有针对性的原位基因修正功能失调APOE等位基因产生Atheroprotective等离子ApoE3蛋白质

文摘

心血管疾病是世界主要的死亡原因。载脂蛋白E (ApoE)是一个34-kDa循环糖蛋白,由肝脏和巨噬细胞分泌的多效性的antiatherogenic功能,因此候选人治疗血胆甾醇过多和动脉粥样硬化。在这里,我们描述atheroprotective ApoE的性质,但也潜在proatherogenic行动,和功能失调的亚型患病率,概述传统基因转移策略,然后专注于基因修正疗法可以修复缺陷APOE等位基因。特别是,我们讨论的可能性和潜在效益两个技术进步来修复异常的结合应用APOE基因:(i)一个工程酶引入双链断裂(双边带)外显子4,它包含常见,但功能失调,ε2,ε4等位基因;(2)一个有效的和可选择的模板的同源重组修复(人力资源),即一个腺相关病毒(AAV)载体,港口野生型APOE序列。这种技术适用于体外,例如造血的目标或诱导多能干细胞,以及体内肝基因打靶。希望这样的新兴技术将最终转化为病人治疗降低心血管疾病风险。

1。介绍

死于心血管疾病(CVD),包括缺血性心脏病,中风,和周围性血管疾病,总在世界范围内,每年约1700万总数的三分之一(1]。值得注意的是,超过80%的心血管疾病死亡是在低收入和中等收入国家;它不是一个疾病限于发达国家。动脉粥样硬化是一个进步的炎症反应之间的复杂交互动脉壁细胞内源性,单核细胞,淋巴细胞和血小板的血液和循环脂蛋白(2]。早期动脉粥样硬化病变是脂质条纹,其特点是cholesterol-engorged泡沫细胞在血管内皮。泡沫细胞来源于血液单核巨噬细胞,加入了动脉内膜的调节内皮细胞粘附分子激活。通过不受监管的清道夫受体他们无情地摄取氧化低密度脂蛋白(LDL)或triglyceride-depleted(但cholesterol-containing)残余脂蛋白粒子。最终未能解决炎症导致平滑肌细胞浸润,内膜内增殖,促进建立病变的发展。

心血管疾病的一个重要的危险因素是血浆低密度脂蛋白增加。这是容易氧化,是主要来源的胆固醇沉积在动脉内皮损伤。他汀类药物有助于防止早期发病或死亡通过降低血浆低密度脂蛋白。然而,他汀类药物不纠正低水平的atheroprotective高密度脂蛋白(hdl),这是一个重要的独立危险因素,因为它的作用,过量的胆固醇动脉壁(3,4]。据报道,尽管积极高剂量他汀类药物成功回归动脉粥样硬化斑块的目的,减少发病率和死亡率,副作用的发生率(肝损伤、横纹肌溶解和癌症)的增加和治疗价值仍存在争议。同样,他汀类药物治疗结合ezetimibe的价值,进一步降低低密度脂蛋白胆固醇的胆固醇吸收抑制剂15 - 20%,被质疑为无显著减少观察内膜-中膜厚度(5]。替代策略应对闭塞的心血管疾病仍为许多病人急需(3,4,6]。

包括药物来提高高密度脂蛋白水平,如烟酸、胆甾醇酯转运蛋白(CETP)抑制剂和rvx - 208,一个小quinazoline-family成员上调ApoAI,高密度脂蛋白的主要蛋白质成分(4- - - - - -9]。基于基因疗法也收到很大的关注,包括反义寡核苷酸(麻生太郎)目标的低密度脂蛋白的结构蛋白ApoB100 [10]。基因沉默的proprotein转化酶枯草杆菌蛋白酶/可馨类型9 (PCSK9)也间接地降低低密度脂蛋白。分泌PCSK9结合低密度脂蛋白受体(LDLR)和加速其降解,从而延长LDLR活动PCSK9抑制降低血浆低密度脂蛋白水平(11,12]。高密度脂蛋白补充代理也在临床使用,包括输液的合成或plasma-purified ApoAI与ApoAI模拟肽(13]。基因也被用于提高等离子ApoAI和高密度脂蛋白在临床前研究中使用腺病毒和腺相关病毒(AAV)载体交付(14,15]。

2。ApoE基因和蛋白质

载脂蛋白E (ApoE)是一个34-kDa多态糖蛋白主要由肝脏分泌(~ 90%;奖金的μ克/毫升血浆),尽管其他组织特别是巨噬细胞贡献(16]。人类基因位于染色体19日的5′末端50 kb ApoCI组成的基因簇,一个ApoCI假基因,ApoCII, ApoCIV [3]。像许多可溶性载脂蛋白、载脂蛋白e基因有四个由三个内含子和外显子分离通过规范化途径(图合成和释放1)。翻译的主要产品是317残留物含有一个氨基端氨基酸(同上)信号肽引导增长ApoE多肽内质网。前分泌,ApoE经历O -在高尔基体与糖基化,主要是在用力推^194年尽管碳水化合物链含有唾液酸爵士也存在^290年。

载脂蛋白e蛋白由一个n端结构域(1 - 191残基)四两亲的α螺旋与糖基的protease-sensitive循环(17]。精氨酸和lysine-rich段helix-4(残留134 - 150;图1)包含识别网站LDLR和低密度脂蛋白受体相关蛋白(单体)。ApoE两heparin-binding网站,包含一个内内的受体结合域和其他糖基(残留243 - 272)。有三种常见的载脂蛋白e亚型,称为E2, E3, E4,是三个等位基因的产物(ε2,ε3,ε4)在单个基因位点16]。ApoE3(半胱氨酸^112年,参数^158年)被认为是父窗体,ApoE4(参数^112年,参数^158年)和ApoE2(半胱氨酸^112年,半胱氨酸^158年)来自基因点突变和变异(图1)。有相当大的等位基因变异在不同人群,但是,在欧洲,相对频率大约0.77,0.15和0.08ε3,ε4,ε2 (18),给的顺序出现E3/3, E4/3, E3/2, E4/4 E4/2, E2/2表型。

稀有变异的原因是ApoE2类型III表明在食用一小部分(~ 5%)ε2/2个体,赋予一个显著增加心血管疾病的风险19,20.],等位基因也暂时与颅内出血(21]。尽管如此,ε2航空公司减少了总水平和低密度脂蛋白胆固醇(见部分3),冠心病的风险比常见的人低20%ε3/3基因型(22ApoE4 associates),缺血性中风和蛛网膜下腔出血的发生率(21)和产生不利的脂蛋白,增加低密度脂蛋白和轻微的降低高密度脂蛋白(22]。1996年,14项研究的元分析发现,航空公司的ε4个等位基因有冠心病的风险增加(23),这是在随后的荟萃分析证实48研究涉及15942疾病的情况下,相比得出的风险高出42%ε3/3航空公司(24]。此外,低密度脂蛋白胆固醇水平的人低30%ε2/2基因型与ε4,减少与他汀类药物与实现。然而,这种假设的风险ε4航母是有争议的;一个更新的荟萃分析,重点研究招募大量的参与者减少发表偏倚,报道只有适度增加的风险22]。另一方面,APOE:环境交互CVD风险吸引了更多的关注25];的ε4个等位基因强化心血管疾病的风险缺乏身体活动和吸烟,尽管主要在女性(26]。此外,ε4航空公司有一个较低的预期寿命,发现反映他们倾向神经退行性疾病以及心血管疾病(27,28]。

详细的部分3和4独立的基因型,载脂蛋白e抑制动脉粥样化形成大量的行动。大部分信息来自于体外研究或老鼠,,尽管许多机制效果存在误解,有确凿证据表明,ApoE的重量是atheroprotective。但有一个最后的扭曲的说法:血浆载脂蛋白e水平积极与心血管疾病死亡率(29日),留下几个悬而未决的问题关于人类ApoE生物学在健康和疾病30.]。

3所示。载脂蛋白e和Lipid-Related Atheroprotection

ApoE中扮演着重要的角色在膳食脂质代谢,进入循环大型triglyceride-rich乳糜微粒颗粒。脂类分解和吸收能源丰富的单甘酯和脂肪酸,cholesterol-containing并可能患残余粒子离开,这取决于ApoE快速肝间隙通过途径包括单体、LDLR和乙酰肝素硫酸化蛋白聚糖(HSPG) [31日]。比ApoE3 ApoE4有略大的受体结合能力,但ApoE2缺陷只有2%和40%绑定活动LDLR和单体,分别。虽然ApoE2同种型有一个氨基酸替换(Arg158Cys)以外的134 - 150受体结合域(图1),这有一个很大的破坏性影响。在ApoE3盐桥形成Arg158和Asp154之间。然而,这种交互ApoE2丢失,所以Asp154 Arg150形成一座桥,减少的积极的潜力结合位点显著削弱其亲和力(32]。

当命令E2/2 E2/3 E2/4 E3/3, E3/4, E4/4,逐步增加血浆低密度脂蛋白胆固醇(22,33]。一个解释是,这反映了肝LDLR的差别不断地对这些变化引起胆固醇交付ApoE2——或者ApoE4-containing残余粒子,分别。因此,减少胆固醇供应ApoE2会增加肝LDLR数字降低血浆低密度脂蛋白;此外,减少ApoE2-remnants之间的竞争和低密度脂蛋白的绑定LDLR将导致加速LDL间隙(19]。高亲和力的ApoE4-containing脂蛋白LDLR会有相反的效果,从而提高低密度脂蛋白的水平。然而,VLDL的机制更为复杂,因为转换的低密度脂蛋白被ApoE2受损,从而降低低密度脂蛋白的形成(19]。

ApoE也促成了“反向胆固醇运输,”antiatherogenic HDL-dependent通路的过剩胆固醇外围组织,包括动脉,被带到肝脏胆汁排泄。这种监管细胞胆固醇体内平衡,尤其是在巨噬细胞,在预防泡沫细胞的形成和动脉粥样化形成至关重要。高效细胞胆固醇流出取决于腺苷结合盒转运蛋白(ABCA1和ABCG1),但lipid-poor ApoAI——(preβ1 HDL)和ApoE-containing粒子(γ简述)狂热的初始胆固醇受体。值得注意的是,等离子体γ简述从E3/3科目分数隔离细胞胆固醇大大超过E2/2分数和E4/4等离子体(34]。另外,载脂蛋白e可以激活等离子lecithin-cholesterol酰基转移酶(LCAT), CETP,和肝脂酶(HL),这些都是参与HDL成熟(16]。巨噬细胞分泌ApoE病灶处,清除多余的主要受体动脉的胆固醇。这种效果是依赖于同种型ApoE2/2人类相比大幅下调单核巨噬细胞分泌大量的ApoE E3/3或E4/4细胞(35),显然是因为在巨噬细胞,尽管不是在肝细胞,cysteine-rich ApoE2形成二聚体和多聚体一定会分泌通路中的单体和留存(36]。

这些atheroprotective ApoE hyperlipidaemia证实的生物功能和动脉粥样化在ApoE-deficient (ApoE^−−/老鼠)。正常小鼠抵抗动脉粥样硬化和即使美联储proatherogenic饮食只开发不成熟脂肪条纹病变(37]。然而,ApoE^−−/老鼠是严重hypercholesterolaemic正常食物和自发发展普遍fibroproliferative病变,与平滑肌细胞进化成高级复杂的斑块帽和坏死核心(38]。另一方面,转基因动物表达人类共同的载脂蛋白e亚型ApoE atheroprotection[的揭示了更微妙的方面37]。例如,早期的研究在老鼠和兔子造成hypertriglyceridaemia ApoE3显示超表达是有害的。过度生产肝ApoE刺激VLDL甘油三酯的合成,还能抑制脂蛋白脂肪酶(LPL)调解的脂解作用,主要由取代ApoCII必不可少的辅助因子VLDL LPL的表面(19]。然而,表型数据的解释和比较不同组有时困惑,因为人类APOE转基因是插入到基因组不同位置和不同拷贝数和因为内生鼠标ApoE蛋白质也在场。

这些困难被引入基因替换策略生成减轻老鼠鼠标Apoe基因是人类等位基因所取代。然而,这些老鼠也有局限性:与野生型小鼠,ApoE3敲入动物容易dietary-induced鸡蛋和动脉粥样硬化,显然是因为人类ApoE3受体结合亲和力较低和更有效地清除残余粒子(39]。此外,类型III表明人类食用纯合的ε2等位基因是隐性的条件,而显性遗传在ApoE2敲入小鼠(40]。虽然这也反映了绑定人类和老鼠受体之间的差异,应该注意的是,~ 80% ApoB48-containing liver-derived鼠标VLDL的粒子,和,因此,老鼠更依赖ApoE的残余间隙比人类。有趣的是,许多稀有的ApoE变异与受体结合区域内的氨基酸替换做与主导类型III表明尽管大多数食用有足够的受体结合活性相比ApoE2 [19]。研究体外研究[41),也在ApoE2和载脂蛋白e (Arg142Cys)转基因小鼠19]表明隐性ApoE2保留HSPG绑定,允许残留间隙通过这个替代途径(19],而占主导地位的ApoE变体有微不足道的绑定,将一个总体清除率低于ApoE2 [31日]。

4所示。载脂蛋白e和Lipid-Independent Atheroprotection

现在认识到,载脂蛋白e满足几个生物功能与脂质运输和无关,这些antiatherogenic活动作出重大贡献16,42- - - - - -44)(图2)。大多数都是抗炎,包括早期的观察,ApoE限制t细胞活化和增殖45]。之后,我们的研究表明,细胞衍生的载脂蛋白e抑制血小板聚集和血管细胞黏附分子1的表达(VCAM-1)内皮细胞,行动由ApoE的共同机制与细胞表面受体交互LRP8 (ApoER2)激活一氧化氮合酶(NOSIII)和释放没有(46,47]。额外的数据表明载脂蛋白e刺激酪氨酸的磷酸化LRP8发起PI3激酶信号和激活NOSIII [48]。诱导平滑肌细胞迁移和增殖通过氧化低密度脂蛋白或血小板源生长因子也抑制由载脂蛋白e [49),而皮下保留LDL,早期proatherogenic事件(50),是阻碍ApoE的存在,此外调节pericellular内的细胞因子和生长因子蛋白聚糖矩阵(51]。有明确的证据表明载脂蛋白e保护细胞和脂蛋白脂质氧化和其他氧化isoform-dependent地强调,尽管结果可以随所使用的实验系统。在颗粒系统中,metal-induced氧化是被ApoE allele-specific地(E2 > E3 > E4),很大程度上是因为它吸收的金属离子(52- - - - - -54]。然而,当低密度脂蛋白与转染孵化巨噬细胞分泌等量的ApoE ApoE3和ApoE4亚型提供防止氧化比ApoE2 [54]。转染小鼠腹腔巨噬细胞也被证明有消炎ApoE3-expressing细胞分泌低水平的促炎细胞因子il - 6和TNF -α比ApoE2 ApoE4细胞(55]。

研究体内使用的载脂蛋白e^−−/老鼠也给可能的ApoE atheroprotective行动的重要线索。例如,脂蛋白从ApoE-deficient老鼠更容易氧化和氧化比从控制老鼠56),同时减少凋亡细胞的清除残余在缺乏ApoE [57]。ApoE抑制炎症的抗炎作用引起的脂多糖(LPS)或细菌假设基于ApoE的易感性增加^−−/老鼠的动物相比,当被质疑这种病原体(58- - - - - -60]。相比之下,一个特定的促炎作用的载脂蛋白e是由·范·德·艾尔曾和同事表明载脂蛋白e提供脂类抗原CD1 endosomal隔间的抗原呈递树突细胞,最有可能通过LDLR内吞作用,刺激自然杀伤t细胞(61年]。这激活了ApoE-depleted人类血清和也大幅减少ApoE-deficient老鼠挑战外源性脂类抗原。作者还推测ApoE可能使用这个途径提供self-lipid抗原和加剧动脉粥样硬化,尽管这样的抗原脂质也可以atheroprotective。全面描述ApoE和细胞因子之间的相互作用,包括调制的炎症和免疫反应和同种型依赖性,超出了本文的范围,但最近被张先生和他的同事们了(44]。此外,(patho)的生理重要性这样lipid-independent ApoE突出显示的行动研究,继续提供atheroprotection ApoE低级表达式^−−/动物,尽管他们hyperlipidaemia没有变化42,62年]。值得注意的是,Raffai et al。63年)提供令人信服的证据表明,低水平的ApoE蛋白质有能力回归先前存在的动脉粥样硬化病变,降低血浆胆固醇的独立。

5。ApoE Gene-Augmentation疗法

5.1。从蛋白质疗法和转基因小鼠早期的见解

二十年前plasma-purified或重组的载脂蛋白e蛋白被注入到兔子与遗传或食源性血胆甾醇过多。血浆胆固醇水平明显下降,而长期研究了动脉粥样硬化斑块的发展(64年]。临床证据支持APOE作为候选基因治疗操作。同样,合成肽模拟ApoE绑定地区(基于一位的二聚的重复。141 - 155年)在ApoE清除那些高胆固醇脂蛋白^−−/老鼠(65年),这一策略演变成共价耦合ApoE 141 - 150残留18嗜两性分子的螺旋肽能将患ApoB-containing脂蛋白(66年]。三次每周静脉注射这种双重领域的肽的载脂蛋白e^−−/小鼠6周降低血浆胆固醇和主动脉粥样硬化病变窦(67年]。

使用体内ApoE-secreting微小器官具体化这些antiatherogenic ApoE肽和纯化蛋白质。重组ApoE-expressing内皮细胞嵌入在皮内注入ApoE基底膜基质^−−/老鼠,3个月后,血浆胆固醇和降低动脉粥样硬化斑块(少50%68年]。同样,植入alginate-encapsulated ApoE基因工程细胞进入腹膜^−−/老鼠分泌足够的载脂蛋白e降低血浆胆固醇和增加atheroprotective HDL (69年]。转基因小鼠overexpressing ApoE ApoE atheroprotection提供额外的证据,这些动物免受食源性或糖尿病高脂血症(70年,71年]。此外,macrophage-restricted ApoE的表达在转基因小鼠72年),或载脂蛋白e^−−/小鼠骨髓移植后野生型(73年,74年),抑制动脉粥样化形成。

5.2。ApoE基因转移的研究

ApoE基因转移是16年前首次报道利用重组腺病毒(rAd)向量,可以提供外源DNA在哺乳动物肝脏效率接近100%。取得了高水平的血浆载脂蛋白e rAd.ApoE3静脉注射后的载脂蛋白e^−−/老鼠,降低血浆胆固醇和减缓主动脉硬化(75年]。不幸的是,治疗效果是短暂的,因为这些第一代向量引发了强烈的t细胞免疫反应。相比之下,第二代向量并持续人类ApoE表达,主要归一化ApoE的脂蛋白概要文件^−−/老鼠在6周的研究(76年]。此外,在hyperlipidaemic LDLR零老鼠,人类的肝脏表达ApoE3诱导回归先前存在的动脉粥样硬化病变在不改变血浆脂蛋白水平(77年(图),这意味着lipid-independent atheroprotective行动2)。可能回归先进粉瘤年老的动物也指出[78年),而helper-dependent rAd向量的低毒性、低免疫原性允许高稳定的载脂蛋白e和终身atheroprotection ApoE表达式^−−/老鼠(79年]。

另一种病毒载体rAd腺相关病毒(AAV),其中包含一个线性单链DNA基因组和现在在临床基因治疗试验的前沿。早期的研究使用向量来自于共同的血清型2体外转导细胞非常有效,但不幸的是体内主要是无效的。然而,这个领域被隔离了超过10个血清型,导致开发新的准型rAAV向量,衣壳替代AAV抱有基因组重组AAV血清型2种血清型。这些表现明显改善了体内不同组织趋向性AAV2/2;例如,rAAV2/8转导肝脏效率接近100% (80年- - - - - -82年),而rAAV2/1 [83年],rAAV2/6 [84年]或rAAV2/7 [85年]对骨骼肌有效转导。

增加血清型效率是由静脉注射(liver-directed)显示人类ApoE3 rAAV2/8向量的载脂蛋白e^−−/老鼠;正常的人类(50 - 80水平μ血浆载脂蛋白e g / mL)的生产(58]。提出,与血清型2,这些不同的AAV血清型脱壳迅速促进退火的单链+和- rAAV基因组稳定、转录活跃的双链DNA分子(86年]。同样,最近引入的自补rAAV (scAAV)向量,而规避需要退火rAAV向量基因组,允许快速和更高层次的转基因表达(87年,88年]。例如,表达式的ApoE3 scAAV2/8使用hepatocyte-specific启动子(LP1)归一化胆固醇水平在男性的载脂蛋白e^−−/老鼠和主动脉动脉粥样硬化发展迟钝的58% (89年]。

骨骼肌,可利用的、稳定和well-vascularized组织,也被用于ApoE基因转移。尽管肌肉不正常分泌的载脂蛋白e、nonhepatic nonmacrophage-derived ApoE是atheroprotective [62年,90年]。的确,肌内注射质粒DNA的矢量表达人类ApoE3 ApoE^−−/老鼠给温和但持续降低血浆胆固醇(91年),而另一个研究报告减少黄色瘤和动脉粥样硬化斑块形成92年]。质粒的高纯度和低免疫原性,游离在插入突变可能表示,使他们有吸引力的运载工具。表达式可以进一步增加了脉冲电流注入网站(s) (93年]。此外,我们有注射AAV2/7、AAV2/8 AAV2/9向量表达人类ApoE3 ApoE的胫骨前肌^−−/老鼠。最早的两个向量是最有效的,生产2μg ApoE3 /毫升血浆,13周,小鼠低50%比AAV2/9-treated动物头臂动脉动脉斑块脂质(94年]。

6。Oligonucleotide-Mediated基因编辑的人类APOE基因在培养细胞

6.1。背景

基因编辑,所描述的,使用短合成寡核苷酸操纵基因组DNA并介绍小,选择特定场地的变化,通常1 - 3个核苷酸,活细胞的基因。它有潜力,因此,引入特定的突变,收益或损失的函数,细胞系或鼠标菌株,研究单核苷酸多态性(snp)。下面部分7,我们将描述使用的一些策略来实现基因型的修改。然而,重要的是要注意,与基因转移技术,变化是永久性的;此外,现有的基因增强剂和促进剂和特异性控制和上下文,就留下了。这些优势支撑其终极目标:基因点突变引起的遗传性疾病的治疗或小缺失/插入。首先,我们解释为什么合成寡核苷酸,相对便宜,提供灵活的设计和化学,保持价值产生新的同基因的细胞系,为例,探讨微分ApoE亚型对细胞代谢的影响。第二节7。我们描述了快速治疗应用方面正在取得进展,例如,体外或原位修复基因点突变。

6.2。早期基因编辑:利用rna dna寡核苷酸

从概念上讲,这项技术是建立在独立的观察•史密斯和现年1980年代同源重组(人力资源)之间大量的外源DNA片段及其目标在哺乳动物基因组序列可以调解基因修改或修复(95年,96年];它还利用短合成寡核苷酸的应用修复有缺陷的等位基因在酵母(97年]。使用混合rna dna寡核苷酸(rdo或chimeraplasts)引入特定站点1 - 3对哺乳动物基因组核苷酸的变化报道15年前Kmiec集团(98年]。他们建造了rdo形成双链,hairpin-capped寡核苷酸结合短期纠正DNA有界区域长时间的保护2′-O-methyl RNA。强烈的rna dna碱基配对被认为是促进链入侵和退火到目标(例如,基因点突变)基因位点。这个高亲和性杂交涉及链基因并创建不匹配的点突变,导致识别和修正的一个或多个哺乳动物基因修复途径。Kmiec的早期研究和他的同事们在修复镰状细胞突变lymphoblastoid细胞系(99年),主要针对CD34 +细胞(One hundred.)生成多兴奋,但也明显的争议报道转换效率高达50%的被认为是难以置信的(101年]。然而,这些批评别人的被确证的偏转,包括针对人类肝细胞细胞(102年,103年),在具有里程碑意义的研究中,针对鼠体内IX因子基因(104年)和修正的UGT1A1基因突变在hyperbilirubinaemic Gunn鼠(105年]。

基于这些成功,我们实验室开创了技术在心血管疾病,包括转换功能失调ApoE2 [106年]和ApoE4 [107年)使用标准68 - mer RDO ApoE3定位。然而,这个新兴的实用性方法质疑当几个团体,包括我们自己的宇宙,开始报告再现性差和不稳定的转换(108年,109年]。一个不利因素是变量的质量RDO分子漫长而复杂,这意味着更高的剂量试剂和运载工具修复效果;反过来,这将增强细胞毒性和proapoptotic行动或诱导细胞周期阻滞107年,109年]。这些第一代试剂的问题本质是减轻,然而,通过发现Kmiec集团RDO初始化所有的dna链的基因修复(110年),单股的所有的dna寡核苷酸(ssODN)可能比RDO如果免受核酸酶降解化学改性的基地111年]。节中描述6.3,这些数据促使我们转向短(27-mer) ssODNs,纯净和再现性增加。

6.3。单链的基因编辑:使用所有的dna寡核苷酸(ssODNs)

针对ssODNs同源的基因组序列,除了所需的变革——失配引入或正确的点突变,插入/删除或短。单链DNA快速降解细胞内,ssODNs通常保护修改nuclease-resistant基地,最常见的三个phosphorothioate(美国专利商标局)债券的5′和3′末端。分子靶向基因改变的细节保持浸润但包括核苷酸的元素和基本切除修复系统,也一定程度的人力资源参与(112年,113年),而至少纠正DNA寡核苷酸是身体的一部分纳入基因组目标站点(114年]。鉴于与RDO-directed维修相关的困难和争议,我们决定优化我们的方法报告基因在哺乳动物细胞表达重组敏感,绿色荧光蛋白(GFP)被引入呈现nonfluorescent点突变。这允许在单个细胞水平分析和纠正的收获(绿色)细胞进行进一步的研究。我们提供了严格的证据来验证技术和建立明确ssODN-mediated基因改变是一个真正的和可再生的现象115年]。

虽然5′3′保护专利和商标局给10倍校正效率大于未改性ssODN(大约2%与0.2%的目标细胞是绿色的),我们确认别人的观察(111年),只有低比例的这些绿色细胞积极复制(116年]。细胞周期分析16 h posttransfection透露,美国专利商标局的ssODN结束保护导致DNA损伤的积累在G2期细胞,而未经治疗ssODN明显更少的有毒。然而,通过不同类型或者位置的保护组织,我们发现内部保护ssODN保持在目标站点上有四个美国专利商标局残留高效基因修正,相比5′3′专利和商标局保护,显著降低了细胞周期阻滞,使细胞生长和增殖(图3)[116年]。

我们目前正在评估这本小说ssODN设计针对内生APOE3单核巨噬细胞和人类基因在人类THP1 HepG2(包括肝胚细胞瘤细胞ε3 /ε3)生成有ApoE4表型的细胞。我们设计了一个亲和捕获矩阵区分成功目标ApoE4-secreting细胞(< 1%)从noncorrected ApoE3细胞。它使用低渗透羧甲基纤维素媒体预装一个商业ApoE4-specific单克隆抗体检测,让敏感的和可复制的结果。分泌ApoE容易困在单个细胞的表面,提高染色效率和减少试验时间。丰富纠正ApoE4-secreting细胞的数量被检测到,虽然隔离和纠正克隆扩张是一个很大的难题。成功的克隆应该识别和特征,然后将进行第二目标生成ApoE4/4表型。

这些实验是著名的有两个原因。首先,他们将提供确凿证据证明ssODN-directed基因编辑可以生成新的细胞系,在这里,E3和E4和E4/4表型,虽然类似的策略可以生成其他常见的表型(E2、E3, E2/2 E2/4)如果使用一个ApoE2-specific抗体(117年]。第二,因为这些同基因的细胞可以用来研究同种型巨噬细胞和肝细胞的差异ApoE贩运和分泌35,36),监控微分细胞对氧化剂的反应压力或胆固醇加载和调查分泌ApoE脂蛋白颗粒的结构和成分的变化(48]。

7所示。治疗原位校正的缺陷APOE基因

7.1。理由ApoE基因修复

大部分的体内研究中描述的部分2- - - - - -4使用ApoE零老鼠。这些给重要见解ApoE函数和允许准备评估蛋白质和基因疗法。然而,随着载脂蛋白e基因缺陷和缺席在人类血浆载脂蛋白e非常罕见,临床前模型的价值是有问题的。因此,值得一提的是,增加血浆载脂蛋白e通过转基因表达或基因转移已确认其atheroprotective功能在糖尿病或fat-fed LDLR缺陷小鼠和老鼠,所有的正常水平的血浆载脂蛋白e。然而,动物实验也表明谨慎增加ApoE3表达式利用基因转移技术;老鼠和兔子过度导致hypertriglyceridaemia [19]。

另一个和有吸引力的方法,尽管一个遥远的治疗目标,是缓解dyslipoproteinaemia原位校正,降低心血管疾病风险的有害APOE基因使用靶向基因编辑。这是可行的吗?一种可能性,建立在多个atheroprotective行动macrophage-secreted ApoE3,是治疗类型III表明移植的造血干细胞(hsc)食用,体外修复后的异常APOE基因。条件是隐性的,转换的ε两个等位基因ε3应提供有效的治疗。此外,当前的动力将干细胞技术临床,特别是诱导多能干细胞(万能),显示更多的可能性为体外操作和细胞疗法(118年]。这些包括有效的差异化功能hepatocyte-like细胞(119年- - - - - -121年),这将允许一个修理APOE从细胞道成肝脏基因表达。最后,也有令人兴奋的前景直接体内肝基因打靶原位校正的遗传性疾病(122年]。这些复杂的治疗修复有缺陷的基因在未来将依赖于先进的技术比简单的核交付ssODNs这些是在本文的其余部分讨论。

7.2。DNA修复模板

ssODNs我们使用的目标APOE基因有几个优势:高纯度和简单的生产,包括变量化学、简单的交付和高保真没有脱靶效应。尽管ssODNs和其他结构,如三重螺旋形成寡核苷酸和小同源DNA片段(113年)可以作为DNA修复模板,最有效的是腺相关病毒(AAV),线性单链DNA基因组。虽然技术挑战性的产生,这些病毒载体基因目标胚胎干细胞(ESCs),肝星状细胞或细胞则实现修正的效率[0.07 - -1%113年,123年- - - - - -125年]。机制,如图5定位和基因修复的缺陷APOE2是通过同源重组(HR),沉默的基本组件潜在的竞争途径,nonhomologous结束加入(NHEJ)对转换频率没有影响126年]。还需要注意的是,针对向量可以港口选择标记,如嘌呤霉素N-acetyl-transferase,之间的同源性武器,如果两侧是两个LoxP网站可以切除Cre-recombinase修复细胞的基因组。最近,helper-dependent运载体(HDAdVs)也被用于高效和精确的基因打靶的人类的ESCs和万能(127年,128年]。这些向量能够纠正大型基因组区域(35 ~ kb),如果目标轨迹是影响转录活性(129年]。

7.3。双链断裂(双边带)明显刺激HR基因修复

虽然HR-directed基因修复是准确的和通用的,如图4和5,它发生在一个非常低的频率在哺乳动物细胞(~ 10⁻⁶)利用传统线性目标质粒为模板(130年]。然而,人力资源是一种细胞修复DNA双链断裂,例如,通过使用姐妹染色单体作为模板,这种现象已经增加人力资源利用基因打靶事件超过1000倍。初步研究插入meganuclease罕见削减网站,我-南加州爱迪生公司我,在一个记者目标基因然后cotransfected细胞核酸内切酶和修复DNA模板(131年,132年]。然而,这样一个系统几乎没有实用价值;它需要之前工程的目标基因和不能用于内源性基因。

最近的工作在工程人工内切酶现在绕开这个瓶颈通过创建嵌合核酸酶断裂可能DNA在几乎任何想要的序列。研究最多的是锌指核酸酶(ZFNs),它包含一个DNA结合域(组装模块3 - 5个手指,每个识别3个基地)与非特异性DNA裂解酶,FokI。原则上,定制ZFNs函数成对FokI乳沟需要二聚作用可以创建与预先确定的序列特异性引入双边带在一个精确的基因位点(图6)。在过去的几年里,一个令人印象深刻的ZFN基因打靶的成功已经报道,包括体外18 - 30%的回落,代gene-knockout老鼠,操纵人类胚胎或诱导多能干细胞113年,133年- - - - - -136年]。ZFNs担忧之一是基因毒性由于非目标分裂,可能会扰乱正常的基因(137年),尽管改进设计和筛选程序有助于减少这种可能性(138年,139年]。第二个问题是,ZFNs recleave维修站点,尽管这可以最小化通过引入几个沉默突变为供体DNA模板这将影响后续ZFN绑定(140年]。

转录activator-like效应核酸酶(取得)另一组嵌合核酸酶,具有不同的dna结合域耦合的类FokI。TAL效应蛋白含有高度模块化的DNA结合域,使用一个非常简单的代码之间的氨基酸和目标DNA碱基(141年,142年]。这允许单个模块的准备装配一系列绑定一个独特的DNA序列和激活FokI二聚和乳沟。虽然报告TALEN-mediated基因打靶的哺乳动物细胞仍然是有限的,这种简单而有效的技术可能很快取代ZFNs;事实上,在第一个直接比较,取得更高的特异性和更少的细胞毒性比ZFNs [143年]。

最后,另一个工程嵌合核酸酶是归巢内切酶,特异性诱导双边带的例外。这些是天然的酶与大型非对称识别序列(12-40 bp),形成五个家庭基于序列和结构同源性(144年,145年]。“混合搭配”工程,由于计算,允许生产和验证的定制meganucleases,大多数基于LAGLIDADG家庭序列基序。反过来,未来的双边带网站可以预测整个人类基因组。这表明,它将有可能确定一个独特的外显子4内> 14-bp序列APOE基因可以由自导meganuclease裂解。

7.4。ZFN-ssODN组合

到目前为止,最常见的模板双边带repair-dependent基因打靶圆形或线性质粒,虽然使用AAV的外源性DNA供体基质的优点现在新兴(146年- - - - - -148年]。然而,令人兴奋的新工作建立ZFN-ssODN组合提供了灵活、高效的基因组编辑。陈和他的同事们(149年]使用ZFNs削减ssODN相同区域内和报告编辑1和30%之间的频率根据细胞类型和目标是否单核苷酸替换或小型到大型删除。重要的是,ssODN出现一个更有效的和忠实的重组的伴侣比传统的双链DNA结构,最有可能因为ssODN不参与NHEJ因此不会插入特异性的乳沟网站。的确,两人ZFN-ssODN已被用来成功地编辑人类iPS细胞(150年]。鉴于ssODNs更容易和更便宜的生产批量、高纯度和安全性配置文件,和相对容易实现,似乎他们的使用将继续扩大。

8。结束语

技术修复先天基因突变细胞,包括造血干细胞和诱导多能干细胞,在最近几年发展迅速。原位校正的功能失调ε2,ε4等位基因缓解hyperlipidaemia和对抗动脉粥样硬化的进展现在是一个临床前的现实。也可翻译的病人。的组合选择AAV-based高效人力资源修复DNA模板,进一步刺激的安全、精确的目标基因位点引入双边带,提供了必要的技术工具(146年,147年,151年]。实际上,使用工程内切酶是最近宣布基因组编辑大自然的方法对2011年(152年]。

修复有缺陷的APOE2基因骨髓(lineage-negative)干细胞来自患者III型表明,食用之后是非(强度)移植,将提供macrophage-secreted antiatherogenic ApoE3病灶处,阻止动脉粥样硬化斑块进展。这种治疗方法可以批判性地评估在临床前模型中,人类ApoE2敲入老鼠。此外,直接体内肝基因打靶的前景原位校正功能失调ε2等位基因不再是一个遥远的梦想。Codelivery通过hepatotropic AAV8向量嵌合核酸酶和供体DNA模板的老鼠的肝脏和血液因子IX缺乏恢复止血法(122年]。

有理由也转换吗ε4等位基因ε3降低心血管疾病风险时,部分中概述2,甚至可能只是增加边际ε4 /ε4运营商?毫无疑问,这种情况可以认为:在这一群体中,肯定会有那些将受益,也许因为他们的低密度脂蛋白的统计ε4 /ε4运营商或因为他们有其他风险因素。编辑的未来前景的基因在巨噬细胞和/或肝也允许更灵活的治疗方法。考虑到ε2等位基因与低的低密度脂蛋白和减少心血管疾病有关,我们也可以推测,一个更好的治疗选择是将细胞从ε4 /ε4的ε4 /ε2基因型,而不是ε4 /ε3所示。ApoE然而,清楚的是,在1973年被发现在人类VLDL [153年),在人类细胞生物学和疾病有多个角色,尽管令人印象深刻的理解这些功能在过去的二十年里,我们仍有更多的发现。在时间,希望这样的见解,再加上新兴技术原位体外或编辑的人类APOE基因,最终将转化为病人治疗降低心血管疾病风险。

缩写

AAV:	Adenoassociated病毒
ABCA1 / G1:	腺苷结合盒转运体A1 / G1
7月:	载脂蛋白
心血管疾病:	心血管疾病
CETP:	胆甾醇酯转运蛋白
双边带:	双链断裂
ESC:	胚胎干细胞
绿色荧光蛋白:	绿色荧光蛋白
HDAdV:	Helper-dependent腺病毒
HSPG:	硫酸乙酰肝素蛋白多糖
霍奇金淋巴瘤:	肝脂肪酶
高密度脂蛋白:	高密度脂蛋白
人力资源:	同源重组
HSC:	造血干细胞
iPSC:	诱导多功能干细胞
LCAT:	Lecithin-cholesterol酰基转移酶
低密度脂蛋白:	低密度脂蛋白
LDLR:	低密度脂蛋白受体
含:	低密度脂蛋白受体相关蛋白
有限合伙人:	脂多糖
NHEJ:	Nonhomologous结束加入
PCSK9:	Proprotein转化酶枯草杆菌蛋白酶/可馨类型9
美国专利商标局:	Phosphorothioate
rAdV:	重组腺病毒
RDO:	rna dna寡核苷酸
scAAV:	后腺相关病毒载体
ssODN:	单链oligodeoxyribonucleotide
取得:	转录activator-like核酸酶
VLDL:	极低密度脂蛋白
ZFN:	锌指核酸酶。

确认

作者的工作是支持由英国心脏基金会资助项目(PG / 06/015/20305和PG / 09/070/27912)彼得·塞缪尔基金的一个奖项,皇家自由医院即Papaioannou (933)。

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