文摘

在细胞模型中,我们发现之间的联系chaperonin-containing t-complex多肽1亚基β(TCP-1β)和早期糖尿病肾病(DN)。在这项研究中,我们进一步探讨了TCP-1之间的关系β和2型糖尿病患者糖尿病(DM)。模拟临床反渗透法状态,2型DM小鼠模型建立了喂养高脂肪饮食结合治疗链脲霉素和烟酰胺。血液和尿液收集确定肌酐清除率(收获),肾组织TCP-1的评价β通过免疫组织化学和免疫印迹表达。与此同时,健康对照组临床科目和2型DM与尿液TCP-1招募加强证据β。结果表明,和TCP-1的表达β在肾脏明显高于一周后高血糖发展,这表明反渗透法状态是成功建立小鼠模型。TCP-1β主要表达在肾小管。利用估计的肾小球滤过率指数在临床研究进展,尿液TCP-1β水平与反渗透法阶段2型DM患者。最终,我们证实TCP-1β是一个可能的生物标志物2型糖尿病早期肾病,但机制的进一步研究阐明其原因和途径是必要的。

1。介绍

特别是有糖尿病(DM),类型1和2,是一个全球性的流行病,造成巨大的经济负担对世界各地的卫生保健1,2]。糖尿病会导致许多并发症,如心血管疾病、肾病、视网膜病变、神经病变。而糖尿病肾病(DN)的一个主要原因是终末期肾病(ESRD), DM类型都有一定比例的主题发展DN。1型DN的进展,有五个可预测的阶段:肾小球反渗透法,沉默,微量白蛋白尿,macroalbuminuria,迹象。至于发展2型DN,它可能显示一个类似的表型1型DN的早期肾小球ESRD反渗透法。类型1和2中的患病率肾小球反渗透法DN是25 - 75%和5 - 40%,分别为(3]。虽然并不是所有的DN的发展开始从肾小球反渗透法,肾小球反渗透法的外观已经建议与ESRD的发展(4]。鉴于肾小球的有害影响反渗透法在DN的进展,了解肾小球反渗透法的机制是非常重要的,以防止肾功能恶化。

没有共识的定义肾小球反渗透法。通常定义为肾小球滤过率(GFR)超过120毫升/分钟,由于肾小球和管式反渗透法DN的理论主要基于啮齿动物实验模型(3]。而反渗透法是由intraglomerular毛细管压力增加,这可能是由传入和传出小动脉的调制,毛细管膜的渗透性,和液压和肿胀的压力梯度之间的区别,一种机制在肾小球系膜细胞hypocontraction理论,指出导致毛细血管表面积和毛细血管通透性降低,因此强调肾小球滤过率(GFR) (5,6]。在我们之前的研究中,一个在体外高glucose-induced系膜细胞hypocontractility模型建立了探索底层机制导致肾小球反渗透法。我们建议chaperonin-containing t-complex多肽1亚基β(TCP-1β)可能发挥重要作用在间质细胞hypocontractility发展的DN。然而,TCP-1的角色和表达体内β在早期DN没有讨论到这个研究。

在这项研究中,我们建立了一个2型糖尿病小鼠模型来模拟DN的发展和评估TCP-1的表达β在肾脏。与此同时,我们尿TCP-1调查β水平的临床学科2型DM在肾小球反渗透法阶段。

2。材料和方法

2.1。诱导2型DM小鼠模型与肾小球反渗透法

链脲霉素(STZ) (N-nitroso葡萄糖胺的导数,σ,S0130)是一种广谱的抗生素从链霉菌属achromogenes。胰腺β细胞毒素,导致快速和不可逆坏死β细胞,广泛用于制作实验性糖尿病小鼠模型。在我们的研究中,雄性BALB / c小鼠从国家实验室获得动物育种研究中心(台北,台湾)。2型DM的感应,老鼠被安置在实验室笼子里与高脂肪饮食(高频)和美联储(40%的脂肪,研究饮食,Inc ., NJ) (73周)。随后,老鼠接受75毫克/公斤和150毫克/公斤的静脉注射STZ 5天。烟酰胺(特种加工)(1.5 g / kg,溶解在盐水)腹腔注射15分钟(分钟)每次注射STZ之前。所有的动物当时nonfasted STZ管理。感应后,血糖测量每日通过尾静脉取样使用一个(罗氏,ACCUCHEK)。动物血糖超过11.1更易/ L (200 mg / dL)被纳入本研究。2型糖尿病的发展后,小鼠尿液和血液收集每隔1周。在每个时间间隔至少6老鼠取样。此外,肾组织后小鼠安乐死在第一和第四星期。在感应,肾小球滤过率(GFR)在给定的时候,被一个估计方程。毫升的等离子体每分钟计算= ()×/体重(g),在那里在尿肌酐的浓度,在血浆肌酐的浓度,然后呢毫升每分钟的尿流率(8]。验证建立2型DM, assessment-insulin阻力(HOMA-IR)在小鼠体内稳态模型也评估了HOMA-IR =胰岛素(μU /毫升)×葡萄糖(更易/ L) / 22.5 (9]。血液和尿液肌酐水平决定根据先前的方法(10]。实验动物协议机构批准的动物保健和使用委员会国防医学中心,台北,台湾(批准文号:iacuc12 - 058)。

2.2。免疫组织化学染色(包含IHC)

肾脏组织固定在10%甲醛固定剂解决方案和嵌入式石蜡。formalin-fixed肾组织的部分都沉浸在二甲苯5分钟三次取消石蜡,其次是孵化与磷酸盐(PBS)和1%牛血清白蛋白(BSA)在室温下(RT) 30分钟阻塞。除去石蜡和补水后,切片是孵化1:50稀释的主要抗体,兔子anti-TCP-1β抗体(圣克鲁斯,sc - 28556, CA)一夜之间在PBS 4°C。随后,孵化了片1:50稀释的二次抗体,生物素化的anti-rabbit抗体(向量实验室、ba - 1300, CA), 40分钟,洗Tris-buffered盐水含0.05%渐变20 (TBST;pH值7.4)。被处理的部分VECTASTAIN ABC(向量实验室,CA)解决方案工作了30分钟。反应被使用坏的发色体可视化。片被观察到的光学与光学显微镜。消极的控制由省略主要抗体。

2.3。免疫印迹(WB)

等量的蛋白质(30肾皮质μg)从每个样本8% sds - page凝胶分离。凝胶electroblotted到硝化纤维膜,孵化1小时在阻止缓冲区(TBST, 2%牛血清白蛋白),洗了三次在TBST TCP-1和孵化1:500稀释β在4°C TBST过夜。印迹洗了三次,孵化在辣根peroxidase-conjugated anti-rabbit抗体1小时在沿膜清洗三次,和膜结合抗体检测和免疫印迹检测系统孵化和x射线胶片捕获。

2.4。临床学科和研究设计

本研究的受试者是参加service总医院和被分为三组:控制、DM与反渗透法(估计肾小球滤过率(GFR);表皮生长因子受体> 120毫升/分钟),和DM nonhyperfiltration (eGFR < 120毫升/分钟)。所有的17名健康受试者和148 2型DM患者妊娠(71名男性和77名女性)签署知情同意,进入学习。以下包含和排除标准。2型DM患者的历史为包含一年以上都有资格。被诊断为2型DM和分类根据临床实践指南(两次空腹血糖≥7.0更易/ L (126 mg / dL), 2小时血糖≥11.1更易/ L (200 mg / dL)在口服葡萄糖耐量试验,或随机血糖≥11.1更易/ L) (11]。急性肾脏感染,患者肾肿瘤、肾脏功能受损(eGFR < 60毫升/分钟或蛋白尿> 30μg /毫克)、原发性肾脏疾病或继发肾疾病被排除在外。收集的数据包括性别、年龄、身高、体重。肾小球滤过率(GFR)估计了表皮生长因子受体(毫升/每分钟1.73米²)= 186×Pcr^−1.154×年龄^−0.203(女)×0.742×1.233(如果中国)[12]。随后的过程都是按照道德标准的负责任的人体试验委员会(service综合医院伦理委员会,台湾,097-05-201)和1975年的赫尔辛基宣言,就像2008年的修订。

2.5。实验室测量的临床学科

等离子体是分开在一小时内血液储存在−80°C,直到分析。采用葡萄糖氧化酶法测定血糖水平(YSI 203葡萄糖分析器;科学部门,黄色春天仪器公司,Inc .,黄色的春天,哦)。总胆固醇(CHO)和甘油三酯(TG)测量使用干燥、多层分析滑动法(富士Dri-Chem 3000分析仪,富士照片电影公司,港区,东京,日本)。糖化血红蛋白A1c (HgbA1c)是由离子交换评价高压液相色谱法(变体II;Bio-Rad大力神,CA)。

2.6。竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)

根据ELISA的指南(2001)由JR Croether编辑,尿液TCP-1β决定使用一个竞争ELISA免疫测定中TCP-1β(Abnova H00010576-M01、台湾)涂上了100μL 1μg /到微量滴定井和板孵化在RT过夜。随后,250μL 5%的脱脂牛奶PBST添加到在RT 1小时。竞争是50μL TCP-1人类尿液β50μL 1μ在RT g / mL 2小时。然后,检测抗体tag-specific 1μg / mL兔子anti-GST抗体(Abnova、PAB1625-E01P、台湾)在RT孵化2小时。合共轭1:40000只山羊anti-rabbit免疫球蛋白(美国宾夕法尼亚州杰克逊,111-035-003)添加了1小时。421101年一个色原三甲衬底(Biolegend, CA)的解决方案是添加到井在RT孵化了30分钟,然后停在2 N H₂所以₄。最后,一套标450海里是用来读反应。

验证我们的内部ELISA,样本的高,中,低浓度在两个复制被用来计算intra-assay和interassay变异系数(CV)。intra-assay和interassay简历在我们的ELISA分别为2%和3%,分别是在可接受的范围内。

2.7。统计分析

分析使用Windows PASW统计18.0版统计软件包(SPSS,芝加哥,IL)。在小鼠模型中,所有实验至少重复三次。结果在组表示为均值±SE。非参数分析Mann-Whitney测试是用来评估两个独立的团体之间的显著差异。在临床调查,使用Bonferroni作为单向方差分析事后测试是应用比较差异健康,用反渗透法DM, DM与nonhyperfiltration团体。皮尔逊积差相关系数是用来评估eGFR和尿液TCP-1之间的关系β竞争酶联免疫试剂盒的级别(1-OD)。所有的统计数据都表示为两面,值小于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。胰岛素抵抗和变化在控制、高频和2型DM小鼠

胰岛素抵抗(HOMA-IR)是2型DM。图的标志1(一)显示HOMA-IR逐渐升高在高频和DM组,表明2型DM的典型特点是成功开发2型DM小鼠模型。控制和高频组相比,DM组早了胰岛素抗性和更加突出HOMA-IR高程。同时,高血糖,2型糖尿病的基本特征,是一种定义标准来判断成功的DM模型。高血糖和胰岛素抵抗、2型DM的两个重要的临床特征,都可以指出我们的2型DM小鼠模型。

此外,我们的模型是评价其模仿的能力的反渗透法阶段早期DN。所有组被进一步分为3组来表示0的发展历程,1,4周后出现2型DM。图1 (b)显示,DM组有一个轻微的增加在星期1但4周后显著增加,表明该模型开发了反渗透法阶段,模仿临床肾小球反渗透法的DN。因此,第一和第四星期后高血糖被指定为代表反渗透法课程随后的实验。

3.2。表达TCP-1β在肾组织和尿液样本2型DM小鼠

成功后在发展2型DM小鼠模型中,TCP-1的表达β由肾活检和世行调查。如图2(一个)所示,TCP-1的数量β在肾组织中显著增加在星期1和星期4 DM组。如图2 (b)所示,TCP-1升高β高频和DM组中表达水平在星期1和星期4和位于主要在肾小管与肾小球地区。而尿液TCP-1β水平太低了探测、合并后的数据(数据1和2)建议TCP-1表达的高度β在肾组织评估世行可能是一个可能的生物标志物的诊断反渗透法在早期DN。

3.3。表达TCP-1β在人类的尿液

进一步探索TCP-1的临床证据β与2型糖尿病相关,17个健康受试者和147例2型DM参加这项研究。科目2型DM,归类为反渗透法(eGFR > 120毫升/分钟),没有反渗透法(eGFR < 120毫升/分钟),与尿TCP-1分组来进行相关研究β。这些科目的人口数据表所示1。之间没有显著差异的两个DM组HgbA1c和蛋白尿。但与反渗透法DM组明显年轻和血清肌酐较低。轻度高脂血症与高曹和TG与反渗透法指出DM组。

在临床研究中,发现尿液TCP-1βDM组的水平明显高于反渗透法(图3(一个)),有一个TCP-1之间的弱相关β水平与表皮生长因子受体(图3 (b);,)。因此,我们的临床结果可能意味着TCP-1的可能作用β在早期DN。

4所示。讨论

我们之前的这项研究是一种先进的延伸在体外小鼠系膜细胞模型和第一个研究识别TCP-1的角色β在早期DN在动物模型和临床学科。在这项研究中,我们发现TCP-1β在肾小管的2型DM小鼠同时上升。在临床研究中,我们发现尿液TCP-1β水平在2型DM患者明显高于反渗透法阶段,以线性与表皮生长因子受体的水平。

反渗透法的确切机制在DN是争论,研究支持肾小球和肾小管理论的反渗透法DN。肾小球反渗透法和肥大一直观察DN的早期阶段STZ诱导的小鼠(13]。TCP-1β期间表达的是一个分子chaperonin,高度高血糖诱导内质网(ER)压力(14),不仅有助于褶皱cytoskeletal-related但也几十个其他蛋白质(蛋白质15]。我们之前在体外研究发现TCP-1升高β水平中小鼠系膜细胞治疗高葡萄糖(5]。这是合理推测高glucose-induced ER应激对系膜细胞阻碍细胞迁移和收缩的功能,影响肾小球滤过率(GFR)的规定。因此,TCP-1β系膜细胞是调节展开肌动蛋白和微管蛋白。系膜glomerula以外,增加吸收的葡萄糖和近端肾小管钠也有助于反渗透法2型DM (16]。此外,高葡萄糖还诱发肾小管epithelial-mesenchymal过渡,这可能上调细胞内α光滑的肌肉从而[17),导致肾小管间质纤维化。然而,我们包含IHC染色显示TCP-1β主要表达在肾小管区域,而不是在系膜肾小球地区。我们推测hyperglycemia-related hypocontraction系膜细胞和肾小管间质纤维化的进展同时发生。因此,TCP-1β系膜细胞和管状细胞表达。但表达TCP-1β在肾小管TCP-1如此强大β在系膜glomerula模糊。

魏等人表示,一个高频饮食的老鼠显示肾小球滤过率(GFR)升高和系膜细胞去分化,增加表达α光滑的肌肉肌动蛋白在肾小球18]。严重肥胖受试者没有2型DM还显示肾小球滤过率(GFR)和肾血浆流量增加了51%和30%,分别与正常人相比(19]。减肥可以显著降低肾小球滤过率(GFR)和肾血浆流量在肥胖受试者(20.]。因此,肥胖引起的肾损伤,包括肾小球肥大和蛋白尿,可能导致DN (21]。我们的一个高频饮食的老鼠显示增加和胰岛素抵抗随着时间的流逝,在水平高于控制老鼠,但低于2型DM小鼠。然而,TCP-1的表情β在肾组织中升高,类似于2型DM小鼠。因此,我们可以得出这样的结论:TCP-1β更敏感,出现在反渗透法发展。

连接机制TCP-1的表情β和2型DM尚不清楚。在一项研究与蛋白质组学分析,一些单元的TCP在骨骼肌在肥胖受试者和2型DM患者22]。在人类临床研究,尿液TCP-1β在DM反渗透法明显高于健康受试者和DM nonhyperfiltration。对比了这些结果和2型DM小鼠模型的结果,我们的研究结果支持TCP-1的至关重要的作用β在早期DN。我们的研究是第一个探索和确定尿液TCP-1β水平评估2型DM患者反渗透法。这些发现表明,尿液TCP-1β可以是一个有用的和敏感的生物标志物检测2型DM反渗透法。我们的方法很容易和访问大量的临床实践和可以提醒医生早期DN患者2型DM和增加尿TCP-1吗β。

在我们的研究有一定的局限性。首先,我们竞争ELISA用于测量尿液TCP-1β在临床学科。在这种方法中,抗原可以干扰结果,样品测试和桥梁在极值现象无法避免(23]。虽然我们省略了表皮生长因子受体的科目不到60毫升/分钟和30多的蛋白尿μg /毫克,各种粒子和尿液中代谢物可能造成假阴性和假阳性。此外,我们没有测量尿液TCP-1的确切数额β通过竞争ELISA定量。最后,我们没有限制科目考试前的饮食或调查受试者的治疗记录2型DM的其他因素,如高血压或高血脂。每个主题的药物、食品和营养补充剂可能影响竞争ELISA或TCP-1β在尿液。然而,过度TCP-1β在反渗透法2型DM小鼠模型和临床学科可以抵消这些限制。

5。结论

总之,TCP-1升高β在2型DM患者的尿和肾组织2型DM小鼠都指出在反渗透法阶段。反渗透法在DN可能通过测量尿液TCP-1早期检测β,这可能是一个新颖的、有价值的生物标志物的临床评估。

利益冲突

所有作者宣称他们没有利益冲突。

确认

作者承认玛丽·古德温教授的帮助报纸编辑。支持的工作是由国防医学中心- service总医院(tsgh - c103 - 007 - s02),和健康促进、卫生,行政院(doh97 - td -我- 111 tm007 doh99 - td - i - 111 - tm008),台湾。