收集标本神经胶质瘤和正常匹配相邻组织的121名患者在莱州人民医院从2013年3月到2016年6月以书面知情同意和批准的伦理委员会莱州人民医院。手术切除之前,患者接受没有前置或术后辅助治疗。组织样本snap-frozen和保存在-80°C。

细胞包括nha(控制单元)和神经胶质瘤细胞(T98G, LN229, LN18、A172 U251)获得从TongHe生物学(杭州)。他们培养使用rpmi - 1640媒体在一个孵化器。细胞转染进行使用Lipofectamine 2000转染工具(LumingBio、大连、辽宁、中国)。mir - 1225模拟,数控模拟(负控制),mir - 1225抑制剂,数控抑制剂(负控制)和siRNAs (siRNAs目标LINC00355: si-LINC00355 # 1, si-LINC00355 # 2,和si-LINC00355 # 3;siRNAs目标FNDC3B: si-FNDC3B # 1, si-FNDC3B # 2, si-FNDC3B # 3)获得YunRun生物公司(江苏南通,中国)。LINC00355序列构建到pcDNA3.1空向量过多表达LINC00355 (ov-LINC00355)和建筑是由NaYe生物学(杭州)。

提取的总rna和microrna分别使用试剂盒包(YiRanBio,长沙,湖南,中国)和试剂盒miRNeasy工具包(JianlunBio、广州,广东省,中国),分别。FNDC3B mRNA和LINC00355检测,我们首先使用一个Transgen互补脱氧核糖核酸合成SuperMix工具包(SanjianBio、滨海、天津,中国)mRNA转录成互补。然后,实时PCR反应是由雇佣qPCR主包(GuangjingBio,苏州,江苏,中国)。mir - 1225考试,一步microrna qPCR工具包(Genetimes、太仓、江苏、中国)。GAPDH作为内部控制的mRNA和lncRNA检测,和U6被用作microrna的考试。相对mRNA、lncRNA或microrna的表达计算使用 2 − Δ Δ Ct 方法。相关引物序列显示在表中 1。

指定的治疗后细胞放入盘子(96 -;的密度 3所示。5 × 10 3 细胞 / 好吧 ),并保存在一个孵化器(37°C, 5%的公司₂表示时间。后来,Dojindo CCK-8试剂(15 μ信用证;BioDe、武汉、湖北,中国)被放在了盘子。孵化2 h后,标仪应用于检测吸光度值在450海里。

治疗细胞放入盘子(6-well;500细胞)和培养了16天。直到细胞殖民地肉眼下可见,多聚甲醛被用来解决殖民地和结晶紫来对待殖民地,其次是使用显微镜成像。

细胞治疗是使胰蛋白酶化、收获和resuspended PBS缓冲。此后,这些细胞被沾propidium碘(6 μ克/ μl;BoanBio,杭州,浙江,中国)和膜联蛋白V-FITC (15 μ克/ μl;Biogene、广州,广东,中国)。细胞远离光20分钟,洗用PBS,然后用流式细胞仪机器。

3/9我们使用Abcam半胱天冬酶活性检测试剂盒(JissKangBio,青岛,山东,中国),以确定治疗后肿瘤细胞的半胱天冬酶活动3/9 LINC00355 siRNAs或ov-LINC00355质粒。简而言之,浮在表面的细胞溶解产物是准备使用裂解缓冲和离心法。随后,上层清液添加2×反应缓冲区,紧随其后的是添加德勤和DEVD-pNA试剂(5 μl;4毫米)。孵化后100分钟,在405纳米测量吸光度值的输出。

细胞( 3所示。5 × 10 5 )治疗后使胰蛋白酶化和取代板块(24-well)。细胞培养24 h(细胞汇合的达到100%)。随后,单层细胞被挠的使用塑料吸管(200 μl)和人工生成的伤势。伤口关闭拍摄使用显微镜在0 h和48 h后伤口了。

治疗细胞( 1。5 × 10 5 200年 μl)使胰蛋白酶化并放置到配角Transwell心房接受人工基底膜。下室与650年被补充 μl媒体含15%血清。盘子被保存在一个孵化器(37°C, 5%的公司₂)36 h、多聚甲醛和结晶紫是用来治疗细胞较低。与PBS洗涤后,显微镜是用来拍照的细胞。

短暂,我们首先从U251细胞分离出核和胞质提取物使用热费希尔巴黎工具包(Guanghe公司、宁波、浙江、中国)根据设备的协议。分别之后,rna分离核和胞质提取物。最后,U6, GAPDH和LINC00355 rt - pcr进行评估。U6被用作核控制和细胞质GAPDH控制。

预测mir - 1225 3的结合位点 ′ utr FNDC3B信使rna序列构造成pGL3荧光素酶记者向量(野生型:WT)和相应的突变体结合位点序列也是构造(突变:狗)。记者们被命名如下:FNDC3B WT和FNDC3B无足轻重的人。相应地,野生型或变异LINC00355序列,分别构造成pGL3空向量形式LINC00355 WT或LINC00355傻瓜荧光素酶记者。向量是由NaYe生物公司(杭州,浙江,中国)。盘子上的细胞连接后,他们与指定的荧光素酶cotransfected记者向量和mir - 1225模拟或控制。48小时后,神经胶质瘤细胞的荧光素酶活动由记者Promega荧光素酶检测试剂盒的使用(JunShangBio、成都,四川,中国)。

数据分析SPSS统计软件(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。使用学生的两组之间的差异进行评估 t 以及卡方检验。多个组与单向方差分析比较。估计总生存期(OS)和无病生存期(DFS), kaplan meier生存分析。生存数据分析的使用单变量和多变量分析。 p < 0.05 被认为是具有统计学意义。

我们首先进行rt - pcr检测的水平121年LINC00355神经胶质瘤患者从我们医院。图 1(一)表明LINC00355表情明显调节在神经胶质瘤标本与正常组织相比。此外,五个神经胶质瘤细胞系也观察到展览增加LINC00355表达与正常nha相比(图 1 (b))。然后,我们进一步探讨LINC00355神经胶质瘤患者的临床意义。如表所示 2、高LINC00355表达式与KPS有关( p = 0.019 )和年级( p = 0.024 )。后续临床研究证实的预后价值LINC00355 upregulation与短的操作系统( p = 0.0023 ,图 1 (c))和DFS ( p = 0.0092 ,图 1 (d))。更重要的是,多变量Cox回归分析证实了mir - 1225作为一个独立指标预测的操作系统( 人力资源 = 2.785 ,95%置信区间CI: 1.201 - -3.887, p = 0.015 、表 3)和DFS ( 人力资源 = 2.657 ,95%置信区间CI: 1.375 - -3.778, p = 0.021 、表 4)的神经胶质瘤患者。总的来说,我们的研究结果显示,LINC00355神经胶质瘤中表达明显增加,与先进的临床进展。

评估的影响LINC00355神经胶质瘤细胞的致癌行为,我们首先合成siRNAs反对LINC00355 (si-LINC00355 si-LINC00355 # 1, # 2, si-LINC00355 # 3),随后转染这些LINC00355 siRNAs U251 T98G细胞因为LINC00355表达式相对较高比其他神经胶质瘤细胞U251和T98G细胞。实时PCR分析被用来评估可拆卸的效率。数据表明,si-LINC00355 # 2(图可拆卸的最高效率 2(一个))。后来,qPCR也进行了确定LINC00355水平神经胶质瘤细胞转染后LINC00355 overexpressing质粒(ov-LINC00355)或si-LINC00355 # 2(图 2 (b))。随后,探索LINC00355是否影响细胞生长,CCK-8分析。数据显示,压抑的表达LINC00355非常抑郁的神经胶质瘤细胞的增殖率,而LINC00355导致异位表达明显增加了增长曲线(图 2 (c))。然后,LINC00355对细胞集落形成的影响也得到了评估。数据表明,LINC00355撞倒时,殖民地的数量明显减少,而殖民地数量显著增加在神经胶质瘤细胞转染时LINC00355 overexpressing质粒(图 2 (d))。此外,我们还化验LINC00355在神经胶质瘤细胞凋亡的影响。流式细胞术分析数据证实overexpressing LINC00355显著降低细胞凋亡率,而抑郁LINC00355大大促进了神经胶质瘤细胞的细胞凋亡(图 2 (e))。此外,半胱天冬酶活动也被评估和3/9的数据证明,提高表达LINC00355显著减少半胱天冬酶的活动3/9神经胶质瘤细胞,而损耗的LINC00355显著增加了半胱天冬酶活动(图3/9 2 (f))。综上所述,我们的研究结果表明,神经胶质瘤LINC00355强烈促进了发展。

接下来,我们进一步调查的影响LINC00355细胞转移,恶性发展的一个关键决定因素。首先,我们采用伤口愈合分析来确定LINC00355对神经胶质瘤细胞的迁移率的影响。结果表明,神经胶质瘤细胞治疗显著减少显示的LINC00355 siRNAs迁徙活动,而神经胶质瘤细胞处理ov-LINC00355质粒明显增强细胞迁移(数据 3(一个)和 3 (b))。Transwell化验也适用。当LINC00355的表达在神经胶质瘤细胞,增强细胞侵袭能力明显增加,而抑制LINC00355明显减少神经胶质瘤细胞的入侵能力(数据 3 (c)和 3 (d))。因此,这些结果验证LINC00355增强神经胶质瘤细胞的转移潜能。

随后,分子机制研究。因为之前的报告表明,分布于细胞质lncRNAs通过骗取microrna发挥其功能,我们从而确定LINC00355的亚细胞定位 17]。数据表明,LINC00355主要分布在细胞质中(图 4(一))。因此,我们小组钻研LINC00355的下游microrna。应用生物信息学分析使用GSE90603获得神经胶质瘤肿瘤组织中的差异表达microrna。热点图如图 4 (b)。相交然后获得八个microrna的表达下调microrna在神经胶质瘤肿瘤组织和预测目标microrna使用miRDB程序( 18)(图 4 (c))。mir - 1225,其中八个microrna肿瘤抑制之前报道,吸引了我们的注意力,我们试图探索是否LINC00355[的目标 19, 20.]。mir - 1225的相对表达GSE90603数据如图 4 (d)。此外,qPCR化验显示,mir - 1225表达已故神经胶质瘤标本(图 4 (e))。此外,功能研究与CCK-8实验验证,迫使mir - 1225的表达导致显著抑制神经胶质瘤细胞生长(图 4 (f))。此外,LINC00355之间的结合位点和mir - 1225由miRDB预测程序呈现在图 4 (g)。之后,荧光素酶的记者分析被用来验证他们的互动。如图 4 (h),mir - 1225超表达抑制LINC00355野生型(WT)记者的活动但不是LINC00355变异(傻瓜)记者,这证实了他们的直接交互。此外,qPCR验证,LINC00355击倒了mir - 1225的表达升高,而LINC00355异位表达显著抑制mir - 1225水平(图 4(我))。此外,qPCR的数据也证实,增强mir - 1225表达导致LINC00355的抑制,而mir - 1225不足导致特别是LINC00355表达增加(图 4 (j))。总的来说,上述调查结果表明,LINC00355擦掉mir - 1225在神经胶质瘤细胞。

为了进一步阐明mir - 1225如何导致神经胶质瘤生长和转移,生物信息学算法,miRDB TargetScan,被用来确认目标基因介导神经胶质瘤mir - 1225的影响。然后我们分割的TargetScan的预测结果,miRDB, 1000调节基因在肿瘤样本(使用TCGA GEPIA程序分析的数据( 21])。我们发现14个常见基因(图 5(一个))。这些14个基因在胶质瘤的OS被GEPIA计划,随后分析,我们发现,只有BACE2 FNDC3B, PLTP OS有显著相关性(图 5 (b))。三个基因中,FNDC3B吸引了我们的注意,因为它与肿瘤发生和转移的不同癌症类型( 22, 23]。TCGA数据从数据集显示FNDC3B水平增加神经胶质瘤标本(图 5 (c))。此外,qPCR还证实,121年FNDC3B调节神经胶质瘤样本(图 5 (d))。此外,生物信息学分析使用GEPIA程序还表示,高FNDC3B显著降低患者无病生存(图 5 (e))。mir - 1225之间的预测结合位点和3 ′ utr FNDC3B mRNA呈现在图 5 (f)。此外,FNDC3B水平在神经胶质瘤细胞特别是抑郁与mir - 1225细胞转染时模仿,而mir - 1225抑制剂显著促进了FNDC3B水平神经胶质瘤细胞,这表明,mir - 1225表达与FNDC3B负相关(图表达 5 (g))。因此,我们接下来进行荧光素酶记者化验证明FNDC3B是否mir - 1225的直接目标基因。mir - 1225的数据表明,超表达非常压抑的神经胶质瘤细胞的荧光素酶活性与野生型(WT)转染预测结合位点荧光素酶记者向量,而mir - 1225没有影响荧光素酶活性与突变细胞转染(傻瓜)结合位点预测荧光素酶记者向量(图 5 (h))。因此,这些数据证明了FNDC3B mir - 1225在神经胶质瘤细胞的具体目标。

因为我们已经证明LINC00355擦掉mir - 1225,和mir - 1225目标FNDC3B在神经胶质瘤细胞中,我们想知道LINC00355能否调节FNDC3B。首先,qPCR是用于确定LINC00355的水平和FNDC3B mir - 1225后在神经胶质瘤细胞耗尽或过表达。观察,加强mir - 1225的表达水平显著降低引起LINC00355 FNDC3B,而推倒mir - 1225能够提升LINC00355和FNDC3B表达式(图 6(一))。然后,异位表达LINC00355能够促进FNDC3B表达式,和LINC00355过度也可能废除mir - 1225的抑制功能FNDC3B表达式(图 6 (b))。随后,我们组合成siRNAs针对FNDC3B (si-FNDC3B si-FNDC3B # 1, # 2, si-FNDC3B # 3)和应用qPCR检测可拆卸的效率(图 6 (c))。数据表明si-FNDC3B # 3击倒的最高效率。然后,我们执行功能的实验调查LINC00355能否恢复FNDC3B siRNAs的抑制性影响细胞生长和迁移。CCK-8化验表明,抑郁症的FNDC3B si-FNDC3B # 3抑制胶质瘤细胞的细胞增殖,而重新LINC00355能够逆转细胞增殖抑制的si-FNDC3B # 3(图 6 (d))。从伤口愈合化验也观察到类似的结果LINC00355过度可能恢复si-FNDC3B # 3对神经胶质瘤细胞的抑制影响迁移(图 6 (e))。综上所述,上述数据表明LINC00355调制神经胶质瘤恶性行为通过mir - 1225 / FNDC3B轴。