Sialylation的分析,N聚糖分支和表达O聚糖在不育男性精浆

文摘

碳水化合物是已知的调解一些事件参与成功受精。虽然有些研究精浆蛋白质的糖基化,总多糖概要文件很少分析特性影响受精的潜力。在这个工作我们旨在比较一些精浆糖蛋白的糖基化特征肥沃,不育男性。以下结果来自我们的研究:(1)在人类精浆的存在和变化O有关聚糖被观察到;(2)的表达SNA-reactive唾液酸asthenozoospermia之间显著不同,normozoospermic(肥沃,不孕)组;(3)PHA-L-reactive高度支化的表达N聚糖oligozoospermic患者明显低于两normozoospermic组。表明适当的凝集素,使可能精确测定多糖的似乎是一个很好的补充质谱分析。凝集素的扩展面板用于进一步的研究。

1。介绍

尽管许多分子事件前直接配子的融合已经描述,andrologists仍然想知道蛋白质的影响在精浆成分和转译后的修改成功或失败的受精。雄性配子保持悬浮在精浆相对较短的一段时间,因为大多数的组件不太可能通过子宫颈(1,2]。精浆蛋白质的主要作用是维持精子decapacitated状态,在颈操作系统,从恶劣的环境和保护阴道的1,2]。然而,一些研究人员声称,精浆成分可能帮助精子穿透宫颈粘液的边界,是一些动物物种所示1,3- - - - - -5]。到目前为止,信息等的分子本质上可能的交互是不可用的。

近年来越来越多的夫妻面临怀孕问题刺激强化搜寻男性生育能力下降的原因。标准精液分析,包括精子数、能动性、形态、和活力,似乎是作为一个预测因子不足,因此需要建立新的生物标志物,有助于评估男性生育能力,成为严重的挑战[6- - - - - -8]。

它已经表明,精浆糖蛋白的糖半个包含一些特殊的聚糖,很少出现在正常的生理条件下,在组织和其他体液的健康人。high-mannose类型低聚糖的义务的存在是证明开创性glycodelin [9),建议对PSA(前列腺特异抗原)和PAP(前列腺碱性磷酸酶)[10,11]。除了终端甘露糖的表达,额外lactosamine单位和GalNAc存在N聚糖,缺乏在大量聚糖唾液酸,极其岩藻糖含量高,大量的分支N聚糖已报告(了12- - - - - -14])。这些结构特点是提到不仅在彭日成的工作等。15),到目前为止唯一的作者谁提出详细的人类精浆成分glycome,而且在报道关于特定糖蛋白的糖基化,像PSA或行动党,和与男性生殖系统的疾病11,16- - - - - -18]。另一方面,也在我们的早期研究中,糖基化的一些改变配置文件被发现与生育有关的地位。低程度的开创性的纤连蛋白sialylation与不育男性精液参数异常(19,20.]。增加fucosylation被发现在许多糖蛋白(21),而不同的触角的岩藻糖表达检测免疫球蛋白g和分泌IgA的组件22,23]。在上面提到的研究彭日成et al。15的精浆glycome研究只有4个样品的肥沃的男人。低聚糖的主体间的变化是实质性的;因此,健康和患病的样本的比较必须招收更大样本组。然而,这似乎很难通过质谱分析。

因此我们的目标是学习如果多糖结构的一些到目前为止所描述的特性可能会改变精浆glycome不育男性,如果这些潜在的改变也可以检测并通过凝集素的反应性测量。除了凝集素通常用于这种目的,专用sialylation分析,我们也试图对多糖的研究分支PHA-L (菜豆leucoagglutinin)和完整的表达和截断O聚糖与MPL (Maclura pomifera凝集素)和VVL (野豌豆属摘要凝集素),分别。

2。材料和方法

2.1。临床样本

精浆样本来自男人生活在没有孩子的夫妻(至少一年的无保护性交怀孕没有实现),参观妇科、产科和新生儿学Wrocław医科大学进行宫腔内人工受精。受精的准备射精,每个样品相同体积的缓冲盐厄尔的解决方案是添加到改善精子的运动性。增加精子浓度,在精液对女性生殖系统的引入,精子被轻轻离心机(400×g,在室温下10分钟),和颗粒1毫升的厄尔的解决办法是补充道。上层清液(精浆稀释1:1与厄尔的解决方案)被倾析收集。这个分数(体积取决于样本)构成了对我们的调查材料。

从131年获得的样本没有孩子的男人25-46岁,基于标准的精液分析的结果(体积,pH值、形态、精子浓度、能动性,和可行性)根据世卫组织标准(24》,分为以下组:normozoospermic不育(精液参数正常,67名患者),asthenozoospermic(总运动性< 40%或进步的能动性< 32%,1 h射精后;27名患者),oligozoospermic(精子数量< 15×10⁶/毫升的精液,15例),oligoasthenozoospermic(减少数量和异常精子的运动性,22名患者)。对照组为肥沃的normozoospermic志愿者与生育证明(至少有一个孩子;25-46岁;38科目)。normozoospermic肥沃和不育精子的数量高于样品15×10⁶/毫升的精液和超过4%表示正常精子形态总运动性≥40%或进步的能动性≥32%,1 h射精后。标准的精液分析实验室诊断,学术医院,Wrocław医科大学。所有样本收集后获得患者的知情同意,研究获得Wrocław医科大学生物伦理学委员会批准(KB-631/2012)。

2.2。由Lectin-ELISA精浆聚糖测定

总碳水化合物抗原表位的表达与描述的直接lectin-ELISA法测量我们先前岩藻糖(25,26]。糖蛋白sialylation决心使用两个生物素化的凝集素:Maackia amurensis凝集素、MAA和Sambucus黑质凝集素、系统网络体系结构(SNA)承认唾液酸α2、3,α2,分别6-linked(向量实验室Inc .,伯林盖姆、钙、美国)。的表达O聚糖研究与生物素化的凝集素:Maclura pomifera植物血凝素、MPL和野豌豆属摘要凝集素,VVL(向量实验室Inc .,伯林盖姆、钙、美国),检测完成O聚糖及其形式截单GalNAc (Tn抗原),分别。高度支化的表达(tri -和tetra-antennary)N测定了部分聚糖菜豆leucoagglutinin PHA-L(向量实验室Inc .,伯林盖姆、钙、美国),具体β1,6-linked GlcNAc发生在聚糖在第三个天线(27,28]。

微量滴定板的井被涂上一层精浆样本包含800 ng的蛋白质在10毫米TBS, pH值7.5,孵化在室温下过夜。与TBS洗涤后,免费绑定网站被封锁的1% BSA溶液在TBS (2 h RT)。然后用生物素化的盘子是孵化凝集素(1 h, 37°C)稀释10毫米TBS-T如下:共1:500年,系统网络体系结构(SNA) 1: 1000年,MPL 1: 1000年,VVL 1: 1000年,PHA-L 1: 500。接下来,盘子是孵化phosphatase-labelled ExtrAvidin(σ化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)为30分钟37°C和稀释与TBS-T CaCl 1毫米₂1毫米MgCl₂系统网络体系结构(SNA), 000, 1: 20 MAA MPL, PHA-L VVL或1:000。孵化后对硝基苯磷酸磷酸酶反应了作为衬底。与100年反应停止μL 1 M氢氧化钠/好,吸光度是阅读在405 nm,参考滤波器630海里StatFax 200标(感知技术公司,棕榈城,FL,美国)。每一步孵化后板被广泛用TBS-T(包含0.05% Tween-20 TBS, pH值7.5)。所有样品都在重复分析。背景吸光度测定样品中所有试剂都在场,但精浆TBS-T所取代。凝集素的相对反应活性在吸光度单位(AU)表示。背景不高于0.2 AU吸光度值。样本被分析的时候,因为他们编码连续招生的时候,没有任何诊断组,他们运行在一个随机的顺序对组。

2.3。统计分析

统计分析使用统计软件进行STATISTICA 10.0 (StatSoft Inc .)、塔尔萨,美国)。实验数据提出了均值和标准差(SD)和分配的值在分析团体提出了box-whisker情节用中位数和四分位(25 th - 75)范围内。据Shapiro-Wilk测试值不符合正态分布;因此,非参数Kruskall-Wallis方差分析测试是用来确定各组之间的差异。95%的置信区间估计的相关性根据斯皮尔曼测试。统计学意义是接受双尾值小于0.05。

3所示。结果

反应性的精浆糖蛋白选择小组提出了凝集素的平均吸光度和标准偏差表1并呈现在图的分布值1。唯一的五个研究外源凝集素表达的患者没有明显的统计学差异组VVL,具体为截断O聚糖局限于单一GalNAc (Tn抗原)。完全的表达O聚糖减少发生在两组:normozoospermic不育和oligozoospermic科目。Oligozoospermic精浆样本也受修改影响唾液酸的表情。减少MAA-reactive,因此α2,3-linked唾液酸(SA)相比显著normozoospermic不育和asthenozoospermic组,而比较α2,6-linked SA oligozoospermic和asthenozoospermic组织显示增加的凝集素活性在前一个。观察在asthenozoospermic精浆减少SNA-reactive SA与两个相比,肥沃,不孕,normozoospermic组。

斯皮尔曼相关因素接近0.2,因此建议可能的弱相关性MPL和MAA (,)和系统网络体系结构(SNA)和PHA-L反应(,)。弱,但发音之间的相关性被发现O聚糖特定凝集素(MPL VVL,,)。当唾液酸特定的凝集素进行了分析,计算的值和。斯皮尔曼等级测试也被用来评估协会精浆凝集素活性的糖蛋白与精液参数获得的标准考试。中凝集素只测试系统网络体系结构(SNA)和PHA-L被发现与精子数量和活性(图2)。深刻的多糖分支和α2,6 SA)表达与精子数目和活性呈正相关。应当被视为软弱,虽然相关性价值观决定在斯皮尔曼等级测试中,远低于0.05,使其可靠。

4所示。讨论

精浆蛋白质的作用在成功受精仍然在人类的问题。研究人员缺乏实验数据,可以阐明这个问题;然而,有趣的是一些关注来自动物实验的结论。研究ram精子,理查德et al。5]认为接触附睾的精子精浆有有益的影响导线子宫颈的能力。有趣的是,尽管没有直接影响精子的运动性,迁移通过宫颈粘液明显改善。苏亚雷斯和佩1]建议的角色之一,精浆可以协助精子宫颈迁移。相反的提到的数据,暴露的不利影响精子的精浆蛋白质的最终影响受精也报道(4,29日,30.]。到目前为止,这种支持的分子性质尚未阐明。protein-carbohydrate相声是一种常见的调控机制,问题是如果可能改变糖基化配置文件可能会影响的交互旨在维持精子活力和援助子宫颈的入口。精浆的独特功能糖基化使这种方法有前途。

在我们先前的研究已经发现了一些sialylation的改变和fucosylation几种精浆糖蛋白可以与男性的生育状态(19- - - - - -23,31日]。在更一般的方法我们也报道称,大幅增加fucosylation可能是许多精浆糖蛋白的不育男性的共同特征,无论他们的精液参数21]。在这项研究中,我们的目的是为了获取一般看总表达式选择糖基化特性,学习如果低聚糖的一般模式装修的糖蛋白可能与男性生育能力的潜力。作者研究了精浆糖蛋白的糖基化关注的实质表现高度支化的三tetra-antennary低聚糖,尤其是在PSA在前列腺病变(16- - - - - -18,32]。这种结构的存在也被证实在本研究中通过PHA-L绑定。凝集素的反应性显著减少oligozoospermic normozoospermic相比(肥沃和不育)科目。Oligozoospermic组似乎是受影响最严重的一个关于改变的表达聚糖。除了VVL凝集素,不区分分析患者,其余四个凝集素的反应是能够辨别oligozoospermic患者normozoospermic肥沃的(MPL和PHA-L), normozoospermic不育(MAA和PHA-L),或asthenozoospermic主题(SNA和MAA)。凝集素的分析coreactivity建议也重要N聚糖高度支化和α2,6 sialylated (SNA和PHA-L正相关)O聚糖被终止α2,3-linked SA (MPL和MAA正相关)。略强正相关的MPL VVL反应可能表明当O糖基化途径是愈演愈烈,一些聚糖后仍不拉长GalNAc附件对丝氨酸/苏氨酸。另一方面,SA-specific之间的负相关凝集素可能会建议一些竞争的sialyltransferases SA受体网站在糖基化的过程。

更有趣的是多糖的协会简介与精液参数。正相关的和低价值之间PHA-L相对反应活性和精子数量确认前观察oligozoospermic组PHA-L反应性下降。系统网络体系结构(SNA)相关的反应似乎总精子的运动性(),这证实了有关两国差异观察normozoospermic团体和asthenozoospermic病人。

在所有的糖基化研究的基础上,应用凝集素,结果不能反映准确的低聚糖的结构。凝集素可以绑定不喜欢但也足够丰富的结构和可能无法绑定聚糖构象上隐藏在糖蛋白的结构。尽管这个缺点,凝集素活性反映了真正的可访问性的分析glycoepitopes原生微环境也因此他们潜在的相互作用在活的有机体内(19,20.,22]。

精浆蛋白质的糖基化是值得更详细的研究,可以帮助协会的糖基化剖面与男性生育能力潜在和解释的糖蛋白的糖基的作用过程,调节受精。显然,低聚糖分支,O聚糖表达,sialylation程度可能被视为重要特性,影响维护条件,使精子与卵子融合。糖基化的差异可能是至关重要的即使它担忧糖蛋白发挥直接作用在受精过程中,比如glycodelin年代。这样一个至关重要的改变可能很难检测,或发现相对较小,在粗糙的材料,因为低浓度的糖蛋白的焦点。也有可能特殊糖蛋白的糖基化模式是不同的,因此平均在整个批量的糖蛋白。在未来的研究中我们关注模型糖蛋白的迹象,反映了糖基化模式的最佳方式,因此现在更多的样本之间的显著差异,同时将相对容易进行糖基化分析。表明适当的凝集素,使可能精确测定多糖的似乎是一个很好的补充质谱分析。凝集素的扩展面板用于进一步的研究。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

承认

这项工作是由波兰国家科学中心(批准号ncn - 786 - 2012)。

引用

1. 苏亚雷斯和a·a·佩西,“精子在女性生殖系统,运输”人类生殖更新,12卷,不。1,23-37,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. 博士r .争吵和l .,运输和精子获能精子,2008年全球医学图书馆的妇女。视图:出版商的网站
3. a . Arangasamy l·p·辛格n .艾哈迈德·m·r·安萨里和g . c . Ram”隔离和肝素和明胶绑定水牛精浆蛋白质的特征及其影响尾附睾的精子,”动物繁殖科学,卷90,不。3 - 4、243 - 254年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. t·莱希和s p·格拉夫精浆及其对反刍动物的影响精子处理期间,“在家畜繁殖卷,47岁,补充4,207 - 213年,2012页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. j·p·理查德。t .扎,c . Soleilhavoup et al .,“精浆艾滋病ram附睾的精子的生存和颈交通,“繁殖,卷148,不。5,469 - 478年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. l . Lefievre k . Bedu-Addo s·j·康纳et al .,“精子计数不添加任何更多:时间的新方程?”繁殖,卷133,不。4、675 - 684年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. c·l·r·Barratt曼塞尔,c . Beaton s Tardif和s·k·奥克森那姆,“男性infertility-the精子功能障碍的问题,诊断工具”亚洲男科学杂志》,13卷,不。1,53-58,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. m . Muratori s Marchiani l . Tamburrino g . Forti m . Luconi和e . Baldi”标记的人类精子功能ICSI的时代,“生命科学前沿,16卷,不。4、1344 - 1363年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. h . Koistinen r . Koistinen a .戴尔et al。”Glycodelin从精浆是一种糖基化的不同形式的避孕glycodelin-A,”人类生殖的分子,卷2,不。10日,759 - 765年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. j·m·马特l . Valmu p . Laakkonen U.-H。Stenman, h . Koistinen”结构特性和抗血管生成的属性精液中前列腺特异性抗原亚型,”前列腺,卷68,不。9日,第954 - 945页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. 刘贤白色,l . Rodemich j . o . Nyalwidhe et al .,“Glycomic描述前列腺特异性抗原在前列腺癌和前列腺酸性磷酸酶和良性疾病精浆体液,”蛋白质组研究期刊》的研究,8卷,不。2、620 - 630年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. t . Vermassen m . m . Speeckaert n .腔s Rottey和j·r·Delanghe“糖基化前列腺特异抗原及其潜在的诊断应用,”我们共同Chimica学报,卷413,不。月19日至20日,第1505 - 1500页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. m . Ferens-Sieczkowska b Kowalska, e . m . Kratz“精浆糖蛋白在男性不育、前列腺疾病:有机会glyco-biomarkers吗?”生物标记物,18卷,不。1,10-22,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. s . Gilgunn p . j .康罗伊r . Saldova p . m .陆克文和r . j . O 'Kennedy”异常PSA glycosylation-a甜预测前列腺癌,”自然评论泌尿外科,10卷,不。2、99 - 107年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. P.-C。庞,天梭,e . z . Drobnis h·r·莫里斯,a .戴尔和g·f·克拉克,“分析人类的精浆glycome揭示了免疫调节碳水化合物官能团的存在,”蛋白质组研究期刊》的研究,8卷,不。11日,第4915 - 4906页,2009年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. 细野豪志(c .高手m . k . Nitta et al .,“碳水化合物结构和差动绑定的前列腺特异抗原Maackia amurensis凝集素在前列腺癌和良性前列腺肥大,”糖生物学,14卷,不。8,671 - 679年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. d . l .小气鬼,z, l . j . Sokoll h . Zhang和d . w . Chan“Glycoproteomics前列腺癌检测:血清PSA糖基化的变化模式,”蛋白质组研究期刊》的研究,8卷,不。2、613 - 619年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. 佐藤晴k .福岛t . s .爸爸,和k .山下式”α1、2-Fucosylated和β- - - - - -N-acetylgalactosaminylated前列腺特异性抗原作为一个有效的前列腺癌的标志,”糖生物学,20卷,不。4篇文章ID cwp197 452 - 460年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. 即Ka̧tnik-Prastowska, e . m . Kratz r . Faundez和a . Chełmońska-Soyta”的低表达α2,3-sialylated纤连蛋白的改变和外观asialo-fibronectin改变与高浓度的纤连蛋白在人类精液参数异常的精浆中,“临床化学和实验室医学,44卷,不。9日,第1125 - 1119页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. e . m . Kratz r . Faundez,即Ka̧tnik-Prastowska,海藻糖和人类重要纤连蛋白和唾液酸的表情α₁酸与leukocytospermia相关糖蛋白的不育男性。”疾病标记没有,卷。31日。5,317 - 325年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. b . Olejnik e . m . Kratz m·齐默和m . Ferens-Sieczkowska”糖蛋白fucosylation增加临界正常值男性精浆,”亚洲男科学杂志》,17卷,不。2、274 - 280年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. e . m . Kratz m . Ferens-Sieczkowska r . Faundez和i Ka̧tnik-Prastowska,“变化fucosylation人类重要的免疫球蛋白和分泌组件leukocytospermic IgA的病人,”Glycoconjugate杂志没有,卷。31日。1,51-60,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. e . m . Kratz和m . Ferens-Sieczkowska”协会的IgA分泌组件sialylation leucocytospermia不育男士试点研究,“Andrologia,46卷,不。10日,1200 - 1202年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. 世界卫生组织,那些为人类精液的检查和处理实验室手册吗新闻,瑞士日内瓦,2010年。
25. m . Ferens-Sieczkowska和b . Kossowska触珠蛋白fucosylation在卵巢癌患者腹水液体,“临床和实验医学的进步,13卷,不。4、581 - 587年,2004页。视图:谷歌学术搜索
26. m . Ferens-Sieczkowska e . m . Kratz b . Kossowska e . Passowicz-Muszyńska和r . Jankowska”比较结合珠蛋白和alpha1-acid糖蛋白的糖基化血清的小细胞和非小细胞肺癌病人,”卫生和实验医学的进步卷,67年,第836 - 828页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. r·e·施瓦兹d . c . Wojciechowicz p y公园,p . b .徽章,“Phytohemagglutinin-L (PHA-L)凝集素表面绑定N有关β1 - 6碳水化合物及其关系激活ras基因突变在人类胰腺癌细胞系,”癌症的信,卷107,不。2、285 - 291年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. w·k·f·Seelentag W.-P。李,S.-F。施密茨h . et al .,“预后的价值β1,6-branched寡糖在人类大肠癌癌。”癌症研究,卷。58岁的没有。23日,第5564 - 5559页,1998年。视图:谷歌学术搜索
29. t . l . Tollner ai yudi, a . f . Tarantal c . a . Treece j . w . Overstreet和g . n . Cherr”Beta-defensin 126猕猴精子介导附件表面的精子oviductal上皮细胞,”生物的繁殖,卷78,不。3、400 - 412年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. w .悦,l .史z呗,任y, y赵,“十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) ram与精液精浆蛋白质及其相关特点,“动物繁殖科学,卷116,不。3 - 4、386 - 391年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. e . Kratz d . c . w .波兰,w·冯·迪克和i Ka̧tnik-Prastowska,“改变分支和微分在alpha-1-acid唾液酸糖蛋白的表达在人类精浆中,“我们共同Chimica学报,卷331,不。1 - 2、87 - 95年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. 美国烟灰墨,Arai k . s .非,K.-I。吉田,”系列凝集素亲和色谱法显示改变asparagine-linked链结构的前列腺特异性抗原在人类前列腺癌,”《色谱B:生物医学科学和应用程序,卷727,不。1 - 2,9-14,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2015 Ewa m . Kratz等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。