一种新的错义突变的评价ABCB4基因导致进步家族性肝内胆汁淤积型3型

摘要

进行性家族性肝内胆汁淤积症3型（PFIC3）是一种主要发生在儿童期且难以诊断的肝脏疾病。PFIC3是一种罕见的常染色体隐性疾病，由两种等位基因的基因突变引起ABCB4，导致胆汁分泌途径的中断。识别ABCB4不同突变引起的致病效应是揭示疾病内因的关键。这些突变导致MDR3蛋白的截断、不稳定、错误折叠和转运受损。在这里，我们报告了一个女孩，有肝内胆汁淤积和进行性肝硬化的历史，γ -谷氨酰基转移酶水平升高。遗传筛查通过全外显子组测序发现一个新的纯合错义突变ABCB4：c.1195G>c:p.V399L，患者被诊断为PFIC3。各种计算工具预测该变体有害且进化保守。对于功能表征研究，质粒，编码ABCB4在人类胚胎肾（HEK-293T）和肝细胞癌（HepG2）细胞中表达野生型和选定的已建立的突变结构。体外表达分析发现，与野生型蛋白相比，突变蛋白的表达减少。我们发现ABCB4野生型定位于顶端小管膜，而突变型p.V399L显示细胞内滞留。细胞内误吸蛋白通常经历蛋白酶体或溶酶体降解。我们发现，经蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂巴非霉素A1处理后，V399L的MDR3表达显著增加突变V399L蛋白的MDR3表达减少可能是蛋白酶体或溶酶体降解的结果。药理调节剂环孢霉素A和细胞内低温（30°C）治疗显著挽救了突变蛋白的折叠缺陷和活性成熟。我们的研究发现了一种新的致病性突变，扩大了突变谱ABCB4并可能有助于了解PFIC3的分子基础。因此，基因筛查在PFIC3等罕见异源性疾病的诊断中具有决定性作用。

1.导言

进行性家族性肝内胆汁淤积3型(PFIC3)是异源性PFIC的一个亚类，是一种罕见的常染色体隐性肝脏疾病。它通常发生在婴儿期和儿童期，开始于持续的胆汁淤积，在儿童晚期之前发展为肝硬化和肝衰竭[1，2]．病理特征为肝导管增生和进行性肝内胆汁淤积伴-谷氨酰转肽酶(GGT)活性升高。PFIC3的基本遗传缺陷的特征是向胆汁分泌磷脂酰胆碱(PC)减少，进而损害胆汁分泌运输系统[3.，4]。PC分泌减少会导致肝脏中毒，并导致肝细胞破坏，进而发展为肝内肝硬化。

PFIC3患者一般为纯合型、杂合型或复合杂合型ABCB4突变。人类的双等位基因突变ABCB4，位于染色体7q21.1，编码脂质floppase MDR3蛋白，参与PFIC3的形成[5- - - - - -7]．MDR3主要表达于肝小管膜，作为磷脂转运体，即磷脂酰胆碱(PC)。它保护肝细胞膜免受胆盐的洗涤活性[8]．MDR3参与磷脂的floppase活性，将PC分子从肝细胞内小管膜转移到外小管膜[9- - - - - -11]．体外研究表明，PC floppase活性的缺乏会导致向小管膜的运输受损，停止与胆盐的结合，并使混合胶束不稳定。它可以通过游离胆盐的洗涤作用使根尖膜和肝胆上皮溶解，从而引起肝细胞的炎症和细胞死亡[12，13]．

以往的研究支持PFIC3的临床体征和病理结果是非特异性的证据，这使得三分之一的PFIC3患儿难以诊断[14]．如果不使用基因筛选和分析，很难诊断罕见疾病[15]。诊断依据的是肝组织学，包括导管增生、高水平肝酶、GGT和胆汁酸浓度。PFIC3患者可使用熊去氧胆酸（UDCA）治疗。熊去氧胆酸是一种亲水性胆汁酸，仅在近30%的病例中能恢复症状。在严重病例中，最终的选择是肝移植[5]．此前有报道称，ivacaftor (VX-770)也可用于此类患者的治疗ABCB4有缺陷的突变(16].来自动物模型的证据也表明MDR3功能的破坏会导致进展性肝硬化[9，17，18]．最近，研究发现亲水四羟基胆汁酸(THBA)对小鼠有肝保护作用，并能阻止与Mdr2相关的进行性肝病理^-/-突变(17]．

在目前的研究中，我们报告了一个13岁的女孩，有胆汁淤积史，进行性肝硬化，肝功能异常，病因不明。通过临床和遗传筛查，患者后来诊断为PFIC3。我们的目的是识别致病变异，并利用该变异确定其致病性体外分子测定。

2.材料和方法

２.１.临床描述

在本研究中，招募了一个四代家庭（图1）（中国哈尔滨）。谱系显示了先例的父母之间的血缘关系。证据有两个姐妹。一位老年人被诊断出患有7岁的肝硬化和肝硬化含量，并在10岁时死亡。妹妹正常，9岁。概念是一名13岁的女孩，被诊断出患有胆汁淤泥和相关的严重症状。从IV-7（副本），III-5（父亲）和III-6（母亲）获得临床信息和外周血。研究议定书由哈尔滨医科大学的机构研究委员会批准，并按照赫尔辛基宣言进行。所有参与者都提供签署的知情同意书。

2.2.致病基因检测

将外周血收集到合格的EDTA抗凝管中。根据制造商的协议，使用DNeasy血液和组织试剂盒(Qiagen， #69506，德国)提取基因组DNA。为了找到所有可能的致病突变，诺福金公司(中国北京)对先证者(IV-7)进行了全外显子测序(WES)。

2．3.变异分析

一种新的突变，ABCB4：NM_000443.3:exon11:c.G1195C:p.V399L，在下一代测序数据中发现。根据基于目标外显子组的下一代测序，用于PCR和候选基因DNA测序的引物序列ABCB4（外显子11）被设计（补充表1）.PCR的最终体积为50μl.在循环条件下，第一步(变性)在95°C下进行10分钟。然后对样品进行30个循环:30秒变性(在95℃)，30秒退火(在55℃)，30秒拉伸(在72℃)。终止反应，然后在72°C下延长5分钟。基于Sanger测序结果和NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)转录序列ABCB4:NM_000443.3，用作描述核苷酸替换的参考。

２.４.突变、细胞和转染

质粒Preciver-M02（GeneCopoeia，马里兰州，美国）含有ABCB4：以NM_000443.3为模板引入V399L和其他已建立的错义突变(S346I、T424A、I541F和R652G)通过定点快速突变系统(Trans BioNovo，北京，中国)根据试剂盒方案设计引物以产生位点特异性突变(补充表)2).全部ABCB4通过Sanger测序验证突变体构建体（补充图1）.

人胚胎肾HEK-293T细胞和肝细胞癌HepG2细胞(来自ATCC, Manassas, USA)以聚l -赖氨酸包被的六孔板密度 细胞/孔转染前24小时。质粒向量编码ABCB4分别用JetPRIME试剂(poly+转染，Illkirch，法国)将野生型和突变体(S346I, V399L, T424A, I541F和R652G)瞬时转染到HEK-293T和HepG2细胞中。研究突变蛋白是否如前所述经历了蛋白酶体或溶酶体降解[19]，细胞用10 μM MG132(蛋白酶体抑制剂)或0.1 mg/ml巴菲霉素A₁(溶酶体抑制剂)转染24小时后。10μM环孢菌素A 转染hrs以检查环孢菌素A对细胞内滞留突变体的影响。为了检查降低温度是否可以挽救突变体蛋白易位，转染后将细胞培养在30°C下。环孢菌素A、巴丝霉素A₁MG132是从德国达姆施塔特的Sigma-Aldrich公司购买的。

2．5．联用

免疫荧光检测:转染前将HEK-293T和HepG2细胞接种于6孔板玻璃盖玻片上24小时。转染48小时后，4%多聚甲醛室温渗透细胞20分钟，PBS-T在4℃洗涤10分钟，PBS-B (1% BSA)封闭30分钟。细胞与抗mdr3 P3II-26抗体(1:10 0)(CAT#: AM32042SU-N, OriGene Technologies, Rockville, USA)在4℃下孵育过夜，然后与抗小鼠alexafluor594标记抗体(Molecular Probes, Eugene, USA)在室温下孵育1小时。用DAPI对核酸进行染色。图片是通过徕卡DM5000B共聚焦激光扫描显微镜(徕卡Microsystems，索姆斯，德国)。

对于免疫印迹，48小时后在冰冷的裂解缓冲液中裂解细胞 转染的小时数。检查蛋白浓度通过BCA分析(Applygen Technologies，北京，中国)。裂解物以7.5%分离( ）SDS-PAGE转移到聚偏二氟乙烯膜上，然后用抗mdr3 P3II-26抗体(1:10 000)和抗小鼠抗体(1:10 000)孵育(Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA)。免疫印迹的β-肌动蛋白和单克隆抗体（英国Invitrogen）也作为参考对照。获得信号通过奥德赛clx成像系统(Li-COR，林肯，美国)。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院，Bethesda, USA)测量条带强度。

2.6。定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)

提取总RNA通过TRIzol试剂(Invitrogen，英国)根据制造商的协议。通过2的反转录合成了互补dna (cDNA)的第一链μg总RNA的转录子第一链cDNA合成试剂盒(Roche Applied Science, Alameda, USA)。以转录后的cDNA为模板进行qRT-PCR。以ACTB作为内参基因，采用LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green和LightCycler检测系统(Roche Applied Science)进行3个重复的qRT-PCR。qRT-PCR引物为人ABCB4: 5 -GAGAGGACACAAACCAGACAGCA-3(向前);5 -gtctgcccactctgcacctt-3（逆转）;人体活动：5 -CAGAAGGATTCCTATGTGG-3(向前);5 -CATGATCTGGTCATCTTC-3(反向)。计算相对定量表达量通过2^{−ΔΔ计算机断层扫描}方法

2.7。统计分析

采用单因素方差分析确定统计显著性(方差分析)和杜克多重比较测验。 被认为具有统计学意义。

2.8。在计算机分析

在1000基因组计划(TGP)中评估了变异频率(http://www.1000genomes.org)还有侏儒(https://gnomad.broadinstitute.org/）.基于美国医学遗传学和基因组学（ACMG）指导方针，解释了该变种的致病性。使用突变填料预测突变变体的潜在意义（http://www.mutationtaster.org/)，多酚-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)，筛选(http://sift.bii.a-star.edu.sg), PROVEAN (http://provean.jcvi.org/seq_submit.php)和MutPred2 (http://mutpred.mutdb.org/).进化保守性通过氨基化合物检查(http://www.aminode.org/)和UCSC(http://genome.ucsc.edu/)，用Jalview软件编辑多序列比对。此外，使用NetPhos3.1服务器预测磷酸化谱改变的任何变化(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/).选择显示分数0.5作为阈值。对于每个残基（即苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸），只有显示的最佳预测 被认为是磷酸化的。

3.结果

３．１．诊断为PFIC3患者的临床描述

先证者是这对近亲夫妻的第二个孩子，分娩正常。她在7岁时出现胆汁淤积和严重肝脏功能障碍的病史。疾病发生的进一步调查显示无肝病家族史。父母和妹妹(9岁)均正常，无胆汁淤积性肝病，其中一个姐姐在10岁时死于胆汁淤积性肝病。先验者的全面体格检查显示轻微黄疸，超声报告显示胆囊炎、胆石、肝硬化、腹水和肝脾肿大。总的来说，该家族的系谱表现为常染色体隐性遗传模式(图)1）.

入院时的实验室检查结果显示，血浆中总胆红素、直接胆红素、网织红细胞、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）和胆汁酸升高（补充表3.).全血细胞计数（CBC）显示血红蛋白水平和网织红细胞水平较低的贫血。根据临床数据和与血清GGT升高相关的其他实验室细节，该患者后来被诊断为PFIC3。由于肝组织不可用，因此未对该患者进行免疫组化染色。

３.２．ABCB4的变异分析:c。1195G>C Missense Mutation Found in Whole Exome Sequencing

为了识别潜在的致病基因，我们对先证者进行了全外显子测序。经遗传筛选，在第11外显子中发现了一个新的纯合子错义突变C . 1195g >CABCB4在chr7: 87073014 (GRCH37/hg19)，导致氨基酸位置399处缬氨酸(GTT)取代亮氨酸(CTT)。为了确定先证者的突变，先证者、她的母亲和父亲的目标DNA片段通过双向Sanger测序进行了分析。Sanger测序结果显示先证者为错义突变纯合(ABCB4: c.1195G > C)。纯合子模式也通过鉴定双亲中相同的杂合突变得到证实(图2（a）).WES数据中确定的错义变体定义为ABCB4: c.G1195C: p。V399L (NM_000443.3)，位于MDR3蛋白第一个walker A基段附近的ICD3结构域(图2（b））.

３．３．错义变体ABCB4: c。在硅分析中预测1195G>C是有害的

各种各样的生物信息学利用分析工具，发现了一个新的突变ABCB4：c.G1195C:p.V399L被预测为“致病性”得分为0.886的PolyPhen-2预测该变异可能具有破坏性。筛选结果表明，新突变p.V399L预测影响蛋白质功能，得分为0.003。突变品尝者还预测突变变异为致病性，概率值为0.99997。MutPred2解释预测得分为0。V399L为543（54%）（分数越高，致病性的概率越高）。PROVEAN预测突变为中性。此外，在Jalview的帮助下编辑序列的多序列比对[20，显示了这种新的突变ABCB4：c.1195G2)此外，netphos3.1服务器预测该突变不会通过翻译后水平的磷酸化变化干扰蛋白质的转运活性。错义变体，ABCB4: c.1195G < C: p。在人类变异数据库(1000 genome Project, dbSNP, EVS, gnome AD)中未发现V399L。它也没有在人类基因突变数据库(HGMD)中注册(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)或ClinVar (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar）.达到我们的知识，ABCB4: c.1195G < C: p。因此V399L被认为是一个新的突变。

3.4.MDR3蛋白的亚细胞定位显示ABCB4:c.1195G>c:p.V399L突变体的细胞内滞留

来检查其中的机制ABCB4突变影响易位，我们用免疫荧光法检测了MDR3的表达水平以及野生型和突变型蛋白在质膜上亚细胞定位的差异。我们假设由于V399L突变，蛋白质可能改变了细胞内滞留，这将阻止MDR3正常运行。转染48小时后，HEK-293T和HepG2细胞中的免疫荧光显示MDR3野生型完全表达在顶端质膜上。三个比较突变体S346I、T424A和R652G的MDR3表达也被发现定位并在质膜上表达，类似MDR3野生型。然而，我们观察到V399L的MDR3表达，就像I541F一样[21]，在血浆膜中不存在并显示细胞内保留（图3（a）和3（b））.

3．5．ABCB4: C . 1195g >C:p。V399L减少

从用于蛋白质表达分析的相同转染细胞中分离的RNA通过qRT PCR进行定量。相对mRNA值标准化为参考ACTBABCB4mRNA表达在细胞内观察ABCB4:c。1195G>C cells compared to theABCB4野生型细胞(图4（a）)此外，westernblot结果也证实了ABCB4与野生型相比，突变体V399L的MDR3表达显著降低ABCB4并建立突变体I541F（数字4 (b)和4 (c)).R652G的表达水平与野生型相当，而S346I和T424A的表达水平由于稳定性和活性缺陷而略有下降（先前报道）[21]．

基于定位受损，我们推测V399L突变体存在折叠或转运缺陷。转运缺陷蛋白通常经过蛋白酶体或溶酶体降解。我们观察到蛋白酶体抑制剂MG132处理后(图5(一个))以及溶酶体抑制剂巴非霉素A₁(图5 (b))， V399L的MDR3表达明显增加，与I541F类似。这些结果提示突变体V399L MDR3表达降低可能是蛋白酶体或溶酶体降解的结果，因为误吸和胞内滞留。

3.6。环孢素A和低温对转运缺陷突变体的挽救作用

检测环孢素A对转运缺陷突变体表达和功能的影响。先前的研究[19，22]表明环孢菌素A在功能上拯救了MDR3的运输缺陷突变体。我们检测了ABCB4：C.1195G> C：P.V399L可以通过环孢菌素A拯救。用10次治疗后 μM环孢素A，观察到V399L的MDR3表达显著增加（图6(一)）.因此，我们的研究结果支持环孢素A通过增加转运活性显著增加转运缺陷突变体的表达的证据。

此前，我们观察到，转运蛋白（如MDR3）中的大多数转运缺陷突变体对温度敏感。我们的结果还发现，通过降低温度，可以挽救质膜上转运缺陷突变体的表达（图1）6（b））.

3.7.变异ABCB4:c.1195G

ACMG指南用于评估已鉴定的变异的致病性。根据分类，一个强有力的致病性证据表明变异ABCB4：c、 1195G>c:p.V399L具有良好的稳定性体外或在活的有机体内支持基因变异对基因或产品（PS3）的破坏性效果的功能研究。表示中度致病性的两种指导证据如下：变体是在突变热点或良好的功能结构域（PM1）中，对照或群体数据库（EXAC，ESP和TGP）（PM2）不存在变体。支持致病性的三个关键证据是患有疾病（PP1）的受影响的家庭成员中的疾病的COSEGREGATIONATION（PP1），在基因中具有低良性变异率的小误码变异，并在疾病常见机制中作用（PP2），和patient’s phenotype highly specific for disease with single gene etiology (PP4) (also supported the variant as “pathogenic”). Thus,ABCB4：c.1195G > C: p。V399L错意变异具有1个强、2个中度、3个支持性的致病指导证据，符合ACMG对“致病”变异的标准。

4.讨论

在本研究中，我们报告了一名13岁女孩，其新的双等位基因突变为ABCB4，曾经历过病因不明的肝内胆汁淤积症。临床及实验室检查显示GGT明显升高。基于WES和遗传筛选ABCB4，患者被诊断为PFIC3。遗传分析，然后是Sanger测序显示患者是一种新的小麦义突变V399L的纯合（图2（a））.各种各样的生物信息学工具还预测了致病性的变体并参与了正常功能的破坏和MDR3蛋白的表达。生物信息学工具在评估突变对蛋白质结构，功能和构象和互动动力学的影响方面发挥了重要作用。根据HGMD（http://www.hgmd.org/) [23]，到目前为止，已有超过202种不同类型的胆道相关疾病的突变ABCB4发现超过55种变体与PFIC3相关（补充图。3A和B）.

不同类型的致病突变ABCB4(≥70%错义)与不同的临床结局相关，导致不同的累积风险。在功能鉴定的基础上，发现不同的错义变体对MDR3蛋白的功能、亚细胞定位和表达有不同的影响。这导致误诊，并使突变携带者的治疗策略复杂化。由于内质网的不恰当折叠和细胞内滞留，一些错义变体导致MDR3到根尖膜的运输受损，而内质网相关降解(ERAD)又会将其降解。部分突变体导致pc转运活性降低，部分突变体正常加工、表达并成功定位到目的位点，但由于蛋白不能与特定底物结合而影响其稳定性。患者携带ABCB4突变，不中断MDR3的折叠或运输到顶端膜，具有温和的PFIC3表型，并可对慢性UDCA管理作出反应[24]这种突变也会影响MDR3的功能和活性，导致表达在一定程度上降低，但不会损害PC易位途径。主要是纯合子ABCB4突变破坏了MDR3的表达和正常转运，导致细胞内滞留、过早降解和负调控PC转运活性的转运途径缺陷。具有此类突变的患者具有严重的进行性肝内胆汁淤积表型，UDCA治疗无效，有进行肝移植的风险。以往的研究报道，单等位基因错义突变的患者ABCB4与双等位基因错义或导致LOF和基因不稳定性的截断突变相比，具有较轻的表型和疾病进展ABCB4信使rna (5]．研究还发现，跨膜结构域的突变可能影响底物特异性，而保守氨基酸序列的突变，特别是walker motif (A和B)附近的突变，可能破坏MDR3蛋白的floppase活性[25- - - - - -30]．之前的一项研究对误义变异进行了分类通过基于不同影响蛋白的功能表征，无论是通过干扰成熟、活性、稳定性，还是没有可检测到的缺陷。

基于Delaunay等人之前的分类[21]Delaunay等人将无义和移码变异分为I类、II类成熟缺陷变异、III类影响转运活性的变异、IV类导致稳定性缺陷的变异和havi类变异ng对V类蛋白质无明显影响[21]．我们从每个类别(I541F-II、S346I-III、T424A-IV和R652G-V)中选择之前建立的变体并进行功能分类通过表达和亚细胞定位。我们发现我们的变体（V399L）表现出显着降低的表达和细胞内保留，如I541F-II。发现我们的突变是在第一个NBD的ICD3中的Walker A Motif的保守氨基酸序列附近，其中两个畸形变种（Y403h [31]及T424A [5])已针对PFIC3进行了报告。先前报道的变体I541F也位于NBD1的特征基序序列附近。

我们的结果还发现V399L的表达减少可能是由于蛋白酶体和溶酶体降解，同时保留在细胞内。以前，人们观察到保留在内质网中的某些突变体的靶向缺陷和蛋白质降解具有不正确的折叠。错误折叠或部分折叠的蛋白质是非活性的，由专门的伴侣识别，并由细胞的质量控制机制降解，确保只有正确折叠的蛋白质才能检测到其目标位点。药物调节剂或降低细胞内温度可以恢复缺陷转运和错误折叠突变蛋白的功能。我们观察到，通过药物伴侣、环孢菌素A和改变温度处理，运输缺陷突变体的易位、表达和成熟得以恢复。从以前的研究中观察到，如果运输缺陷突变蛋白能够得到适当的挽救，那么它将不会影响天然蛋白的活性或稳定性。

在我们的病例中，患者的父母没有症状，也没有任何肝脏相关疾病的家族史。但是，患者的姐姐在10岁时因误诊死亡。我们的患者通过WES、基因分析和Sanger测序诊断为PFIC3ABCB4证实了一个纯合错义突变。生化实验室报告也确诊为PFIC3，因为GGT水平高于其他类型的PFIC, GGT水平正常。通过利用下一代测序技术，以前的基因研究确定了五种PFIC类型的不同基因。在功能特征研究的基础上，发现不同类型的PFIC与肝细胞运输系统的突变有关[32]．

5.结论

综上所述，PFIC3(罕见)很难诊断，由于缺乏基因筛查和对潜在因素的识别咨询，有时会被误诊为其他肝病。WES和基因筛查在致病突变的鉴定和最终诊断中发挥着重要作用。小说的鉴定ABCB4(C . 1195g >C)突变在PFIC3患者中具有很高的临床意义，可能有助于扩大PFIC3的频谱ABCB4突变。我们的研究不仅为将突变与有害基因联系起来提供了遗传学基础，而且还提供了功能特征通过比较研究。我们的结果也支持环孢素A显著增加运输缺陷突变体表达的证据。

缩写

ABCB4：	ATP结合盒B亚家族成员4
BA1:	巴丝霉素A1
BCA:	Bicinchoninic酸化验
CsA：	环孢菌素一个
GGT：	Gamma-glutamyltranspeptidase
MDR3：	多药电阻类型3
PFIC3：	进行性家族性肝内胆汁淤积症3型
个人电脑：	磷脂酰胆碱
PCR：	聚合酶链反应
THBA:	四羟基胆汁酸
UDCA：	熊去氧胆酸
韦斯:	整体exome测序。

数据可用性

应要求，通讯作者可提供WES数据和用于支持本研究结果的所有相关材料。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

KS、QC、TZ、JB、WS和SF设计了本研究，并参与了本研究的各个方面。KS和QC做了文献回顾并起草了这份手稿。KS、TZ、SZ、QQ进行了实验。KS、XJ和WJ进行了WES数据分析。KS、JW、YW、JD进行了生物信息学研究和分析。WS, KS, TZ, JD和SF对这份手稿进行了批判性的审查。所有作者都参与了稿件的撰写，提出了建议并对稿件进行了批核。科马尔·萨利姆和崔清波对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

感谢患者家属参与本次研究。国家重点研发计划项目(No. 2016YFC1000504)。

补充材料

补充图1：描述了所有的ABCB4变异了通过利用位点特异性引物建立定点快速突变系统，并通过Sanger测序进行验证。补充图2:MUSCLE 3.6版本生成，Jalview 2.10.5版本编辑的不同物种间序列的多序列比对显示了新突变ABCB4: c.1195G < C: p。V399L具有物理化学和进化上的保守性。补充图3:说明根据HGMD (www.hgmd.org/)数据显示，到目前为止，已有不同类型的胆道相关疾病突变的报道ABCB4发现超过55种变异与PFIC3疾病相关。补充表1:描述了位点特异性引物序列设计用于PCR和DNA测序的候选基因ABCB4（外显子11）。补充表2：定义了已鉴定的V399L变体和其他已确定的错义突变（S346I、T424A、I541F和R652G）ABCB4建立了通过利用根据试剂盒协议生成的位点特异性突变引物建立定点快速突变系统。补充表3:患者入院时的实验室检测结果显示，血浆中肝酶，即总胆红素、直接胆红素、网红、γ -谷氨酰转肽酶(GGT)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)、胆汁酸升高。（补充材料）

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