抑制Akt可减弱rpo诱导的心脏保护作用

摘要

以往的研究表明，补充红棕榈油(RPO)可保护大鼠心脏免受缺血-再灌注损伤。这些研究的证据表明，Akt可能对观察到的保护作用负有部分责任。因此，当前研究的目的是证明或驳斥Akt参与rpo诱导的心脏保护，通过给药特定的Akt抑制剂(A6730)。雄性Wistar大鼠随机分为两组:对照组给予标准鼠粮，实验组给予标准鼠粮加2ml RPO，连续6周。心脏被切除并安装在Langendorff灌注系统上。功能恢复被记录下来。另一组心脏冷冻钳夹以评估Akt的总磷酸化状态。另一组心脏在同样灌注条件下加入A6730。采用冷冻钳夹方法对心脏进行总akt和磷酸化akt检测。RPO改善了功能恢复，这与Ser473和Thr308残基上Akt磷酸化增加有关。 Blockade of Akt phosphorylation caused poor functional recovery. For the first time, these results prove that Akt plays an important role in the RPO-induced cardioprotection.

1.介绍

冠心病(CHD)是对现代社会卫生保健系统的重大挑战，是世界上主要的死亡原因[1］．冠心病的病因和病理生理学是多因素的。其特征是脂质代谢异常、钙稳态异常、内皮功能障碍、高血糖和活性氧(ROS)产生增加[2］．科学证据表明，ROS的增加是冠心病发病机制中的一个重要危险因素[3.］．氧化应激在心血管疾病发病机制中的作用已被确定[4］．植物性食物和饮料已被证明对心血管健康有益[5，6］．

食用富含天然抗氧化剂的食物可能是降低冠心病等疾病发病率和死亡率的关键，氧化应激在这些疾病中扮演着重要的角色。红棕榈油(RPO)是由粗棕榈油经分子蒸馏脱钙脱臭的特殊工艺精制而成的食用油[7］．RPO富含天然维生素E，含有600 - 1000ppm的生育酚和生育三烯醇[8］．生育酚和生育三烯醇是脂溶性维生素E异构体，是植物油中发现的主要抗氧化剂[9，10］．红棕榈油中含有的其他具有重要生理作用的抗氧化剂包括类胡萝卜素、角鲨烯和Co酶Q₁₀［11，12］．RPO由几乎等量的饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸组成[13］．饱和脂肪酸主要为棕榈酸，不饱和脂肪酸主要为油酸和亚油酸[14］．

实验研究表明，RPO的心脏保护作用可能不仅是由于油中发现的高抗氧化剂含量，而且可能是由RPO调节缺血和再灌注信号事件的能力介导的[6，15- - - - - -17］．富生育三烯部分的心脏保护作用也被归因于手掌生育三烯醇调节Akt信号的能力，从而在再灌注过程中产生生存信号[18］．其他天然物质，如银杏叶据报道，提取物可在离体灌注大鼠心脏模型中对缺血损伤提供心脏保护。在这方面，Tosaki等人[19)表明,银杏叶在一个工作心脏模型中，提取物通过减少自由基的形成来改善心脏缺血时的收缩功能。在另一项研究中，Tosaki等人，1996年报道银杏叶提取物可改善非预处理和预处理非糖尿病和糖尿病大鼠缺血后的心功能[19，20.］．

先前的研究表明Akt可能是RPO介导的心肌保护中对缺血-再灌注损伤的保护机制[15，17］．Engelbrecht等人，2006年报道了补充RPO可改善缺血后功能恢复。功能恢复改善与Akt磷酸化水平升高有关。同一组研究表明，抑制PI-3激酶可减弱RPO补充心脏缺血后功能恢复。Engelbrecht et al。，2009年通过他们的研究得出结论，RPO的有益作用部分是通过PI-3/Akt信号通路介导的。他们的结果表明，Akt及其相关的下游靶点都被补充RPO磷酸化。这些结果强烈提示Akt可能在rpo诱导的心脏保护中发挥重要作用。然而，这一证据是间接的，因为除了Akt外，PI-3激酶还有几个下游靶点。Akt的特异性抑制将使我们能够阐明Akt在添加RPO的动物缺血后功能恢复中的重要性。为了确定RPO诱导的Akt心脏保护作用，我们采用了Langendorff灌注心脏模型，并辅之以特异性Akt抑制剂(A6730)。我们没有使用通常通过PI3 K抑制Akt的wortmannin或LY294002，而是使用A6730，这已经被证明可以特异性抑制Akt的磷酸化。

这项研究的目的是（1）研究饲粮中添加RPO对功能恢复和Akt双磷酸化的影响;(2）证明或驳斥Akt磷酸化在rpo诱导的心脏保护中通过特定Akt抑制剂(A6730)的作用。

2.材料和方法

根据美国国家医学研究学会的《实验动物护理原则》和美国国家科学院的《实验动物护理和使用指南》(美国国家卫生研究院出版物编号:no. 531)，本研究中使用的所有动物均接受了人道护理。80 - 23, 1978年修订)。老鼠可以自由获得水和食物。他们被安置在一个27°C的恒定温度下的动物屋中，并暴露在12小时的人工昼夜循环中。本研究的伦理许可由开普敦半岛理工大学的健康和应用科学研究伦理委员会批准(参考:CPUT/哈斯- rec 0019)。

2．1．实验模型

体重120 ~ 150 g的雄性Wistar大鼠随机分为2组。对照组给予标准鼠粮6周，实验组给予标准鼠粮加2ml RPO 6周。每天将RPO与一粒鼠粮混合，然后在它们食用含有RPO的鼠粮后，只给它们喂食其余的鼠粮。对照组大鼠平均每天食用25 g标准鼠粮，实验组大鼠平均每天食用相同量的食物，外加2 mL RPO。之前类似的研究也使用了2ml RPO/日粮。使用2 mL RPO的基本原理是基于Serbinova和同事的早期研究，他们使用了0.2 mL RPO烘焙脂肪[21］．本研究中使用的RPO产品的浓缩程度是RPO烘焙脂肪的10倍;因此，在这个特殊的研究中使用了2ml。近似的能量和营养成分

2．2.心脏灌注方案(图1）

本研究分为两种灌注方案。在第一种方案中，体重300-350的大鼠的心脏被腹腔注射2 mg/kg的静脉内钠(戊巴比妥钠)，心脏被迅速切除并放置在冰冷的克雷布斯-亨斯雷特缓冲液中，然后将心脏转移到Langendorff灌注器，并按照Engelbrecht et al.， 2009的方案进行灌注[17］．

将透明夹层包膜制成的球囊经左心房开口插入左心室。气球通过电脑连接到动力实验室系统(AD Instruments Pty Ltd.， Castle Hill, Australia)。插入后，将球囊膨胀至2毫米汞柱，心脏对球囊的收缩力引起水排空，水排空转化为压力。收缩压、舒张压以及心率都记录在电脑上。用LVDevP和RPP量化心肌功能。LVDevP的定义是测量到的收缩压与设定的舒张压之间的差值。RPP由LVDevP与心率相乘得到。

在第二次灌注方案中，心脏稳定10分钟，并灌注正常的Krebs-Henseleit缓冲液20分钟。然后给心脏灌注2.5毫克μM Akt抑制剂(A6730)溶解在0.025%二甲基亚砜(DMSO)中作为载体，灌注期的最后5分钟，然后整体缺血25分钟1 (b)．在再灌注的前10分钟内，再灌注前10分钟再灌注Akt抑制剂，然后在再灌注的剩余时间内恢复到Krebs-Henseleit缓冲液。Barnett et al.(2005)表明IC₅₀Akt1和Akt2的值为2.7μM和21μ米,分别22］．然而，在我们的模型中浓度为2.5μM显著抑制再灌注30分钟后Akt的磷酸化。

2．3.一种蛋白激酶分析

为了分析所有组的总和磷酸化akt心脏，在再灌注10分钟和30分钟后进行冷冻钳夹。用含(mM) Tris 20, p-硝基苯基磷酸20,EGTA 1, NaF 50，原钒酸钠0.1，苯甲基磺酰氟(PMSF) 1 m二硫苏糖醇(DTT) 1和抑肽酶10的裂解缓冲液提取心脏蛋白μ克/毫升。用Laemmli样品缓冲液稀释组织裂解液，煮沸5分钟，50分钟μg蛋白经10% PAGE-SDS凝胶电泳分离。用Bradford技术测定裂解物蛋白含量[23］．蛋白转移到PVDF膜(Immobilon P, Millipore)。这些膜常规用彭梭红染色以显示蛋白质。用5%脱脂牛奶和0.1% Tween 20 (TBST)的tris缓冲盐水阻断膜上的非特异性结合位点，然后与识别Akt (Ser473和Thr308)和总Akt的一抗一起孵育。随后用大量TBST (5 × 3分钟)冲洗膜，并与与碱性磷酸酶结合的二抗在室温下连续摇匀孵育1小时。用TBS-T彻底冲洗后，用显色底物(Protein Detector BCIP/NBT Western Blotting Kit, invitrogen)覆盖细胞膜，然后进行密度分析。

2．4．数据分析

结果以均数±均数标准误差(SEM)表示。各组之间的差异由一个未配对的学生来确定t-检验，并比较多组间的差异，使用单因素方差分析与Benferroni多重比较作为事后检验。被认为具有统计学意义。

3.结果

对照组和实验组缺血前LVDevP (mmHg)基线值和缺血后LVDevP绝对值见表1．LVDevP回收率(%)如表所示2．与对照组相比，在特定再灌注时间点，饲粮中添加RPO显著改善了实验动物缺血后功能恢复，反映为LVDevP恢复(%)的增加2．RPO心脏再灌注15 ~ 30分钟后LVDevP恢复(%)明显改善;15分钟的RPO与控制(%与%；)， 20分钟后(%与%；)，于25分钟后(%与%；)，并于30分钟后(%与%；）.

缺血后RPP (mmHg/min)恢复以缺血前基线值的百分比表示。与对照组相比，RPO显著提高了RPP回收率(%)。RPO心脏与对照组在再灌注20分钟至30分钟之间观察到显著差异;再灌注20分钟时RPO与对照组(%与%；)， 25分钟(%与%；)及30分钟(%与%；),图2．

3．1.RPO对总Akt和磷酸化Akt对Ser473和Thr308的影响(图3.(一),3.(b)3.(c))

对照组和添加RPO组的Akt总量没有显著差异(图)3.(a))。RPO导致Akt在Ser473和Thr308残基上的双磷酸化(图)3.(b)和3.(c)、RPO与c (像素和像素;), Thr308 (像素和像素;)，附代表性的印迹图像，图3.．结果表明，补充RPO显著上调了再灌注过程中Akt的磷酸化水平，这与既往研究一致。

３．２．RPO和Akt-1-1/2抑制剂(A6730)对LVDevP恢复的影响(%)(图)4）

在15再灌注时，RPO + A6730心脏的LVDevP较对照组+ A6730增加(%与%，）.这些结果表明，与对照组+ A6730相比，给予A6730对RPO + A6730心脏机械功能恢复的影响较小。与对照组相比，再灌注20分钟时RPO显著改善LVDevP (%与%，）.我们的结果还表明，与对照组+ A6730心脏相比，同一时间点RPO显著增加LVDevP恢复，(%与%；）.结果显示，在再灌注25分钟时，与无akt抑制的心脏相比，使用抑制剂显著消除了LVDevP, RPO与RPO + A6730 (%与%；)和RPO与控制+ A6730 (%与%；）.再灌注30分钟时，对照组与对照组+ A6730 (与；)，以及RPO与RPO + A6730 (与；）.

3．3．RPO和Akt-1-1/2抑制剂(A6730)对RPP的影响(%)(图5）

A6730降低了对照组+ A6730的RPP恢复，但对RPO + A6730组的RPP恢复没有相同的影响。再灌注20分钟时，RPO + A6730与对照组+ A6730的RPP恢复情况为(%与% ()， 25分钟RPO + A6730 vs对照组+ A6730 (%与% ()， 30分钟时RPO + A6730与对照组+ A6730 (%与% (）.RPO组与对照组+ A6730组相比，再灌注25和30分钟后RPP恢复明显增加(%与% ()， 30分钟RPO与对照组+ A6730 (%与% (）.

3．4．RPO和A6730对Akt磷酸化的影响(Phospho-Akt (Ser473)和Phospho-Akt (Thr308))6）

与未受抑制的心脏相比，给药A6730显著降低Akt受抑制的心脏中的磷酸化水平(图)6）.对照组与对照组+ A6730组的Ser473磷酸化水平存在显著差异(像素和像素RPO;)， RPO与控制+ A6730 (像素和像素;)及RPO与RPO + A6730 (像素和像素;)(图6(a))。再灌注30分钟后，与对照组+ A6730相比，给予A6730还导致对照组Thr308磷酸化水平显著降低;control与control + A6730 (像素和像素;)， RPO组与对照组A6730 (与像素;),(图6(b)，附代表性印迹图像，图6．

4.讨论

我们已经证明，膳食中添加RPO可以显著恢复缺血后的功能。这是由15分钟至30分钟再灌注后LVDevP持续恢复(%)所显示的。结果与之前的研究一致，在工作的大鼠心脏模型中，RPO被报道可以保护心脏免受缺血-再灌注损伤[15］．我们首次进一步证明，RPO的补充与Ser473和Thr308残基上Akt双磷酸化水平的增加相关。此前的研究表明，rpo诱导的心脏保护与Ser473上Akt磷酸化水平的增加有关[15，17］．科学证据表明，Akt的最佳激活需要Ser473和Thr308残基的磷酸化[24，25］．因此，在本研究中，我们研究了RPO对这两个关键残基的影响，发现RPO显著增加了Akt在Thr308和Ser473上的磷酸化(图)3.(b)和3.(c))。我们的结果表明，Akt可能是rpo诱导离体大鼠心脏灌注模型心肌保护的机制。

服用A6730可导致收缩功能恢复明显下降，LVDevP降低就是证据。与对照组+ A6730 Akt组相比，RPO + A6730部分降低了LVDevP恢复，表明RPO保护心脏免受缺血-再灌注损伤可能有除Akt磷酸化外的其他机制。Engelbrecht和他的同事(2009)也报道了类似的结果，发现RPO在wortmannin存在的情况下能提供更好的功能恢复[17］．

Akt作为一种重要的存活激酶在缺血-再灌注损伤中的作用已被充分证明[26，27］．已有研究表明，Akt在调节心肌收缩力和细胞内钙处理方面发挥重要作用[28- - - - - -30.］．众所周知，心肌的收缩力主要依赖于心肌细胞处理钙离子的方式。因此，我们可以认为，添加RPO后心脏机械功能恢复的改善可能是Akt对钙离子的直接影响。然而，需要进一步的研究来证实这一假设。尽管Akt对啮齿动物缺血-再灌注损伤的作用已经在以前的研究中得到证实[26，27]，这种存活激酶是否在更大的动物物种(如猪)中观察到的心脏保护中发挥重要作用仍存在争议[31］．然而，有可靠的证据表明Akt对缺血-再灌注损伤有心脏保护作用[26，27，30.，32］．Akt主要向细胞内靶点传递有丝分裂原信号，但也有报道称它在氧化损伤下促进细胞存活[33］．Toth和同事报道，自由基清除分子通过清除自由基和上调Akt通路的能力保护心肌细胞免受缺血/再灌注损伤[32］．RPO是一种富含抗氧化剂的天然油脂，如胡萝卜素、生育酚和生育三烯醇。RPO中的抗氧化维生素具有清除自由基的潜能。在我们的研究中，我们没有将RPO的心脏保护作用归因于某一特定成分，而是归因于RPO的所有活性成分，它们可能相互协同支持。据报道，棕榈生育三烯醇通过维持前死亡信号和前生存信号之间的平衡来介导心脏保护[34］．这些作者进一步证明，生育三烯醇抑制死亡前信号，同时增加Akt信号的活性。以往研究的证据表明，RPO的心脏保护作用不仅是由于其抗氧化剂含量，还由于其在缺血-再灌注过程中调节信号事件的能力[17，18，34］^．Bester和同事报告说，RPO的心脏保护作用与心肌梗死面积减少和Akt磷酸化增加有关[35］．Bester等人(2006)的早期研究在离体灌注大鼠心脏模型中采用了添加RPO的等热量饮食[36］．他们报告说，能量消耗的差异并不是观察到的RPO心脏保护作用的原因，而是饮食成分的差异[36］．这也为推测个体生物活性物质作为潜在保护剂或生物活性物质的组合所发挥的作用提供了机会。脂溶性抗氧化剂(如类胡萝卜素、生育酚和生育三烯醇)和特定脂肪酸(如油酸和亚油酸)的结合，以及“少量”浓度的成分(如角鲨烯和辅酶Q10)，无疑都会在细胞活动中发挥作用。最近的研究表明，膳食中补充RPO可减少缺血-再灌注损伤后心肌梗死面积[35，37］．在补充RPO的大鼠中，梗死的减少也与冠状动脉流出物中LDH的减少有关，这表明RPO保护了不可逆的心肌细胞损伤，最终导致功能恢复的改善。本研究使用LVDevP作为功能恢复的终点，记录时间超过30分钟。可能提出的问题是，观察到的保护是否对可逆休克或梗死提供。然而，使用功能为重点的类似模型的研究已经发表(Engelbrecht et al.， 2006, Du Toit et al.， 2001) [38，39］．心肌休克已被确定为再灌注损伤的一种表现[40，41］．因此，这可能表明，对昏迷有害后果的心脏保护将转化为更好的功能恢复。心肌休克是一种复杂的现象。本文的重点不是研究RPO对心肌休克的影响，而是研究Akt磷酸化水平的升高对功能恢复的重要性。

5.结论

我们首次证明Akt磷酸化在RPO介导的心脏保护中起重要作用。给药A6730只导致RPO补充心脏的心脏保护作用的部分衰减，这表明其他途径也可能参与这种心脏保护。因此，可以得出结论，Akt在rpo诱导的心脏保护中起部分但重要的作用。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

本研究由开普半岛理工大学大学研究基金资助，红棕榈油由cartino SDN BHD(公司编号:no. 05310)提供。69046 - t),马来西亚。

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