在这项研究中,招募(图四代的家庭 1)(哈尔滨,中国)。谱系表明渊源者之间的血缘关系的父母。渊源者有两个姐妹。年长的人被诊断出患有肝硬化和肝脾肿大7岁和10岁去世。是正常的,妹妹是9岁。渊源者是一个13岁的女孩已经被诊断出患有胆汁郁积的肝脏和相关的严重症状。临床信息和外周血获得IV-7(渊源者),III-5(父亲),和III-6(母亲)。研究机构研究董事会批准的协议是哈尔滨医科大学并进行了符合赫尔辛基宣言。所有的参与者提供知情同意签署。

周边血液被收集到一个合格的抗凝剂EDTA管。使用DNeasy基因组DNA提取了血液和组织工具包(试剂盒,# 69506,德国)根据制造商的协议。为了找到所有可能的致病突变,全外显子组测序(韦斯)的渊源者(IV-7)是由Novogene有限公司有限公司(中国,北京)。

一个新颖的突变, ABCB4:NM_000443.3: exon11: c.G1195C: p。V399L,被发现在新一代测序数据。基于目标exome-based下一代测序引物序列用于PCR和DNA测序的候选基因 ABCB4(外显子11)设计(补充表 1)。PCR进行的最后一卷50 μl。循环条件下,第一步(变性)是在95°C执行10分钟。30秒的样本然后接受30周期变性(95°C), 30秒55°C的退火和30秒的扩展在72°C。反应终止,紧随其后的是最后一个延长5分钟在72°C。突变分析证实了基于Sanger测序结果与NCBI ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)记录的序列 ABCB4:NM_000443.3,作为参考来描述核苷酸替换。

质粒pReceiver-M02(美国马里兰州GeneCopoeia)包含一个完整的开放阅读框 ABCB4:NM_000443.3被用作模板引入V399L和其他建立错义突变(S346I, T424A、I541F R652G) 通过快速定点诱变系统(反式BioNovo,北京)。引物设计根据设备协议产生位点突变(补充表 2)。所有 ABCB4突变体结构被Sanger测序验证(补充图 1)。

人类胚胎肾hek - 293 t细胞和肝细胞癌HepG2细胞(美国马纳萨斯从写明ATCC)被播种到poly-L-lysine-coated six-well板的密度 3所示。5 × 10 5 细胞转染前24小时/好。质粒向量编码 ABCB4野生型和突变体(S346I, V399L, T424A、I541F R652G)瞬变转染到hek - 293 t和HepG2细胞,分别用JetPRIME试剂(Polyplus-transfection、Illkirch、法国)后,制造商的协议。检查是否突变蛋白进行了蛋白酶体或溶酶体降解如前所述 19),细胞治疗10 μM MG132 bafilomycin(蛋白酶体抑制剂)或0.1毫克/毫升₁转染24小时后(溶酶体抑制剂)。细胞治疗10 μ米环孢菌素转染6小时后检查环孢菌素A细胞内保留突变的影响。检查如果降低温度可以拯救突变蛋白易位,转染后细胞在30°C的环境。环孢菌素A, bafilomycin₁,MG132从Sigma-Aldrich购买(达姆施塔特,德国)。

免疫荧光,hek - 293 t和HepG2细胞被播种在玻璃盖玻片six-well盘子在转染前24小时。转染48小时后,细胞被固定和permeabilized 4%多聚甲醛在室温下20分钟,其次是PBS-T洗十分钟在4°C和PBS-B (1% BSA)阻止了30分钟。一夜之间,细胞被孵化与anti-MDR3 P3II-26抗体(1:100)(猫#:AM32042SU-N OriGene技术,罗克维尔市,美国)在4°C,其次是1小时孵化与anti-mouse AlexaFluor594-conjugated抗体(美国尤金分子探针)在室温下。核酸是用DAPI染色。图片是 通过莱卡DM5000B共焦激光扫描显微镜(徕卡微系统公司,德国索姆)。

免疫印迹,细胞细胞溶解在冰冷的裂解缓冲转染48小时后。蛋白质浓度检查 通过BCA化验(Applygen技术,北京)。溶菌产物分离7.5% ( w / v sds - page和转移到聚乙二烯二氟化物膜,其次是孵化的印迹,anti-MDR3 P3II-26抗体(1:1000)和anti-mouse抗体(1:10000)(Gilbertsville罗克兰免疫化学,PA)。免疫印迹的 β肌动蛋白单克隆抗体(表达载体,英国)也作为参考进行控制。获得的信号 通过《奥德赛》CLx-imaging系统(美国林肯Li-COR)。乐队的强度是衡量使用ImageJ软件(美国贝塞斯达国家健康研究所的)。

总RNA提取 通过试剂盒试剂(英国英杰公司)根据制造商的协议。第一股互补dna(互补)逆转录合成的2 μ使用Transcriptor g总RNA的合成第一链cDNA工具包(美国阿拉米达罗氏应用科学)。转录cDNA被用作模板中存在。使用ACTB作为参考基因,存在了一式三份的LightCycler由于“快速上手”项目DNA大师SYBR绿色和LightCycler检测系统(罗氏应用科学)。使用的引物中存在是人类ABCB4: 5 ′ -GAGAGGACACAAACCAGACAGCA-3 ′ (向前);5 ′ -GTCTGCCCACTCTGCACCTT-3 ′ (反向);人类ACTB: 5 ′ -CAGAAGGATTCCTATGTGG-3 ′ (向前);5 ′ -CATGATCTGGGTCATCTTC-3 ′ (反向)。相对定量表达式计算 通过2^{− ΔΔCt}方法。

使用单向方差分析确定统计学意义( 方差分析)和图基的多重比较检验。 P < 0.05 被认为是具有统计学意义。

变异的频率在1000人基因组计划的评估(TGP) ( http://www.1000genomes.org)和gnomAD ( https://gnomad.broadinstitute.org/)。根据美国医学遗传学和基因组学(ACMG)指南,致病性变异的解释。突变的潜在意义变异预测使用突变品酒师( http://www.mutationtaster.org/),PolyPhen-2 ( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/),筛选( http://sift.bii.a-star.edu.sg),PROVEAN ( http://provean.jcvi.org/seq_submit.php)和MutPred2 ( http://mutpred.mutdb.org/)。进化的保护被Aminode检查( http://www.aminode.org/)和加州大学( http://genome.ucsc.edu/),多重序列比对是由Jalview编辑软件。此外,NetPhos3.1服务器被用于任何变化的预测在磷酸化概要文件的变更( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。选择显示得分0.5作为阈值。(即为每个残渣。,threonine, serine, and tyrosine), only the best predictions with a display 分数 ≥ 0.5 被认为是磷酸化。

渊源者,血缘的夫妇的第二个孩子出生与正常交货。她提出了历史的胆汁郁积和严重肝脏故障7岁。疾病发生进一步的调查显示没有肝脏疾病的家族史。父母和妹妹(9岁)是正常的没有任何的证据淤胆型肝病而姐姐死于同一种疾病在10岁。全面体检的渊源者显示轻度黄疸,而超声报告显示胆囊炎,胆石,肝硬化腹水,肝脾肿大。总的来说,这个家族的血统继承的一种常染色体隐性模式(图 1)。

实验室测试结果在入学的时候透露,总胆红素、直接胆红素、网织红细胞,gamma-glutamyltransferase (GGT)、丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)和等离子体中胆汁酸升高(补充表 3)。全血细胞计数(CBC)显示贫血与低血红蛋白水平和网织红细胞。根据临床资料和相关实验室细节血清GGT升高,病人后来被诊断出患有PFIC3。免疫组织化学染色对病人没有完成,因为肝脏组织的不可用。

识别潜在的致病基因,我们全外显子组测序的渊源者执行的。遗传筛查发现小说纯合子的错义突变c。1195 g > C在第11外显子 ABCB4在chr7: 87073014 (GRCH37 / hg19),导致替换缬氨酸(GTT)亮氨酸(CTT) 399年在氨基酸位置。确定突变的渊源者,有针对性的从渊源者DNA片段,她的母亲和父亲被双向Sanger测序分析。桑格测序结果表明,渊源者是错义变异纯合子( ABCB4:c.1195G > C)。纯合性模式也证实了识别相同的杂合的变异在父母(图 2(一个))。韦斯的错义变体识别数据被定义为 ABCB4:c.G1195C: p。V399L (NM_000443.3)和位于附近ICD3域第一沃克MDR3蛋白质(图的主题 2 (b))。

各种各样的 在网上分析工具被使用,一种新的突变 ABCB4:c.G1195C: p。V399L被预测为“致病性。“PolyPhen-2以0.886的得分预测的变异可能是有害的。筛选结果表明,小说突变p。V399L是影响蛋白质功能预测得分为0.003。突变品酒师还预测疾病引起的突变变异概率值为0.99997。MutPred2解释的预测评分为0.543 (54%)V399L(高分数反映了高致病性的概率)。PROVEAN预测是中性的突变。此外,多序列比对的序列编辑的帮助下Jalview [ 20.),表明新的突变 ABCB4:c.1195G < C: p。V399L物化,在大多数哺乳动物的进化(补充图。 2)。此外,netphos3.1服务器预测,这种突变没有打扰的运输活动蛋白质磷酸化变化在转译后的级别。错义变体, ABCB4:c.1195G < C: p。V399L,没有发现在人类变异数据库(1000人基因工程,dbSNP,电动汽车,gnome广告)。还不是注册在人类基因突变数据库(HGMD) ( http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)或ClinVar ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)。据我们所知, ABCB4:c.1195G < C: p。V399L因此视为一种新的突变。

检查的机制 ABCB4突变影响易位,我们检查MDR3表达水平与野生型和突变体蛋白的亚细胞定位之间的差别在质膜使用免疫荧光。我们假设,因为V399L突变,蛋白质可能改变细胞内潴留,从而防止MDR3运转正常。转染48小时后,免疫荧光hek - 293 t和HepG2细胞表明MDR3野生型顶端质膜完全表达。MDR3的表达三个比较突变体S346I T424A, R652G也发现本地化,并表示在等离子体膜状般的MDR3野生型。然而,我们观察到V399L MDR3的表情,就像I541F [ 21),没有在质膜和显示细胞内保留(数字 3(一个)和 3 (b))。

从相同的转染细胞RNA分离用于蛋白表达分析被存在量化。相对ACTB mRNA的价值观被标准化的参考。的显著差异 ABCB4信使rna表达被观察到 ABCB4:c。1195年G>C cells compared to the ABCB4野生型细胞(图 4(一))。此外,免疫印迹结果还证实 ABCB4突变V399L明显减少MDR3表达式比野生型的 ABCB4,建立了突变I541F(数字 4 (b)和 4 (c))。R652G的表达水平与野生型,而S346I和T424A显示稳定和活动的表达减少,因为缺陷(之前报道) 21]。

基于本地化受损,我们怀疑V399L突变体进行了折叠或贩卖缺陷。贩卖缺陷蛋白通常经过蛋白酶体或溶酶体降解。我们观察到治疗后与蛋白酶体抑制剂MG132(图 5(一个))和溶酶体抑制剂bafilomycin₁(图 5 (b)),MDR3的表达V399L I541F一样,显著增加。这些结果表明,减少MDR3的表达突变V399L可能由于蛋白酶体或溶酶体降解因为mistrafficking和胞内潴留。

环孢菌素A的影响trafficking-defective突变体的表达和功能检查。先前的研究[ 19, 22]显示trafficking-defective突变体的功能上救出了MDR3的环孢菌素a .我们检查是否trafficking-defective突变 ABCB4: c.1195G > C: p.V399L可以拯救环孢菌素a治疗后10吗 μ米环孢霉素A,大幅提高MDR3的表达V399L观察(图 6(一))。因此,我们的研究结果支持这样的证据表明,环孢菌素显著增加人口贩运的表达缺陷突变体通过增加运输活动。

以前,这是观察到的大部分人口贩卖运输中有缺陷的突变体蛋白像MDR3温度敏感。我们的研究结果还发现,贩卖的表达缺陷突变体在质膜可以拯救通过降低温度(图 6 (b))。

ACMG准则进行评估确定的致病性变异。根据分类,致病性的一个强有力的证据表明,变异 ABCB4:c.1195G > C: p。V399L已经成熟的 在体外或 在活的有机体内功能研究支持的破坏性影响基因在基因或产品(PS3)。两个指导如下:证据表明适度的致病性变异的突变热点或完善的功能域(PM1)和变体是缺席控制或人口数据库(ExAC、ESP和TGP) (PM2)。证据支持的三个关键分致病性与疾病cosegregation影响家庭成员的基因导致疾病(PP1),错义变异的基因与低概率的良性变异和疾病的共同作用机制(PP2),和病人的疾病与单基因表型非常具体的病因(PP4)(也支持变种“致病”)。因此, ABCB4:c.1195G > C: p。V399L错义变体有一个强大的,两个温和,和三个支持指导证据支持致病性,充实ACMG的标准“致病”的变种。