单核苷酸多态性在P2X7基因与血清免疫球蛋白G的反应相关联结核分枝杆菌肺结核患者

文摘

客观的。我们的研究调查之间的关系P2X7基因的单核苷酸多态性(snp)和血清免疫球蛋白G(免疫球蛋白)反应在结核病患者结核分枝杆菌(MTB)。方法。共有103名结核病患者作为病例组和对照组87健康个体在同一地理区域。SNP检测1513 C > C - -762 t >执行使用PCR-RFLP,结核分枝杆菌和血清免疫球蛋白的水平反应在所有受试者被确定。结果。AC和CC 1513 > C和TC和CC -762 t > C有更高的频率,以防组比对照组。结核病患者携带TC和CC的-762 t > C阳性结核分枝杆菌免疫球蛋白反应率高于那些携带TT。此外,病人携带TC和CC -762 t > C在痰结核分枝杆菌有更多比携带TT。结论。P2X7 SNP, 1513 C > C - -762 t >,可能与结核病易感性相关,和-762 t > C SNP可能导致结核分枝杆菌的发展。突变基因型-762 t > C (TC和CC)可以降低人类结核分枝杆菌的吞噬能力,导致结核病的发病率增加。

1。介绍

结核病是一个全球公共卫生优先级和仍然是全世界感染相关性死亡的第二大原因(1]。世界卫生组织(世卫组织)估计,有900万人被诊断出患有结核病,2013年有150万人死于这种疾病(死亡人数从2012年的130万年预估)2]。结核病是很大程度上造成的结核分枝杆菌(MTB)已经感染了世界人口的三分之一,但只有3 ~ 10%的感染者发展成活动性疾病在他们的一生中,和90%的感染者无症状的潜伏性感染(3]。多种因素导致结核病的感染的风险和发展,包括环境因素,如社会经济条件、急性感染、吸烟、宿主-病原体相互作用和遗传因素(4,5]。流行病学研究报道,结核病在人类的发展和发展是与基因多态性密切相关;到目前为止,基因的多态性维生素D受体,SLC11A1,肿瘤坏死因子-α,toll样受体2,单核细胞化学引诱物蛋白1已确定与结核病易感性(6- - - - - -9]。

P2X7受体主要表达于造血,间叶细胞、上皮细胞和神经血统,在其中扮演着重要的角色在免疫、炎症、神经功能、骨内稳态,和肿瘤(10]。人类P2X7包含13个外显子编码P2X7受体和基因位于染色体位置12抓起这地区相关炎症和精神疾病11]。P2X7激活引发一系列的下游信号事件,在一个细胞特定的方式,包括细胞增殖或死亡的释放,促炎介质,造成细胞内病原体的12]。一些研究报道,几个单核苷酸多态性(snp)P2X7基因导致受体功能的降低或损失,和最常见的snp涉及1513 > C和-762 t > C [13,14]。积累的研究表明,这两个单核苷酸多态性P2X7在结核病易感性基因发挥重要作用,而没有显著联系-762 t > C多态性(15,16]。然而,一些先前的研究证明没有相关性P2X7与结核病易感性基因单核苷酸多态性(17,18]。尽管有越来越多的研究调查之间的关系P2X7基因单核苷酸多态性和结核病,探索是否很少P2X7基因单核苷酸多态性影响免疫球蛋白G(免疫球蛋白)结核分枝杆菌的反应。结核分枝杆菌抗体的检测在一个病人的血清很简单,适用于各种设置,并提供非常快速的结果(19]。几项研究在人类和动物模型报道,anti-MTB浓度依赖的感染,他们与分枝杆菌负担的程度(20.,21]。它已经证明了抗体α晶状体蛋白是一种很有前途的目标对于患者的血清学诊断活动性结核病患者(22]。因此,我们进行了病例对照研究,以确定单核苷酸多态性之间的关系P2X7基因和易感结核病和进一步检查的作用P2X7基因单核苷酸多态性在结核分枝杆菌的血清免疫球蛋白水平应对结核病患者。

2。材料和方法

2.1。道德声明

这项研究的目的是在严格的一致性协议建立了新疆特有的伦理委员会重点实验室和民族疾病通过与新疆省教育部合作,和知情同意签署的所有参与者。所有实验过程研究的基础上进行了赫尔辛基宣言》(23]。

2.2。主题

共有103名结核病患者(64男性和39岁的女性;42例汉族,30例维吾尔和哈萨克族的31例)平均年龄为48.6±14.9岁,住院2014年1月至2014年11月在新疆特有民族疾病的重点实验室合作通过与新疆省教育部,加入到我们的研究为病例组。所有患者被诊断为结核根据中国卫生部公布的诊断标准(ws288 - 2008,http://www.moh.gov.cn/zwgkzt/s9491/200801/38801.shtml)或草案预防结核病的全球战略和目标,2015年之后,治疗和控制世卫组织(http://apps.who.int/gb/ebwha/pdf_files/WHA67/A67_11-en.pdf)。入选标准如下:(1)结核病的诊断是根据临床表现,细菌培养,和影像检查,根据中国卫生部公布的诊断标准;(2)在原发性肺结核患者。排除标准如下:(1)患者相似的结核病的症状;(2)结核患者并发症的慢性阻塞性肺疾病(COPD)、哮喘、肺炎、癌症、糖尿病或高血压,等等;(3)患者heredofamilial历史;(4)免疫功能低下的患者(艾滋病毒感染、脂肪瘤或激素或器官移植的长期坚持,等等)。此外,我们的研究也招收了87名健康对照组(51岁男性和36女性;35例汉族、维吾尔族的25例,27例哈萨克族)平均年龄为47.0±14.5年在同一地理区域。没有统计不同年龄,性别,和种族之间的宪法例和对照组(所有P> 0.05)。

2.3。样品收集

外周血中所有科目(10毫升)收集后的第二天早上空腹10到12 h,放入两个管(5毫升/管)。第一个5毫升添加乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。自然冷却至室温后一个小时后,混合物在3000转离心10分钟分离外周血单核细胞。从外周白细胞DNA提取使用DNA提取工具包(北京Tiangen生物技术有限公司,中国,DP318-03)。另5毫升外周血在3000转离心10分钟4°C收集上层的。随后,上层清液又离心机在12000 rpm在4°C提取血清5分钟。血清是分装到200年μL管,然后存储在冰箱−80°C为进一步使用。

2.4。单核苷酸多态性检测

两个单核苷酸多态性(1513 C > C - -762 t >)P2X7基因被选为研究目标。聚合酶链reaction-restriction片段长度多态性(PCR-RFLP)是用于分析1513 > C和PCR对-762 t > C snp。由总理5.0软件(PCR引物的设计http://www.premierbiosoft.com/由上海生物工程公司)和形成的。引物序列,SNP-amplified片段长度,退火温度和循环数被列在表中1。PCR成立于20卷μL,包含2μL 10 x PCR缓冲,2μL脱氧核苷三磷酸(核苷酸)(每个2.5更易/ L), 0.5μL (10 pmol /μL)上游和下游引物2.5 U铂Taq DNA聚合酶(表达载体生物技术有限公司,上海,中国),和50 ng基因组DNA。PCR扩增1513 C >包括初始变性在95°C 3分钟,50年代在94°C变性,退火在64°C 45 s,在72°C和扩展了30年代,共有35周期,紧随其后的是最后在72°C扩展了10分钟。316个基点的扩增片段长度。PCR产品消化在37°C 3 h和有二世(Promega,美国)和产品在1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳确定基因型。PCR扩增-762 t > C是如下:最初在95°C prenaturation 5分钟,变性20年代在94°C,退火在65°C 30年代,在72°C和扩展了30年代,共有10个周期,紧随其后的是最后在72°C扩展了10分钟。放大产品可视化1.5%琼脂糖凝胶电泳确定基因型。

1513年和-762年网站的重复P2X7基因酶消化和PCR后呈现在图1。如图1(一)1513网站是AA时,网站没有限制性内切酶片段长度是316个基点限制性内切酶消化后二世。当1513网站是CC、199个基点和120个基点的片段。1513网站交流的时候,316个基点,199个基点和120个基点碎片展出。如图1 (b)-762网站是CC, PCR产品373个基点和235个基点。当-762网站TT, PCR产品373个基点和186个基点。-762网站TC时,PCR产品373个基点,235个基点和186个基点。

2.5。检测血清免疫球蛋白g的反应快艇抗原

蛋白质芯片设备检测结核分枝杆菌免疫球蛋白反应(南京波拖马可河生物技术有限公司,中国,S20050089)采用,使用三个MTB复杂的特定抗原(16 kDa, 38 kDa, lipoarabinomannan (LAM))测定血清中免疫球蛋白反应快艇。结果被认为是积极的如果一个人三个抗体检测阳性;否则,结果被认为是负面的。患者的痰是安装在滑动。抗酸的染色后,下滑是光学显微镜下检查。细胞的数量和分布低放大倍数下观察(400 x),再均匀分布和伟大的形态学观察下油浸物镜(1000 x)抗酸的芽孢杆菌。连续观察任何一张(100 x)两次被认为是抗酸的细菌-和连续观察3 ~ 9件(100 x)两倍耐酸杆菌阳性。

2.6。统计分析

分析了所有的数据通过SPSS 18.0软件(美国IBM公司,萨默斯,纽约)。连续数据被表示为平均值±标准偏差(±SD),t以及执行或方差分析来检测组间比较。分类数据被表示为百分数,相比测试和确切概率法。哈迪温伯格平衡测试用于检测两组是否代表。此外,SHEsis软件被用来分析这两个单核苷酸多态性是否在连锁不平衡。基因型频率比较团体提出了优势比(或)和95%可信区间(CI)。所有P价值观是双面的,意义是水平P< 0.05。

3所示。结果

3.1。分布的P2X7单核苷酸多态性

基因型频率分布1513 C > C - -762 t >在两组与哈迪温伯格平衡一致,提供集团这两个单核苷酸多态性(所有代表性的证据P> 0.05)。这两个单核苷酸多态性与1.000的连锁不平衡和0.726的。表2提出了1513年的等位基因频率的比较> C - -762 t > C例和对照组之间的snp。AC和CC 1513 > C和TC和CC -762 t > C以防频率组高于对照组(P< 0.05)。交流和CC 1513 C >是结核病的风险因素,和C是结核病的风险等位基因(AC:或= 2.805,95% CI = 1.475 ~ 5.332;答:或= 3.606,95% CI = 1.473 ~ 8.829;C:或= 2.268,95% CI = 1.466 ~ 3.511)。此外,TC和CC -762 t > C是结核病的风险因素,和C是结核病的风险等位基因(AC:或= 3.581,95% CI = 1.800 ~ 7.123;答:或= 8.889,95% CI = 3.634 ~ 21.74;C:或= 3.451,95% CI = 2.240 ~ 5.315)。

3.2。血清免疫球蛋白反应快艇抗原

表中的数据2建议1513 C > C - -762 t >单核苷酸多态性可能与结核病易感性。积极的结核分枝杆菌的免疫球蛋白反应率在不同单核苷酸多态性的情况下组,见表3。结核病患者携带TC和CC的-762 t > C阳性结核分枝杆菌免疫球蛋白反应率高于那些携带TT (TC:P= 0.008;答:P= 0.030)。然而,没有显著性差异对结核分枝杆菌免疫球蛋白反应的阳性检出率之间抗原病人携带AC和CC 1513 > C和那些携带AA(所有P> 0.05)。

3.3。光学显微镜下检查

如表所示3-762 t > C SNPP2X7基因与结核分枝杆菌血清免疫球蛋白水平的反应。光学显微镜下检查显示在图2,我们发现积极的痰抗酸的细菌是19.0% TT运营商,TC运营商的48.9%,和57.1%的CC运营商和TC(图2 (b))和CC(图2 (c))航空公司-762 t > C比TT在痰结核分枝杆菌更大的航空公司(表4)。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们评估是否P2X7多态性赋予对结核病和snp协会的调查P2X7与结核分枝杆菌的血清免疫球蛋白水平反应抗原基因在结核病患者。我们的研究结果表明,1513 C > C - -762 t >单核苷酸多态性可能是结核病的开发和进展的危险因素。突变基因型-762 t > C (TC和CC)可以降低人类结核分枝杆菌的吞噬能力,导致结核病的发病率增加。

之一,我们的研究结果表明,增加交流的频率和CC 1513 > C和TC和CC -762 t > C在结核病患者观察,表明单核苷酸多态性P2X7基因与结核病有关。结核病的发展和恶化是由于宿主-病原体相互作用涉及许多复杂的元素在先天和适应性免疫系统(24]。巨噬细胞是主要宿主细胞胞内分枝杆菌复制并参与控制人类感染,在活化的淋巴细胞作为抗原呈递细胞感染地点(25]。细胞外腺苷三磷酸(ATP)介导巨噬细胞的杀菌活性的激活P2X7受体导致巨噬细胞的凋亡,哪些功能作为重要的宿主防御机制对MTB感染(26]。的purinergic P2X7受体是一种ATP-gated阳离子通道表达的免疫细胞,影响促炎细胞因子的释放单核细胞和巨噬细胞27]。集体,P2X7受体在巨噬细胞细胞表面高表达和活动的感染细胞通过细胞外ATP已经证实能杀死细胞内的细菌和寄生虫(28]。

的P2X7基因是高度多态和各种产生的单核苷酸多态性已报告的参与受体功能或表达的交替,特别是1513 C > C - -762 t >单核苷酸多态性(13]。Gartland和他的同事发表的一项研究报道单核细胞减少50% P2X7受体功能在1513 c复合杂合的功能完全丧失了1513 c纯合子(29日]。费尔南多等人还提出,1513年> C SNP提高结核病易感性,这种缺陷相关的结核分枝杆菌减少巨噬细胞杀死的能力(30.]。此外,-762 t > C变换可能下调一些转录因子的结合位点的函数序列,包括CCAAT增强子结合蛋白和GATA绑定因子,诱导P2X7受体功能的下降(25]。在我们的研究中,病人携带TC和CC -762 t > C比携带TT在痰结核分枝杆菌更大。因此,P2X7基因单核苷酸多态性引起的减少P2X7受体功能,设置一个障碍与ATP P2X7受体的结合,从而减少巨噬细胞杀死MTB的能力,这是与结核病的发病机理有关。

我们研究的另一个重要发现是,结核病患者携带TC和CC的-762 t > C阳性结核分枝杆菌免疫球蛋白反应率高于那些携带TT。在我们的研究中,我们使用三个MTB-specific抗原(16 kDa, 38 kDa,和LAM)决定性(anti-MTB)血清抗体。38 kDa抗原分泌,MTB特异性抗原可以达到高达90%的结核病诊断和16 kDa抗原是一种immunodominant结核分枝杆菌抗原,并包含特定的b细胞抗原表位复杂(31日]。LAM作为一个固有的结核分枝杆菌组成的细胞壁,能诱导人体产生anti-LAM抗体(32]。米林顿等人所描述的抗原引起强烈的t细胞免疫应答特定结核分枝杆菌的感染,也免疫诊断的关键(33]。在我们的研究中,一个积极的免疫球蛋白升高反应MTB于-762年发现t > C SNP。户珥等人也表明,显著提高免疫球蛋白反应16 kDa和38 kDa被观察到,这是符合我们的研究表明-762 t > C snp与结核分枝杆菌的发展(34]。

总之,我们的研究表明,1513年> C - -762 t > C snpP2X7基因可能与结核病易感性相关,和-762 t > C SNP可能导致结核分枝杆菌的发展。突变基因型-762 t > C (TC和CC)可以降低人类结核分枝杆菌的吞噬能力,导致结核病的发病率增加。功能的研究包括大样本大小需要确认的角色P2X7基因单核苷酸多态性的开发和进展结核和结核分枝杆菌的生长。

信息披露

江东吴和陆一派被认为是co-first作者。

利益冲突

不存在竞争的经济利益。

确认

这个项目是由中国国家自然科学基金,81160001号,81260261,81160192,30960355。作者想表达他们诚挚的感谢他们的老师对他们有价值的建议。

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