文摘
脑利钠肽(BNP)是一种重要的生物标记和心脏功能的监管机构。法国电阻的特点是高浓度的少功能有效的法国和常见的心力衰竭(HF)患者。然而,法国的角色和后果阻力仍然知之甚少。调查心脏BNP阻力的影响,识别潜在的代谢生物标志物的筛查和诊断。三十个病人和三十健康受试者参加本研究。通过超声心动图心脏功能进行评估。的等离子体水平环鸟苷酸(cGMP)和法国巴黎银行(BNP测定的酶联免疫吸附试验(ELISA)和cGMP /法国比率计算来确定心脏利钠肽抵抗。基于液相色谱串联质谱(质)的诸多应用代谢组学分析屏幕代谢变化。cGMP /法国比明显低于控制心力衰竭患者。cGMP /法国比和射血分数(EF)有紧密的关联(R2= 0.676, )。重要的是,代谢心力衰竭患者和健康对照组之间显著不同。京都基因和基因组的百科全书(KEGG)分析证明了差异表达代谢物参与的信号通路调节心脏功能。在心衰患者中,法国抵抗发展与减少心脏功能和代谢重构。这表明法国巴黎抵抗可能的功能角色心脏代谢的调节。
1。介绍
心力衰竭(HF)是一种复杂的临床综合征,表现为心室充盈性结构紊乱或射血和无法满足外围组织的血液供应的需求(1,2]。重要的是,据估计,全球大约有3800万名患者患有心力衰竭,被认为是发病率和死亡率的主要原因,和其发病率预计将继续上升3,4]。心脏功能的恶化阻碍心脏血液供应的能力,进而导致心力衰竭(5]。然而,高频的具体发病机理及其复杂性,已知的疾病,如心肌梗死,高血压,心肌病,心脏疾病,炎症和氧化应激引起的已报告是心力衰竭的恶化的风险因素(6,7]。
脑利钠肽(BNP)是一个成员的利钠肽(NP)的家庭,扮演着重要的角色,如尿钠排泄、利尿、血管舒张和代谢调节8- - - - - -10]。在人类所有的利钠肽包含一个保存17个氨基酸残基组成的环形结构,形成一个分子内二硫键,这个结构可能是负责受体结合(11]。受体称为利钠肽受体(npr)被列为A或b .绑定这些guanylyl cyclase-coupled受体导致增加环鸟苷酸(cGMP),下游效应包括多尿和尿钠排泄,血管舒张,抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统,增强心肌放松、纤维化和肥大的抑制,促进细胞存活,和炎症反应的抑制作用12- - - - - -14]。重要的是,阻力由钠尿肽参与展出,作为分子新型治疗方法来打击目标代谢疾病疾病(14,15]。然而,潜在的机制并不清楚。最近的证据表明,利钠肽具有心血管体内平衡功能之外的功能和发展相关的心肌代谢产物。
代谢失调是一个复杂的发病机制的重要组成部分的高频(16- - - - - -18]。代谢在高频扰动不仅仅是心肌的障碍,但也是一个系统性问题,因为流通中的代谢物成分的变化反映了整体和系统性病变,这是一起发生在心脏衰竭的全身多个器官和组织的变化(19- - - - - -22]。代谢组学是一个新的系统生物学的方法,为验证代谢分子提供了一个平台来区分不同阶段患者的心力衰竭和分析代谢途径在高频的不同阶段(23]。
在这项研究中,代谢组学的方法用液相色谱仪进行串联质谱(质/ MS)被用来研究代谢产物的变化在心力衰竭患者。高频和健康对照组显然是杰出的多元数据分析。一些代谢物被发现显著改变在心衰患者中,和摄动代谢途径进行了分析。很少有研究评估从HF患者的样本使用代谢分析,这表明法国抵抗是与新陈代谢相关心血管疾病。因此,这项研究可能有助于识别高频之间可能的代谢产物,调节不同患者利钠肽阻力,从而提供一个新颖的角度识别可能的疾病筛查和病理代谢生物标记研究。因此,本研究有助于更好地理解发生在心脏能量代谢的变化在高频。
2。材料和方法
2.1。化工材料
NH4OAc(醋酸铵、质),NH4哦(氢氧化铵、质)和甲醇(质)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。去离子水是由Milli-Q系统。化学标准均为分析纯,一个典型的纯度为99%。
2.2。研究对象
分析了等离子体样本来自两组(30心力衰竭患者和30名健康对照(HC))。30心力衰竭患者诊断的标准美国心脏病学会和美国心脏衰竭(ACC / AHA高频)分类系统。甲状腺功能减退患者特别是高频,系统性红斑狼疮,炎症性疾病、慢性肝病、慢性阻塞性肺病、癌症被排除在外。血液样本采集前治疗。HC是包括作为HF-free对象没有以前的历史心脏衰竭和心脏药物的历史。所有参与者招募从西安医科大学第二医院从2017年1月到2018年1月。是显示在表1,心力衰竭患者和HC之间的详细的临床特点进行了总结。
2.3。超声心动图
超声心动图进行无创用55 770 MHz Vevo换能器(VisualSonics、加拿大)低于2.5%异氟烷气体麻醉。左心室室壁厚度和直径的测量了沿胸骨旁的长轴在M-mode左心室(LV)的录音。然后,LV部分缩短(FS)、射血分数(EF)计算从LV维度24]。
2.4。血制备
大约5毫升的血液来自每个主题由静脉穿刺和存储在抗凝管的乙二胺四乙酸(EDTA)患者入院后从医院。30分钟后凝固在室温条件下,等离子体被离心分离(3000 x g, 10分钟)。400毫升水中等离子体被放入离心管和储存在−直到需要80°C。
2.5。法国巴黎银行和cGMP测试
等离子体是解冻cGMP的量化和BNP水平之前,测量病人的血浆和HC使用商用ELISA试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国和eBiosciences,热费希尔科学、美国)根据制造商的指示。
2.6。质分析
等离子体涡和解冻30年代。测量代谢物,样本200卷µ用甲醇提取L:乙腈(ACN) (1: 1, v / v)。样品被漩涡30年代和用10分钟。沉淀蛋白质,样本在−1 h孵化20°C,然后是15分钟的离心20000 g和4°C。得到的上层清液被蒸发干燥在真空浓缩器。干提取物被重组在40µL / mg pro-ACN: H2O (1): 1, v / v),涡流30年代,用10分钟。15分钟的提取是离心机在20000 rpm和4°C去除不溶性的碎片。上层清液被转移到高效液相色谱仪(HPLC)瓶和存储在−LC / MS分析之前80°C。
样本分离一个酰胺列使用流动相组成的水混合25毫米醋酸铵和25毫米氢氧化铵和移动阶段B (ACN)。注射量是4µL,流速为0.4毫升/分钟。质谱(MS)分析Q-Exactive MS / MS设备上进行了积极和负离子模式。(1)相关的调优参数用于调查分析如下:辅助气体加热器温度,400°C;鞘气体,40;辅助气体,13;和喷涂电压、3.5 kV积极模式和消极的模式。毛细管温度设定在350°C,和S-lens被设定为55°C。2。数据依赖收购(DDA)方法如下:全扫描范围,60到900 (m / z);质谱影像分辨率(MSI)和ddMS2, 70000年和17500年分别; maximum injection time for MSI and ddMS2, 100 ms and 45 ms, respectively; automatic gain control (AGC) for MSI and ddMS2, 3e6 and 2e5; isolation window: 1.6 m/z; and normalized collision energies (NCE): 10, 17, 25 or 30, 40, 50. 3. The full scan method was performed as follows: full scan range: 60 to 900 (m/z); resolution: 140,000; maximum injection time: 100 ms; automatic gain control (AGC): 3e6 ions [25]。
2.7。数据处理和统计分析
原始数据文件(.wiff)女士都是直接由代谢组学处理软件处理初期发育气(水公司,米尔福德,美国)。自动基线滤波、峰值识别、集成、保留时间校正,和峰对齐生成一个多变量数据矩阵包含信息保留时间、质荷比和峰值区域。矩阵规范化的数据之和的区域确定峰值使用MetaboAnalyst 4.0的Web服务。数据随后被接受使用SIMCA-P 14.0多维统计分析软件(Umetrics、期刊、瑞典)。主成分分析(PCA)首次使用观察整体功能分配和分散在所有组。正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)进行确定分布和分散在所有组。变量重要性的代谢物,表示变量投影重要性的投影(VIP)值大于1.0p值小于0.05,被定义为微分代谢物(26]。
自由KEGG数据库和mzCloud用来识别获得的代谢物的质匹配他们准确的分析质量,碎片离子,保留时间。最后,商用标准用来确定代谢物的结构。
3所示。结果
3.1。临床特点的主题
最初,我们连续招募了30 HF患者和30名健康的个人控制。所有受试者的临床特点如表所示1。心力衰竭患者之间没有显著差异,控制年龄和身体质量指数。等离子体水平的低密度脂蛋白(LDL)胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)更高,而高密度脂蛋白(HDL)比控制降低心衰患者(27]。
3.2。法国抵抗发生在心力衰竭患者
如数据所示1(一)和1 (b)、等离子体的cGMP水平和法国巴黎HC组明显低于高频组( 对于所有的健康组)。此外,cGMP之间有良好的相关性和BNP水平(图1 (c)),这表明法国抵抗发生在心力衰竭患者。有趣的是,也有良好的相关性cGMP /法国比和EF,如图1 (e)。
(一)
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(d)
(e)
3.3。代谢异常在法国抵抗
3.3.1。代谢组学数据的可靠性
在这项研究中,质量控制(QC)两组样本紧密聚集在一起,这表明两组的优秀QC重复性很好,分析系统的稳定性高。此外,保留时间变化,大众错误,和QC样品的峰值区域显示,两组之间没有差异的样本,和实验研究是可行的,如图2。由主成分分析的可视化特性导致模式,如图3(一个)。OPLS-DA分数情节对心力衰竭病人在HC组如图3 (b)这表明,该方法有很好的歧视和仪器性能好。高频和健康组织的代谢特征明显不同。
(一)
(b)
(一)
(b)
(c)
超过1000的分子特性检测。75年改变代谢物高频和健康组织之间的明显特异表达,如图3 (c)。这些数据表明,代谢物集群改变与高频的身份。层次聚类形成基于潜在干预的目标。行显示代谢物和列显示样本。颜色键表示的表达式值代谢物;绿色表示最低的表达式和红色表示最高。对于每一组,我们的欧氏距离矩阵计算的定量值微分代谢物,集群的微分代谢物完整的连接方法,并显示在热力学图。
3.3.2。路径分析
为了进一步探索特异代谢关系的潜在生物标记物,更详细的途径方法进行了分析。路径拓扑分析是进一步进行探索的代谢物折叠变化和丰富程度重要的实体的列表,以及任何代谢物通常是根据一个固定的列表中任意阈值(如p值)。浓度表所示为高频与健康组(表2)。结果表明,9通路显著摄动与高频;其中包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,谷胱甘肽代谢,精氨酸,脯氨酸代谢,维生素B6新陈代谢,精氨酸生物合成,柠檬酸循环(三羧酸循环,柠檬酸循环),嘌呤代谢,嘧啶代谢,乙醛酸和dicarboxylate新陈代谢(图4)。
路径分析结果表明,明显干扰中观察到这些通路相关高频,所以他们可能扮演重要的角色在这个疾病作为高频生物标志物和展示他们的潜力。我们因此选择以下8确定代谢物深造:柠檬酸、天门冬氨酸,L-pyroglutamic酸,维生素b6,尿嘧啶,腺苷酸,柠檬酸,L-glutamic酸(图5),我们发现,除了腺苷,所有其他的内容在心力衰竭患者明显低于对照组。
(一)
(b)
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(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
心力衰竭是一种最常见和严重的异常心脏疾病,导致心肌组织和收缩力的丧失。冠状动脉疾病决定减少心肌氧供应,导致心肌收缩和舒张的障碍(28]。心肌线粒体损伤,导致线粒体代谢紊乱在早期再灌注是一个关键机制本身的重叠发生,以及其他三个级数的心肌细胞死亡,从而导致大量的急性心肌缺血患者持续大量的心肌损害,甚至高频尽管及时、成功的再灌注(29日),但其早期诊断或预后预测仍然需要理想的生物标记物(30.,31日]。研究人员已经观察到心脏充盈压升高的患者和临床高频明显高于BNP水平升高,这意味着高频是涉及NP阻力。这个概念被发现,证实这些患者也减少了cGMP /法国比率[32]。有趣的是,血浆和尿液的cGMP水平主要与NP-derived微粒鸟苷cyclase-generated cGMP而不是氮oxide-derived可溶性鸟苷cyclase-generated cGMP [14]。先前的研究表明,NP阻力在心力衰竭大鼠NP受体的特定基因敲除后,cGMP /法国之间的相关性和左心室射血分数(LVEF)进行了分析。
这项研究集中在代谢组学研究两组心衰患者BNP阻力和严重的心脏功能障碍。结果表明,(a)心脏功能障碍是与法国抵抗和(b)不同的代谢与心脏功能伴随着法国抵抗。
在这项研究中,共有75种代谢物被发现明显导致等离子体代谢的差异之间的高频与法国抵抗组织和健康组织。并不是所有的这些差异可以被指定为化学身份,但数据库匹配的使用允许的假设几个公认的代谢物。氨基酸是人体摄取或内生合成时发挥着重要的生理作用,监管机构基本代谢产物和代谢。线粒体代谢所需的氨基酸是关键基质和通常在高频组升高(32,33]。氨基酸谷氨酸,发挥着重要作用的蛋白质。谷氨酸是一个非常重要的兴奋性神经递质在中枢神经系统;它是广泛分布;参与个人认知、学习和记忆活动;这是神经细胞的生存密切相关,突触的形成,和可塑性34]。谷氨酸的形式存储在胶质细胞谷氨酸盐、谷氨酸和谷氨酰胺和循环平衡起着至关重要的作用在维持脑细胞的正常功能。这将是有趣的探索机制,考虑增加谷氨酸在这些病人。对心脏组织产生能量,谷氨酸转化为谷氨酸,进入glutamate-proline通路(35,36]。氨基酸的独特之处在于,它需要核苷酸形成。
在这项研究中,我们发现,健康和高频组常见的代谢特点,以增加丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢,谷胱甘肽代谢,精氨酸和脯氨酸代谢、维生素B6新陈代谢,精氨酸生物合成,柠檬酸循环(柠檬酸循环),嘌呤代谢,嘧啶代谢,乙醛酸,和dicarboxylate代谢,所有这些都将增加代谢底物和高分子前体来满足增加能量和蛋白质合成细胞增殖的需求。
我们的研究结果表明,嘌呤通路可能与心力衰竭的恶化疾病有关,而这些代谢物可能发展成为一个生物标志物分析高频诊断。先前的研究已经报道,在心力衰竭患者血浆尿酸是调节,与高频负担。另一个代谢物,腺苷参与嘌呤代谢和被报道引起心力衰竭。结合当前研究的结果,嘌呤代谢途径是心力衰竭疾病的发展紧密相关。另一个重要的分子组中发现我们的结果是评论家酸,这是一种弱酸,可以产生通过三羧酸循环或介绍的饮食。等离子体的评价柠檬酸很少用于人类疾病的诊断。相比之下,柠檬酸尿排泄是一种常见的工具区分肾结石、肾小管酸中毒和它在骨骼疾病起着重要的作用。三羧酸循环,也被称为三羧酸循环(柠檬酸循环)或克雷布斯循环,是一系列酶催化化学反应,所有有氧生物至关重要。柠檬酸循环也生产有限公司2和几个氨基酸(天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸)和前兆的4-Dihydroxy-2-naphthoyl-CoA (NADH),用于其他重要代谢途径。
我们发现7个氨基酸调节心衰患者,其表达水平高度相关。三个氨基酸属于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径,这主要发生在内质网。氨基酸是蛋白质的基本单位和研究人员作为衬底。与此同时,他们有重要的角色在细胞信号,生物合成、运输、和关键代谢途径。有趣的是,我们的研究结果显示,在治疗心衰患者,L-glutamic酸和柠檬酸酸调节。这表明L-glutamic酸的水平可以作为一个潜在的指标评价心力衰竭疾病的诊断和治疗效果。此外,氨基酸和葡萄糖是心肌细胞的主要能量底物产生三磷酸腺苷(ATP),所以upregulation L-glutamic酸在等离子体可能与氨基酸摄入或在心肌细胞代谢功能障碍。
综上所述,我们的研究结果表明,有一个独特的代谢特征,不仅使心力衰竭患者和健康组织之间的歧视,但也允许法国抵抗有或没有高频话题,表明逐渐枯竭的能源储备可能会造成心脏损伤的发展。因此,我们的数据表明,能量代谢是月初晋升/补偿高频状态和代谢能力的损耗可能导致进步心脏损伤更严重的心力衰竭病例观察。
心力衰竭的早期检测BNP阻力将提供一个机会来实现适当的治疗策略,以避免或减少不利的疾病的结果。在目前的研究中,我们使用的诸多组学分析策略,全面分析哪些分子特异表达在心力衰竭患者的血浆,并进一步ELISA检测验证我们的组学数据的可靠性。最后,HF-related代谢途径用于生物信息识别。因此,我们所知,本研究率先提供可靠和等离子体的综合视图内容的法国巴黎抵抗治疗心力衰竭患者。我们的结果不仅提供潜在生物标志物评估心力衰竭的诊断和预后,但也为获得一个更好的线索对心力衰竭的病理机制的理解。
5。结论
总之,我们已经表明,代谢紊乱发生在心力衰竭患者的血浆BNP阻力。我们确定了几个分子特异表达,包括代谢物。我们的结果可以支持新型生物标志物的鉴定或有效的治疗靶点和升级提供线索的理解高频的病理。然而,进一步验证这些候选人在大样本人群生物标志物评估需要在双盲测试之前,可以在临床诊断中实现。此外,生物实验的研究功能还需要与说明的精确分子机制导致心力衰竭的发病机制。
缩写
| ACC: | 美国心脏病学会 |
| 可以: | 乙腈 |
| 自动增益控制: | 自动增益控制 |
| 啊哈: | 美国心脏衰竭 |
| ATP: | 三磷酸腺苷 |
| 法国巴黎: | 脑利钠肽 |
| cGMP: | 环鸟苷酸 |
| 胆固醇: | 胆固醇 |
| 谈判: | 数据依赖收购 |
| EDTA: | 乙二胺四乙酸 |
| 英孚: | 射血分数 |
| ELISA: | 酶联免疫吸附试验 |
| FS: | 部分缩短 |
| HC: | 健康对照组 |
| 高密度脂蛋白: | 高密度脂蛋白 |
| 心力衰竭: | 心脏衰竭 |
| 高效液相色谱法: | 高效液相色谱仪 |
| KEGG: | 京都基因和基因组的百科全书 |
| 质: | 液相色谱仪串联质谱分析 |
| 低密度脂蛋白: | 低密度脂蛋白 |
| LV: | 左心室 |
| LVEF: | 左心室射血分数 |
| 女士: | 质谱分析 |
| MSI: | 质谱影像 |
| NADH: | 1,4-Dihydroxy-2-naphthoyl-CoA |
| 出版社: | 规范化的碰撞能量 |
| NP: | 利钠肽 |
| 美国国家公共电台: | 利钠肽受体 |
| OPLS-DA: | 正交偏最小二乘判别分析 |
| 主成分分析: | 主成分分析 |
| 柠檬酸: | 三羧酸循环 |
| TG: | 甘油三酸酯 |
| 贵宾: | 变量投影重要性。 |
数据可用性
在这项研究中使用的数据是根据要求提供。
伦理批准
本研究临床伦理委员会批准第二附属医院,西安医科大学,并依照《赫尔辛基宣言》的原则。这些样本是只从患者获得同意检查实验室研究的目的,并从所有患者知情同意了要求献血。所有方法进行按照有关指导方针和规定。
的利益冲突
作者声明没有关系与行业报告,没有利益冲突,包括金融、个人、政治利益,在这项研究中。
作者的贡献
潘Chang和小君于设计的研究。Xiaomeng张、京张、王Xihui收集样本和clinical-related进行分析。胡安吴邦国委员长和耿建平分析数据。宝应县陈回顾了统计分析。升平告诉记者Lei写的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。锅,升平告诉记者,和小明张同样这项工作。
确认
作者感谢第二附属医院,西安医科大学为他们的宝贵的在病人招聘和样本和数据收集工作。作者也承认中国的国家自然科学基金委批准基金开展这项研究工作。这项工作得到了陕西省关键中国国家自然科学基金(81870172),研究和开发项目(2018 zdxm - sf - 068年和2018年科幻- 114),陕西中医管理局(2019 - zz jc050)和西安国际医疗中心医院(2020 qn006)。