利用基于细胞板的组织工程治疗心脏病的再生疗法

抽象的

目前，心脏疾病是世界范围内发病率和死亡率的主要原因。最近，一种基于细胞的再生医学已经成为最有潜力和最有前景的治疗心脏病的方法之一。组织工程作为一种新型的以细胞为基础的再生治疗方法，备受关注。本实验室率先开发了基于细胞片的无支架组织工程。心肌细胞薄片通过缝隙连接相互紧密连接，在宏观上同时跳动，并表现出心肌组织的特征结构。细胞片治疗可以治愈动物模型受损的心功能，并在临床上得到应用。基于细胞板的组织工程在心肌组织再生医学方面具有广阔的前景和巨大的潜力，将治愈许多严重心脏病患者。本文综述了基于细胞板的组织工程技术及其在心脏疾病治疗中的良好效果。

1.介绍

心脏疾病的各种临床治疗包括基于药物、导管、手术和医疗设备的治疗，并被发现可以延长心脏疾病患者的寿命。然而，心脏病仍然是世界上特别是发达国家发病率和死亡率的主要原因[1- - - - - -3.］.一些传统疗法存在一些问题，如可能的副作用风险、特殊技术和重复治疗的要求、免疫排斥、供体短缺、感染和血栓等。因此，目前，外科、内科、药理学、医疗器械技术、化学、细胞生物学等各个领域的研究人员都在积极探索这些问题的可能解决方案，建立重症心脏病的新疗法。

细胞再生治疗是目前最有前途的治疗心脏病的方法之一。直接注射游离细胞的再生疗法已在临床进行，其适度的治疗效果已得到证实[4- - - - - -10］.以往的动物模型研究和临床试验表明，许多注射细胞在移植后死亡，只有少数移植细胞在梗死心肌中被检测到[11，12］.注射的细胞存活率低，阻碍了更有效的治疗效果。此外，在分离细胞注射的情况下，很难控制注射细胞的形状、大小和位置。为了克服这些问题，组织工程被认为是治疗心脏病的新一代细胞疗法[13］.目前基于概念的组织工程目前基于三维（3D）支架用作细胞外基质（ECM）的替代物，并且将细胞接种到支架中[14］.工程心肌组织移植可以改善动物模型中受损的心脏功能，临床试验已经开始[15- - - - - -18］.

另一方面，我们实验室最初开发了基于细胞片的无支架组织工程，利用独特的培养表面嫁接温度响应性聚合物poly(N-异丙基丙烯酰胺)(PIPAAm)，它可以通过简单的温度变化控制活细胞的附着和分离[19，20.]本文综述了（1）基于细胞片的无支架组织工程，（2）细胞片工程制备的三维组织的特点，以及（3）该组织对心脏疾病的治疗作用。

2.利用温度响应表面制备电池片

在我们的实验室，最初开发了一种独特的细胞培养表面，共价接枝与温度响应聚合物PIPAAm [19，20.]。表面略微疏水，细胞可在37°C下粘附和增殖。疏水表面通过将温度降至32°C以下变得亲水，细胞无法粘附到表面。这种独特的表面变化使培养的细胞可以通过降低温度而不进行任何蛋白水解处理，自发地脱离培养表面[21，22］.当细胞在表面同时培养时，细胞可以分离成一个连续的细胞薄片，而不会因降低培养温度而破坏细胞与细胞之间的连接(图)1) [21，22］.除了细胞-细胞连接外，纤维连接蛋白基质是介导细胞粘附到培养皿上的主要ECM成分，即使在细胞脱离后，也能在细胞薄片上保存下来(图)1) [21- - - - - -23］.由于在培养过程中产生的沉积ECM的存在，细胞薄片可以很容易地附着到其他表面，如培养皿、其他细胞薄片，甚至宿主组织。因此，无需支架，只需将细胞薄片分层即可轻松创建3D组织(见图)2)．基于细胞板的组织工程已经应用于包括心肌、角膜上皮、食道、肺、肝、胰腺、甲状腺和牙周组织在内的组织的再生医学[21，22，24- - - - - -31］.在一些组织中，临床试验已经开始[25］.基于细胞片的组织工程在以下章节中概述了对心肌组织重建的应用。

3.心肌细胞薄片在体外分层制备电传导性三维心肌组织

使用温度敏感的培养表面，融合的新生大鼠心肌细胞也可以通过简单地降低培养温度，无创地收获为连续的细胞薄片(图)1) [24］.由于包括心肌细胞间缝隙连接(gap junction, GJs)在内的细胞-细胞连接被完全保留，即使在脱离之后心肌细胞薄片也可以同步跳动(图中电图)1) [32］.层状心肌细胞薄片间电偶联和功能偶联的建立是实现三维心肌组织同步搏动的关键。因此，层状心肌细胞薄片之间的电和功能相互作用被精确地分析[32］.在体外，两个心肌细胞薄片在分层后大约40分钟电偶联[32］.此外，染色转移试验和免疫组织学分析也显示了层状心肌细胞薄片之间的快速GJ形成[32］.此外，免疫组织学分析表明心肌细胞片上的细胞表面GJ前体的存在[32］.因为GJ被认为是通过将两个GJ前体在不同的两个细胞膜上对接而迅速形成的[33[心肌细胞片上的GJ前体的保存必须在层状细胞片之间诱导快速的电气和功能联轴器。此外，沉积的心肌细胞片上的ECM还促进了层状细胞片之间的密切附着，并且可以加速GJ前体的对接。这些结果表明，体外完全的电通信3D心肌组织可以通过层状心肌细胞片制造。事实上，已知在体外，已知多层心肌细胞片被自发地，同步，同步和宏观击败[24］.

4.体内移植层状心肌细胞片

接下来解释了使用分层心肌细胞薄片的体内实验[24，34，35］.当层状心肌细胞薄片移植到裸鼠皮下组织时，移植的移植物也会同步宏观地搏动，有趣的是，来自移植物的表面电图能够独立于宿主心电图而被检测到[24，34］.植入心肌细胞薄片的组织学分析显示心脏组织的特征结构，包括拉长的心肌细胞、分化良好的肌节、GJs和多条血管[35］.长期观察显示，移植物搏动存活1年以上，移植物体积、传导速度和收缩力随宿主生长比例增加，表明工程心肌组织极有可能在体内永久存活[34，35］.发现植入的心肌细胞片与真实的心脏组织非常相似。

细胞片可直接移植到心脏表面，无需缝合，细胞片可有效输送而不丢失[36］.此外，在将分层的心肌细胞片移植到梗塞的大鼠心脏上，建立了植入的心肌组织和宿主心脏之间的电气和功能性偶联[36］.预期脉动心肌组织移植物预计通过电气和功能联轴器贡献受损心脏的机械支撑。

5.心肌细胞片移植对动物模型的治疗作用

Miyagawa等人利用大鼠受损心脏模型研究心肌细胞薄片移植的治疗效果[37].将分层心肌细胞片移植到梗死心肌中可导致左心室壁厚度显著增加和左心室横截面积减少[37］.此外，细胞片移植可显著改善左室射血分数(EF)和分数缩短，并显著降低左室收缩末期面积[37］.此外，心肌细胞薄片的移植诱导了分支阻滞的丧失，这可能与疤痕区心脏组织的纤维化或坏死有关[37］.这些结果表明:(1)植入的心肌细胞薄片与宿主心脏之间建立了电连接;(2)心肌细胞薄片移植可诱导受损心脏功能的恢复。

另一方面，心肌细胞薄片内内皮细胞(EC)共培养对治疗效果的重要性也有报道[38］.体外，心肌细胞薄片内ECs共培养诱导血管生成相关基因，即血管内皮生长因子(VEGF)和Cox-2的表达，并形成ec来源的毛细血管样血管前网络[39]使用温度响应性培养皿，这些细胞片包括血管前网络能够完整地恢复和移植[39]Sekine等人使用大鼠梗死模型检查预血管化心肌细胞片的治疗效果，并与EC阴性心肌细胞片进行比较[38].与EC阴性分层细胞片移植相比，包括EC网络的三层心肌细胞片移植诱导梗死心脏血管密度显著增加[38］.观察到宿主心脏功能的改善与心肌细胞薄片内EC数量的增加成比例(假对照组的缩短百分比为（，）;EC -组:；EC移植组:；EC移植组:；EC移植组:) [38］.与ec阴性心肌细胞片相比，ec阳性心肌细胞片移植诱导宿主受损心脏的纤维化显著减少[38］.体外，ec阳性心肌细胞薄片产生的血管生成相关细胞因子(碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)和VEGF)数量明显高于ec阴性心肌细胞薄片[39］.VEGF和bFGF是血管生成的强促进剂，HGF具有抗重构活性，包括抗凋亡和抗纤维化梗死心脏以及血管生成[40- - - - - -44］.因此，从包括ECs在内的植入细胞薄片中产生的这些细胞因子被推测与更有效地改善受损的心脏功能有关。

6.自体成肌细胞片移植在动物模型中的治疗作用

目前，使用人类心肌细胞的临床试验尚未完成，尽管人类胚胎干细胞[45]及诱导多能干细胞[46，47]具有吸引人的潜力作为脉动心肌细胞来源。另一方面，如前所述，自体细胞在临床上用于心脏病的治疗[4- - - - - -10］.成肌细胞作为心肌组织修复临床试验的第一细胞来源[4］.Sawa和同事完成了许多与成肌细胞薄片相关的研究[48- - - - - -52］.Memon等人研究了自体骨骼肌成肌细胞薄片在大鼠梗死模型中的治疗效果，并与肌成肌细胞注射的治疗效果进行了比较[48］.肌细胞板的移植诱导LVEF的显着改善和与注射肌细胞的分数区域的百分比缩短[48]另一方面，与介质注射对照组相比，成肌细胞注射也能诱导心功能的改善[48］.仅在细胞片移植组中观察到LV室区域的减少[48］.细胞片移植诱导出均匀且明显较厚的前壁，而细胞注射组与对照组之间的厚度没有差异[48］.此外，与细胞注射相比，细胞片移植诱导心肌纤维化显著减少，而细胞注射与对照组相比减少了纤维化[48］.成肌细胞薄片移植区基质衍生因子1 (SDF-1)和血管生成相关细胞因子(HGF和VEGF)的RNA表达明显高于成肌细胞注射区[48］.SDF-1招募表达CXCR4的造血干细胞[53，54］.事实上，在梗死心脏中，与成肌细胞注射和对照组相比，在成肌细胞薄片移植中观察到大量造血干细胞的募集[48］.SDF-1的生产以及HGF和VEGF也可能与细胞片移植的治疗效果有关。这些数据表明，细胞片移植可以比细胞注射诱导更显着和显着提高心脏功能[48］.

在这些实验中，梅蒙等人使用了双层成肌细胞片。Sekiya等人分析了多层成肌细胞片的作用，以阐明细胞片数量的增加是否诱导心脏功能的改善[51］.与单层或双层细胞片相比，五层成肌细胞片的移植能显著改善心脏功能(减少心脏肥厚，抑制心脏纤维化等)，并在梗死心脏中形成更高的微血管[51］.三层细胞薄片的治疗效果等于或略小于五层细胞薄片[51］.在体外，成肌细胞薄片促进血管生成因子的表达与细胞薄片的数量成比例[51］.成肌细胞薄片的移植也通过对流层弹性蛋白的表达诱导梗死心脏中弹性纤维的组织，该蛋白在五层细胞薄片中表达最强烈[51］.通过弹性纤维的重组恢复宿主心脏的弹性，也必然与心脏功能的改善有关。总之，他们描述了心功能的改善可能在五层细胞薄片上趋于平稳[51］.

此外，还使用中型或大型动物模型进行实验[49，50，52]自体成肌细胞片移植也可通过仓鼠模型诱导扩张型心肌病心脏的修复[49］.成肌细胞片的移植可改善心脏功能，延长动物寿命，与宿主心肌组织细胞骨架蛋白的重组和心肌纤维化的减少有关[49］.HGF不仅诱导纤维化的减少，而且还诱导细胞骨架蛋白如α和β肌聚糖的重组，这些蛋白在心肌收缩过程中具有加强质膜的机械功能，并在组织的信号转导中发挥重要作用[55］.细胞骨架蛋白的重组一定是心脏功能改善的原因之一。因此，从植入的成肌细胞薄片中分泌包括HGF在内的细胞因子可能对扩张型心肌病的心脏功能改善也很重要。Hata等人使用大型动物扩张型心肌病模型，即起搏诱导的犬心衰模型[50］.自体成肌细胞片移植可减弱心脏重塑，改善左室收缩和舒张功能[50］.Miyagawa等人使用猪缺血心肌模型[52］.成肌细胞片移植通过减弱猪缺血心肌的心脏重塑诱导心功能的改善[52］.在大鼠和仓鼠模型中，使用在35毫米温度响应培养盘上制备的小尺寸细胞片(直径约10毫米)[37，38，48，49，51］.另一方面，在犬和猪模型中，使用在60mm或100mm温度响应培养盘上制备的大尺寸细胞片(直径约20 - 40mm) [50，52].使用在100℃下制备的大尺寸细胞片可以有效地移植许多细胞 嗯，盘子。基于在几种动物模型中取得的这些令人满意的结果，自体成肌细胞片移植的临床试验正在进行中。在临床试验中，从100 用的是盘子。

7.成年干/祖细胞片移植在动物模型中的治疗效果

几种成体干细胞片(脂肪源和经血源间充质干细胞片和心脏祖细胞片)的移植也在小动物模型中提供了有希望的结果[56- - - - - -58］.Miyahara等人利用大鼠脂肪组织来源的间充质干细胞片[56］.在体外，干细胞薄片也产生大量的HGF和VEGF [56].将单层脂肪组织来源的干细胞片自体移植到大鼠梗死心脏上可诱导植入细胞片的生长（厚度：约600 μ.m）包括许多新形成的血管[56］.干细胞片移植可改善受损心脏的心脏功能，逆转心肌壁变薄，延长心肌梗死后的存活时间[56］.另一方面，从植入干细胞的体内心脏分化几乎没有观察到[56]Matsuura等人使用小鼠心脏祖细胞片[57].心脏前体细胞片的自体移植通过心肌细胞与前体细胞的分化以及通过可溶性血管细胞粘附分子1（VCAM-1）/极晚抗原4（VLA-4）信号通路介导的旁分泌效应诱导受损心脏功能的改善[57］.Hida等人使用人月经血来源的间充质干细胞片[58］.有趣的是，人类干细胞通过与小鼠心肌细胞共培养有效地分化为自发跳动的心肌细胞[58］.此外，人月经血源间充质干细胞片移植也能显著恢复受损心功能，减少裸鼠模型心肌梗死面积[58］.包括干细胞来源的心肌细胞在内的组织在植入区域被发现[58］.骨髓来源的干细胞片被成功地制造出来，它们移植到大型动物模型的工作目前正在包括我们在内的几个实验室进行。

8.心肌组织工程的未来可能性

通常，移植组织工程移植物的治疗效果主要归因于以下关键因素：（1)通过移植的脉动心肌细胞机械支撑;(2）从移植组织中分泌几种细胞因子，包括血管生成因子;（3）心肌梗死部位毛细血管网的形成;(4)对受损心脏重塑的抑制。

关于(1)，建立临床适用的搏动心肌细胞源非常重要。在这一点上，ES/iPS细胞是有吸引力的，并期待未来的研究进展。此外，脉搏性心肌组织的扩大也是重要的。在100mm培养皿上制备并移植了大尺寸细胞片。另一方面，氧气和营养的供应不足和废物的积累限制了它们的厚度，妨碍了组织结构的扩大。本实验室采用心肌细胞薄片多外科手术方法，制造了厚度约1毫米的强脉动心肌组织，为上述问题提供了一种解决方案[59］.Hata等人的试验也很有趣[60］.他们报道了制造厚度约为800的心肌组织μ.M结合心肌细胞薄片与心肌细胞种子脱细胞猪小肠黏膜下层[60］.关于(2)-(4)，我们进行了一些努力，如与EC共培养和层状细胞片数量的调查，如本文所述。此外，包括我们在内的许多实验室都在讨论几种提高心脏疾病工程组织移植治疗效果的可能性[61，62］.尽管包括无支架细胞板组织工程在内的心肌组织工程尚处于起步阶段，但该技术被认为具有广阔的发展前景。

9.结论

摘要无支架细胞板组织工程在体外和体内制备电传导性和脉冲性三维心肌组织方面具有重要的应用价值。基于细胞薄片的组织工程制备心肌组织移植是一种与细胞注射截然不同的细胞输送方法，以往的研究表明，在多种动物模型中，心肌组织移植具有广阔的前景和强大的潜力。细胞薄片组织工程在治疗严重心脏病方面具有广阔的前景和巨大的潜力。

致谢

作者们欣赏Norio Ueno博士（东京妇女医科大学先进的生物医学工程与科学研究所）的有用意见和技术批评。这项工作得到了21世纪卓越中心（COE）计划的补助金，全球COE计划，多学科教育和技术和再生医学研究中心（梅尔克雷姆），创新中心在特殊协调基金中融合的创新中心促进科学，文化，体育科学和技术（MEXST），日本和日本促进科学（JSP）的高科技研究中心计划通过“世界资助计划”- 通过理事会（CSTP）启动的科学技术（第一计划）创新研发（第一计划）。

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