细胞复制和程序性细胞死亡[10]。lncrna通过调节肿瘤促进和抗肿瘤途径在肿瘤起始和进展中的调控功能越来越受到关注[11，12]。许多肿瘤相关的lncrna已经被功能性地描述了[13，14]。然而，大量的lncrna至今还没有功能上的特征，其在胶质瘤进展和转移中的肿瘤相关功能的潜在机制仍很大程度上不清楚。

MicroRNAs (miRNAs)是一种小型非编码rna，约为18-25个核苷酸，在各种癌症中显示异常表达，并通过抑制肿瘤相关基因的翻译作为肿瘤抑制因子或肿瘤启动子[15，16]。一种新出现的假说，被称为竞争性内源性RNA (ceRNA)，揭示了一些特殊的lncrna可以与具有相同miRNA结合位点的mrna“交谈”[17]。lncrna和mirna之间的交叉调节突出了它们在胶质瘤发生和转移中的重要作用，促使我们小组进一步阐明其潜在的机制。

在本研究中，我们首次发现了一种新的胶质瘤相关lncRNA, lncRNA LINC00355 (LINC00355)，该lncRNA在胶质瘤标本中过度表达，预测胶质瘤患者的临床预后较差。然后，我们进行了功能丧失和功能获得检测，确认LINC00355在胶质瘤中是一个肿瘤启动子。机制研究发现LINC00355/miR-1225/FNDC3B轴在肿瘤发生和转移中的新的调控机制，为肿瘤治疗提供了新的线索。

2.方法

2．1．组织样本集合

本研究于2013年3月至2016年6月在莱州市人民医院采集121例患者的胶质瘤和匹配的正常邻近组织标本，并经莱州市人民医院伦理委员会书面知情同意和批准。手术切除前，患者未接受术前、术后辅助治疗。组织标本被快速冷冻并在-80°C保存。

2．2．细胞培养和转染

细胞包括NHAs(作为对照细胞)和胶质瘤细胞(T98G, LN229, LN18, A172, U251)取自通和生物(中国杭州)。在培养箱中使用RPMI-1640培养基培养。采用Lipofectamine 2000转染试剂盒(LumingBio，中国辽宁大连)进行细胞转染。miR-1225 mimics、NC mimics(阴性对照)、miR-1225抑制剂、NC抑制剂(阴性对照)和sirna (sirna靶标LINC00355: si-LINC00355#1、si-LINC00355#2和si-LINC00355#3;sirna靶向FNDC3B: si-FNDC3B#1, si-FNDC3B#2, si-FNDC3B#3)从江苏南通云润生物公司获得。将LINC00355序列构建到pcDNA3.1空载体中，过表达LINC00355 (v-LINC00355)，由中国杭州奈雅生物科技有限公司进行构建。

2．3.实时聚合酶链反应

分别用TRIzol试剂盒(YiRanBio，长沙，湖南，中国)和QIAGEN miRNeasy试剂盒(JianlunBio，广州，广东，中国)提取总rna和miRNAs。为了检测FNDC3B mRNA和LINC00355，我们首先使用Transgen cDNA Synthesis SuperMix试剂盒(SanjianBio, Tianjin，滨海，China)将mRNA转录为cDNA。然后采用qPCR Master kits (GuangjingBio, Suzhou, Jiangsu, China)进行实时PCR反应。miR-1225检测使用一步miRNA qPCR试剂盒(Genetimes，江苏太仓)。GAPDH作为mRNA和lncRNA检测的内对照，U6作为miRNA检测。计算相对mRNA、lncRNA或miRNA的表达量方法。相关引物序列如表所示1．

２.４.细胞生存能力检测

指定处理后的细胞放入板内(96孔;密度为 ）置于培养箱中(37°C, 5% CO)₂)用于指定的时间。随后，Dojindo CCK-8试剂(15μ信用证;拜德，武汉，湖北，中国)被放置在板块。孵育2 h后，用酶标仪检测450nm处的吸光度值。

2．5．单独分析

将处理过的细胞放入培养皿(6孔;500个细胞)，培养16天。在肉眼可见细胞集落之前，用多聚甲醛固定集落，用结晶紫处理集落，然后用显微镜成像。

2．6．细胞凋亡检测

处理后的细胞被胰蛋白酶化，收获，并在PBS缓冲液中重悬。然后用碘化丙啶(6μ克/μl;博安生物，浙江杭州)和Annexin V-FITC (15μ克/μl;生物基因，广东广州)。避光20 min, PBS冲洗，流式细胞仪检测。

2.7。Caspase 3/9活性检测

我们使用Abcam caspase 3/9活性检测试剂盒(JissKangBio，青岛，中国)检测LINC00355 sirna或ov-LINC00355质粒处理后肿瘤细胞的caspase 3/9活性。总之，利用裂解缓冲液和离心制备细胞裂解液上清。上清加入2×反应缓冲液，然后加入DTT和DEVD-pNA试剂(5μl;4毫米)。孵育100 min后，在405 nm处测量吸光度值。

2.8。伤口愈合实验

细胞( ）治疗后胰酶化并放入24孔培养皿中。细胞培养24 h(细胞融合率达到100%)。随后，用塑料吸管尖(200μL)，产生人工伤口。创面创建后0 h和48 h，在显微镜下拍摄创面闭合情况。

2.9。Transwell化验

处理过的细胞( 200年μl)胰酶化后放入经基质处理的Costar Transwell上腔室。随后又补充了650人μL培养基含15%血清。培养皿保存在37°C, 5% CO的培养箱中₂)处理36 h后，用多聚甲醛和结晶紫处理下侧细胞。PBS冲洗后，用显微镜对细胞拍照。

2.10。亚细胞分离试验

简单地说，我们首先使用Thermo Fisher PARIS试剂盒(Guanghe, Ningbo, Zhejiang, China)，根据试剂盒协议从U251细胞中分离细胞核和细胞质提取物。然后，分别从细胞核和细胞质提取物中分离出rna。最后用RT-PCR检测U6、GAPDH和LINC00355。核对照为U6，细胞质对照为GAPDH。

2.11。荧光素酶活性报告试验

预测miR-1225结合位点在3 -将FNDC3B mRNA序列的UTR构建到pGL3荧光素酶报告载体(野生型:WT)中，并构建相应的突变体结合位点序列(突变型:MUT)。记者的姓名如下:FNDC3B WT和FNDC3B MUT。将野生型或突变型LINC00355序列分别构建到pGL3空载体中，形成LINC00355 WT或LINC00355 MUT荧光素酶报告基因。该载体由NaYe生物公司(中国浙江杭州)构建。将细胞贴附在平板上后，用指定的荧光素酶报告载体和miR-1225模拟物或对照物共转染细胞。48 h后，使用Promega荧光素酶报告基因检测试剂盒(JunShangBio，中国四川成都)检测胶质瘤细胞荧光素酶活性。

2.12。统计分析

数据采用SPSS统计软件(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行分析。两组之间的差异使用学生的 -检验或卡方检验。多组比较采用单因素方差分析。为估算总生存期(OS)和无病生存期(DFS)，采用Kaplan-Meier生存分析。采用单因素和多因素分析生存数据。 被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.LINC00355在胶质瘤中上调并与不良预后相关

我们首次采用RT-PCR检测我院121例胶质瘤患者LINC00355的水平。数字1(一)结果显示，与正常组织相比，胶质瘤组织LINC00355表达明显上调。此外，与正常NHAs相比，5个胶质瘤细胞系也观察到LINC00355表达增加(图)1 (b)）.然后，我们进一步探讨LINC00355在胶质瘤患者中的临床意义。如表所示2， LINC00355高表达与KPS相关( ）及世界卫生组织职系( ）.随后的临床研究证实了LINC00355的预后价值，其上调与OS缩短相关( ，数字1 (c))及DFS ( ，数字1 (d)）.更重要的是，多因素Cox回归分析证实miR-1225是预测OS的独立指标( ，95%置信区间:1.201—-3.887, ，表格3.)及DFS ( ，95%置信区间:1.375—-3.778, ，表格4)。总的来说，我们的研究结果显示LINC00355在胶质瘤中的表达明显增加，并与晚期临床进展相关。

3．2.LINC00355抑制胶质瘤细胞增殖，加速细胞凋亡

为了评估LINC00355对胶质瘤细胞致癌行为的影响，我们首先合成了针对LINC00355的sirna (si-LINC00355#1, si-LINC00355#2，和si-LINC00355#3)，随后将这些LINC00355 sirna转染到U251和T98G细胞中，因为在U251和T98G细胞中LINC00355的表达相对高于其他胶质瘤细胞。采用实时荧光定量PCR方法评价敲除效果。数据表明，si-LINC00355#2具有最高的敲除效率(图2(一个)）.随后，通过qPCR检测转染LINC00355过表达质粒(v-LINC00355)或si-LINC00355#2(图)后，胶质瘤细胞中LINC00355的表达水平2 (b)）.随后，为了探究LINC00355是否影响细胞生长，进行了CCK-8分析。数据显示，抑制LINC00355的表达可显著抑制胶质瘤细胞的增殖率，而异位表达LINC00355可显著增加生长曲线(图)2 (c)）.然后，评估LINC00355对细胞集落形成的影响。数据表明，当LINC00355被敲除时，菌落数量明显减少，而在胶质瘤细胞中转染LINC00355过表达质粒时菌落数量显著增加(图)2 (d)）.此外，我们还检测了LINC00355对胶质瘤细胞凋亡的影响。流式细胞术数据证实，过表达LINC00355显著降低了细胞凋亡率，而抑制LINC00355则显著促进了胶质瘤细胞的凋亡(图)2 (e)）.此外，我们还对caspase 3/9的活性进行了评估，数据证明，在胶质瘤细胞中，提高LINC00355的表达显著降低了caspase 3/9的活性，而减少LINC00355则显著提高了caspase 3/9的活性(图)2 (f)）.综上所述，我们的结果表明LINC00355强烈促进了胶质瘤的发展。

3．3.耗尽抑制胶质瘤细胞的转移潜能

接下来，我们进一步研究了LINC00355对细胞转移的影响，这是恶性进展的关键决定因素。首先，我们使用伤口愈合分析来确定LINC00355对胶质瘤细胞流动性的影响。结果表明，LINC00355 sirna处理的胶质瘤细胞的迁移活性显著降低，而ovlinc00355质粒处理的胶质瘤细胞的细胞迁移显著增强(图)3(一个)和3 (b)）.Transwell测定法也被应用。当LINC00355在胶质瘤细胞中表达增强时，细胞的侵袭能力明显增强，而抑制LINC00355则明显降低胶质瘤细胞的侵袭能力(图)3 (c)和3 (d)）.因此，这些结果证实LINC00355增强了胶质瘤细胞的转移潜能。

3．4．miR-1225是LINC00355在胶质瘤细胞中的靶点

随后，对其分子机理进行了研究。由于之前的报道已经证明分布在细胞质中的lncrna通过海绵吞噬mirna发挥其功能，因此我们确定了LINC00355的亚细胞定位[17]。数据表明LINC00355主要分布在细胞质中(图4(一)）.因此，我们小组深入研究了LINC00355的下游miRNAs。利用GSE90603进行生物信息学分析，获得胶质瘤肿瘤组织中差异表达的mirna。热图如图所示4 (b)．然后我们通过交叉胶质瘤肿瘤组织中下调的mirna，并使用miRDB程序预测靶mirna，获得8个mirna [18)(图4 (c)）.在这8种miRNAs中，miR-1225是我们之前报道的一种肿瘤抑制因子，引起了我们的注意，我们试图探索它是否是LINC00355的靶点[19，20.]。miR-1225在GSE90603数据中的相对表达如图所示4 (d)．此外，qPCR检测显示，miR-1225在胶质瘤标本中的表达死亡(图)4 (e)）.此外，CCK-8试验的功能研究证实，强制表达miR-1225可显著抑制胶质瘤细胞的生长(图)4 (f)）.miRDB程序预测LINC00355与miR-1225的结合位点如图所示4 (g)．然后，用荧光素酶报告基因检测验证它们的相互作用。如图所示4 (h)， miR-1225过表达抑制了LINC00355野生型(WT)报告基因的活性，但未抑制LINC00355突变型(MUT)报告基因的活性，证实了二者的直接相互作用。此外，qPCR证实LINC00355敲低导致miR-1225表达升高，而LINC00355异位表达显著抑制miR-1225水平(图)4(我)）.此外，qPCR数据也证实了miR-1225表达增强有助于LINC00355的抑制，而miR-1225缺失导致LINC00355表达明显增加(图)4 (j)）.综上所述，LINC00355在胶质瘤细胞中海绵化miR-1225。

3．5．miR-1225靶向FNDC3B在胶质瘤细胞中的作用

为了进一步阐明miR-1225如何促进胶质瘤的生长和转移，我们使用生物信息学算法miRDB和TargetScan来识别介导miR-1225对胶质瘤作用的靶基因。然后我们交叉了TargetScan、miRDB和肿瘤样本中1000个上调基因的预测结果(使用GEPIA程序分析的TCGA数据[21])。我们发现了14个常见基因(图5(一个)）.随后通过GEPIA程序分析胶质瘤中这14个基因的OS，我们发现只有BACE2、FNDC3B和PLTP与OS显著相关(图)5 (b)）.在这三个基因中，FNDC3B引起了我们的关注，因为它与多种癌症的发生和转移有关[22，23]。TCGA数据集显示，胶质瘤标本中FNDC3B水平升高(图)5 (c)）.此外，qPCR也证实在121例胶质瘤样本中FNDC3B表达上调(图)5 (d)）.此外，使用GEPIA程序进行的生物信息学分析也表明，高FNDC3B的患者无病生存期明显较低(图)5 (e)）.miR-1225与3的预测结合位点 -FNDC3B mRNA的UTR如图所示5 (f)．此外，miR-1225 mimics转染胶质瘤细胞后，胶质瘤细胞中FNDC3B水平明显降低，而miR-1225抑制剂显著提高了胶质瘤细胞中FNDC3B水平，说明miR-1225表达与FNDC3B表达呈负相关(图)5 (g)）.因此，我们接下来进行荧光素酶报告基因检测，以验证FNDC3B是否是miR-1225的直接靶基因。数据表明，过表达miR-1225显著抑制了野生型(WT)预测结合位点荧光素酶报告载体转染的胶质瘤细胞的荧光素酶活性，而miR-1225对转染突变体(mutt)的细胞中预测结合位点荧光素酶报告载体的荧光素酶活性没有影响(图)5 (h)）.因此，这些数据证明了FNDC3B是miR-1225在胶质瘤细胞中的准确靶点。

3.6。在胶质瘤细胞中通过miR-1225调控FNDC3B

由于我们已经证明LINC00355海绵miR-1225, miR-1225靶向胶质瘤细胞中的FNDC3B，我们想知道LINC00355是否可以调节FNDC3B。首先，利用qPCR检测胶质瘤细胞miR-1225耗尽或过表达后LINC00355和FNDC3B的水平。我们观察到，提高miR-1225的表达导致LINC00355和FNDC3B的表达水平显著下降，而下调miR-1225则能够提高LINC00355和FNDC3B的表达水平(图)6(一)）.那么，LINC00355的异位表达能够促进FNDC3B的表达，而LINC00355过表达也可以抵消miR-1225对FNDC3B表达的抑制作用(图)6 (b)）.随后，我们合成了靶向FNDC3B的sirna (si-FNDC3B#1, si-FNDC3B#2, si-FNDC3B#3)，并应用qPCR检测敲低效率(图)6 (c)）.结果表明，si-FNDC3B#3的敲除效率最高。然后，我们进行了功能实验，研究LINC00355是否能够恢复FNDC3B sirna对细胞生长和迁移的抑制作用。CCK-8实验表明，si-FNDC3B#3抑制FNDC3B可抑制胶质瘤细胞的增殖，而重新引入LINC00355可逆转si-FNDC3B#3抑制的细胞增殖(图)6 (d)）.在伤口愈合试验中也观察到类似的结果，LINC00355过表达可以恢复si-FNDC3B#3对胶质瘤细胞迁移的抑制作用(图)6 (e)）.综上所述，LINC00355通过miR-1225/FNDC3B轴调控胶质瘤恶性行为。

4.讨论

人脑胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤。这种恶性肿瘤患者的不良临床预后导致了对敏感肿瘤生物标志物的大规模研究，因为它们对患者的临床管理至关重要[24，25]。尽管越来越多的肿瘤相关基因、基因甲基化、转录因子和其他分子被鉴定为潜在的生物标志物，但这些可能的生物标志物的真正临床应用仍受到限制[26]。近年来，越来越多的研究强调了lncrna在肿瘤进展中的生物学意义，越来越多的证据表明lncrna在各种肿瘤患者中的重要诊断和预后价值[27，28]。在这里，一种新的胶质瘤相关lncRNA LINC00355被确定，它在胶质瘤中上调，并预测了先进的临床进展。此外，通过分析5年的生存数据，我们证实LINC00355上调与胶质瘤患者的OS和DFS缩短相关，并通过多因素Cox模型证实LINC00355上调可能是一个独立的不良预后因素。总的来说，我们的发现提供了LINC00355可以作为神经胶质瘤患者可靠的生物标志物的第一个证据。

此前，LINC00355的频繁失调已在几种癌症中得到证实，如膀胱癌、结直肠癌和肺癌[29- - - - - -31]。然而，LINC00355在肿瘤进展中的作用鲜有报道。卢等人[30.表明LINC00355通过作为miRNA-195海绵增加HOXA10的水平，在头颈部鳞癌细胞的生长和转移中起正调控作用。梁等人[29结果显示LINC00355在肺癌中过表达，其强制表达通过调节miRNA-195/CCNE1促进增殖。在本研究中，我们小组观察到它的下调抑制了胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，在我们的功能获得试验中，我们观察到LINC00355过表达与LINC00355在胶质瘤细胞中的下调表现出相反的结果。我们的研究结果首次证实LINC00355在胶质瘤中是肿瘤启动子，这与LINC00355在肺癌和头颈部鳞癌中的肿瘤促进作用一致。

已有研究证明，lncrna作为mirna的海绵，消除了mirna对靶向转录本的抑制作用[17，32]。此前，有报道称LINC00355在上述两种肿瘤中作为miRNAs的分子海绵[29，30.]。为了进一步探究ceRNA假说的可能机制，我们小组首先确定了其在胶质瘤细胞中的定位，因为细胞质lncrna已经被证明可以调节mRNA的稳定性，发挥miRNA海绵的作用。通过生物信息学分析，我们鉴定出8个可能与LINC00355相互作用的mirna。在这些候选基因中，miR-1225引起了我们的注意，因为它在胶质瘤标本中明显过表达，并通过CCK-8检测其强制表达抑制了U251和T98G细胞的增殖。RT-PCR数据显示，LINC00355抑制后miR-1225表达明显增加。相反，过表达miR-1225降低了LINC00355的表达，而抑制miR-1225则呈现相反的趋势。我们的研究发现LINC00355和miR-1225之间存在反向相关性。荧光素酶活性检测证实LINC00355与miR-1225直接结合。此前，miR-1225的明显下调及其在几种肿瘤中作为抑癌因子的作用已被报道[33，34]。在神经胶质瘤中，Li等[19]报道miR-1225在成胶质细胞瘤中低表达，过表达通过靶向IRS1抑制成胶质细胞瘤细胞的增殖和转移。因此，我们的研究结果和之前的研究表明LINC00355通过抑制miR-1225发挥肿瘤促进作用。

新的证据表明，抑制FNDC3B参与了抑制细胞生长、粘附和侵袭能力的过程，提示FNDC3B可能在细胞进程中发挥功能作用[35]。因此，FNDC3B是否作为功能调节剂受到越来越多的关注。近年来，在肝细胞癌、舌鳞癌、胶质瘤等多种肿瘤中，有FNDC3B过表达及其肿瘤促进作用的报道[22，23，36]。重要的是，FNDC3B在EMT通路的进展中发挥了重要作用。此外，有报道称，一些mirna通过靶向FNDC3B发挥其功能。例如，Fan等人[37]报道过表达miR-143通过调节FNDC3B促进前列腺癌细胞迁移和侵袭。Xu等[22]显示miR-129-5p在胶质母细胞瘤中起抑癌作用，其上调表达通过靶向FNDC3B抑制细胞增殖和转移。然而，有关fndc3b介导的胶质瘤进展的确切分子机制的证据有限。在本研究中，我们通过分析TCGA数据集来研究FNDC3B在胶质瘤患者中的临床意义，发现FNDC3B水平越高，临床预后越差。然后进行生物信息学分析，证实FNDC3B可能是miR-1225的潜在靶点。此外，通过荧光素酶检测，我们证实了强迫过表达miR-1225可以明显降低荧光素酶活性。此外，我们进行了一系列的细胞实验来研究miR-1225和FNDC3B之间的关系，发现在转染miR-1225 mimic的胶质瘤细胞中进一步过表达FNDC3B可以逆转miR-1225 mimic对胶质瘤细胞迁移和增殖的抑制作用。这表明miR-1225通过抑制FNDC3B在肿瘤发生中发挥了关键作用。有趣的是，我们发现LINC00355通过抑制miR-1225提高了FNDC3B的表达。进一步的功能分析显示，LINC00355的恢复挽救了FNDC3B敲低对细胞生长和迁移的影响。这些数据表明LINC00355至少部分通过调控miR-1225/FNDC3B轴发挥致癌作用。

我们的研究有几个局限性:首先，本研究的样本量小是一个局限性。其次，LINC00355在胶质瘤中过表达的可能机制尚不清楚。第三，未对FNDC3B调控的下游分子进行研究。

5.结论

综上，我们首次发现LINC00355在胶质瘤标本和细胞中表达明显上调，其表达上调可能成为胶质瘤患者诊断和预后的新的生物标志物。LINC00355的致癌功能可能部分通过miR-1225/FNDC3B轴的调控实现。总之，LINC00355/miR-1225/FNDC3B网络可能成为胶质瘤治疗的候选靶点。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可在合理的要求下从通信作者处获得。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

祁振永，王丽丽，瞿旭亮设计研究，进行实验，分析数据，撰写手稿。所有作者都已阅读并批准了手稿的最终版本。

致谢

本研究由莱州市人民医院医学研究计划项目(No. 2019013)资助。

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