Ghrelin通过抑制炎症保护脂多糖诱导的急性肺损大鼠免受肺血管功能障碍的影响

摘要

客观的．探讨抗炎药胃饥饿素对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠肺血管功能障碍(PVD)的影响及其机制。方法．三十二只成年雄性斯普拉格道利鼠(N= 16/组)随机分为胃饥饿素组和生理盐水组，皮下给予胃饥饿素(10 nmol/kg)或生理盐水。30min后，每组随机选取8只大鼠，气管内灌注LPS (5mg /kg)或生理盐水诱导ALI。建立ALI大鼠模型4 h后，平均肺动脉压(mPAP)、平均右心室收缩压(RVSP)、促炎细胞因子肿瘤坏死因子-水平α(肿瘤坏死因子-α)、白介素-6 (IL-6)、BALF细胞计数、湿-干肺重量比、肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性。免疫组化染色检测-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，分别评估肺动脉壁厚度和平滑肌细胞的增殖情况。结果．ghrelin预处理ALI大鼠mPAP、RVSP、PCNA表达、MPO活性、W/D肺重量比、TNF-均降低α而ghrelin对ALI大鼠肺内动脉壁厚度无影响。结论．我们的结果证实了阿里炎症和PVD之间的关联，并提出了Ghrelin预处理的抑制炎症可以保护LPS诱导的Ali大鼠针对PVD。

1.介绍

急性肺损伤(ALI)及其最严重的形式，急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，以急性发作的缺氧为特征，导致弥漫性肺泡损伤、肺血管通透性增加、非心源性肺水肿和肺顺应性差[1］．脓毒症和脂多糖(LPS)是众所周知的因素，可以诱导ALI，因为它们的促炎作用。值得注意的是，败血症引起的ALI死亡率高达25-50% [2］．然而，目前，尽管对ALI/ARDS的发病机制、治疗和预防机制进行了大量的研究，但由于缺乏对其病因的了解，对该病尚无有效的治疗方法。

由于肺血管功能障碍（PVD），右心室功能障碍以及持续和严重的低氧血症，其在ALI中常见[3.那4.]，增加ALI的发病率和死亡率[5.］．因此，迫切需要更好地了解PVD，以阐明ALI的病因和发病机制。据报道，在ALI中由于PVD发生的病理生理变化包括内皮功能障碍、肺血管闭塞、血管张力增加、外部血管闭塞和血管重塑[6.］．据报道，ALI炎症反应中趋化因子和细胞因子的过度分泌导致PVD [7.那8.］．因此，本研究旨在通过使用抗炎剂ghrelin来确定ALI中炎症与PVD之间的关系。

胃促生长素(Ghrelin)是由胃肠道的肠内分泌细胞产生的一种含有28个氨基酸的肽，是生长激素促分泌受体的内源性配体[9.］．它可以通过诱导垂体控制的生长激素分泌来刺激下丘脑增加食物摄入量。此外，胃饥饿素已被证明具有多种抗炎作用在体外和在活的有机体内[10.-12.]，包括肺血流量增加和促炎细胞因子水平降低，从而缓解ALI [13.］．我们在之前的一项研究中也表明，ghrelin激动剂GHRP-2可以减少呼吸机诱导的肺损伤，缓解lps诱导的ALI [14.那15.］．由于ghrelin对ALI中PVD的影响尚未明确，本研究通过lps诱导的ALI大鼠模型来阐明ghrelin对PVD的影响及机制。

2.材料和方法

２.１.动物护理与分组

三十二名男性Sprague Dawley Rats（武汉大学的实验动物中心），体重180-200克，在12小时内的无病原体环境中被置于无理体环境中。提供食物和水随意．本研究方案经本机构动物研究伦理审查委员会批准，实验按照动物福利准则进行。大鼠随机分为四组(N = 8/group): ghrelin, ghrelin + ALI, saline, and saline + ALI. Specifically, the rats were first divided into two groups (N = 16/group) for pretreatment with either ghrelin (10 nmol/kg; Shino-test, Sagamihara, Japan;N= 16)或盐水(N= 16)经皮下注射。30min后，每组随机选取8只大鼠建立ALI大鼠模型，其中LPS (5 mg/kg, O111:B4;Sigma, St. Louis, MO, USA)气管内灌注诱导ALI，其余16只非ALI大鼠气管内灌注生理盐水。

２.２.平均肺动脉压(mPAP)测量

腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，固定四肢，在颈部作纵向皮肤切口，分离肌肉。在胸骨切口左侧切断第二、第三肋前胸肋骨，打开心包显露肺动脉干。在肺动脉干下和沿肺动脉干放置一根丝线和一根18g聚乙烯导管。在LPS刺激后4小时进行右心导管置管，测量mPAP和右心室收缩压(RVSP)，如前所述[16.］．大鼠经戊巴比妥注射(200 mg/kg)处死，获得mPAP和RVSP测量值，立即用于分析其他参数。

２.３.增殖细胞核抗原(PCNA)和α -平滑肌肌动蛋白(αsma)

在4℃下在4％多聚甲醛中固定过夜，通过链霉抗生物素蛋白 - 生物素 - 过氧化物酶复合方法染色大鼠肺的右上叶的石蜡嵌入部分，以检测PCNA和α-SMC表达(抗体购自美国Sigma)，以确定ghrelin对肺血管重构的影响。免疫染色肺切片(每组6个横截面)在配有数码相机系统(日本尼康DS-Fi2)的显微镜下以200倍放大进行可视化和成像。细胞(PCNA⁺每个染色肺切片从三个视野采集图像，每个视野至少250个细胞，计算细胞核和内膜和中膜的细胞核总数。PCNA的细胞核⁺细胞染色呈棕色，PCNA染色呈棕色^-细胞出现蓝色。图像分析使用ImageJ软件(NIH, USA)。PCNA的比例⁺细胞的提取公式:% PCNA⁺cells = PCNA数目⁺核数/核总数。内膜-中膜壁厚度50-100µ每组6只大鼠肺内m直径小动脉的测定αsmc公式:壁厚% =(内中膜厚度/外径)× 100。

２.４.支气管肺泡灌洗液(BALF)促炎细胞因子水平及细胞总数的测定

右主支气管结扎后，用5 mL新鲜生理盐水4℃彻底冲洗左肺3次。然后回收约85-90%的BALF，并在1,500 rpm和4°C条件下离心10分钟。上清立即快速冷冻，在−80°C保存，用于后续测量促炎细胞因子肿瘤坏死因子的水平α(肿瘤坏死因子-α)和白细胞介素-6 (IL-6)。将细胞微球涂于玻片上，在光学显微镜下进行Giemsa染色，并使用血细胞计计数BALF总细胞数。

2．5．计算湿-干(W/D)肺重量比

为了计算W / D肺重量比，右下肺部用磷酸盐缓冲的盐度短暂冲洗，并立即称重以获得湿重量，并在80℃下在烘箱中干燥后再次称重48小时以获得干燥重量。

2.6。髓过氧化物酶(MPO)活性测定

用十六烷基三甲基溴化铵(HTAB)缓冲液(0.5% HTAB, 50 mM磷酸缓冲液，pH 6.0)冷冻肺标本匀浆测定MPO活性，测定H的氧化程度₂O.₂端依赖O.-dihydroindene盐酸。冷冻肺标本在进行任何实验操作前都要称重。每个样品超声，40000 g, 4°C离心15分钟，上清液中MPO活性在460 nm下使用检测试剂盒(中国南京建成生物技术有限公司)测定。计算每个样本每克肺重量的MPO活性。

2.7。统计分析

采用SPSS v17.0软件(SPSS Inc.， Chicago, IL, USA)进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差表示。四组间参数比较采用单因素方差分析，采用Newman-Keuls检验。一个值<0.05被认为是统计学意义的。

3.结果

３.１.Ghrelin预处理可部分降低lps诱导ALI大鼠mPAP和RVSP

与非ALI组(生理盐水组和生理盐水+ ghrelin组)相比，4 h后生理盐水+ ALI组mPAP和RVSP升高。此外，ghrelin预处理可部分降低mPAP和RVSP(图)1; ）.

３．２．Ghrelin减少PCNA的数量⁺肺动脉的细胞

接下来，我们通过PCNA和肺血管检测ghrelin对细胞增殖和肺血管的影响α分别sma表达。PCNA⁺生理盐水组和生理盐水+ ghrelin组血管外膜、内膜和内膜中偶见细胞(棕色)。在生理盐水+ ALI组，PCNA数量高⁺细胞可见于血管外膜和新生内膜，特别是在管腔表面(图)2(一个)），表明肺动脉中平滑肌细胞的增殖。更少且偶尔可见的PCNA⁺与ALI组比较，ghrelin + ALI组血管外膜、内膜、内膜和新生内膜的细胞增加。四组间肺内膜-中膜动脉壁厚度无显著差异(图)2 (b)）.

３．3.Ghrelin降低ALI大鼠BALF中促炎细胞因子水平和总细胞数

更高的肿瘤坏死因子-α和IL-6水平(图3(一个)和3 (b); ）和更高的Balf总细胞计数（图3 (c)和3 (d); ）ALI组与生理盐水组比较。值得注意的是，ghrelin预处理显著降低了TNF-的水平α和il - 6(数据3(一个)和3 (b); ）以及BALF总细胞数(图3 (c)和3 (d); ）在ALI大鼠中。

3．4．Ghrelin降低ALI大鼠肺水肿和MPO活性

与生理盐水组相比，ALI组肺的W/D比值显著升高(图)4(一); ），但在ghrelin + ALI组中这一指标降低，提示ghrelin可能抑制了lps诱导的肺水肿。由于中性粒细胞颗粒中MPO的分泌是炎症反应的一部分，MPO活性是一个公认的炎症生物标志物。ALI组的MPO活性明显高于盐水组(图)4 (b); ），建议中性粒细胞浸润进入肺部牙科或肺泡空间。Ghrelin预处理抑制了MPO活动（图4 (b); ），提示在lps诱导的ALI大鼠肺实质或肺泡腔中，ghrelin可阻止中性粒细胞浸润。

4.讨论

PVD已被证明是ALI/ARDS死亡率的独立预测因子[5.］．据报道ALI/ARDS中炎症与PVD相关[7.那8.]，本研究旨在评价抗炎药ghrelin对ALI患者PVD的缓解作用。采用气管内灌注LPS而不是静脉注射诱导大鼠ALI，以避免内毒素血症引起的肺损伤，并更快地诱导ALI。我们观察到肺水肿，肺泡结构破坏，炎症细胞浸润明显，提示气管内灌注LPS成功诱导大鼠ALI。此外，mPAP和RVSP升高，PCNA增殖也支持这些发现⁺lps诱导ALI模型大鼠平滑肌细胞、促炎细胞因子水平、BALF总细胞数、W/D肺比值和MPO活性。值得注意的是，ghrelin预处理降低了上述所有PVD指标，从而证实了ALI中PVD炎症的参与。更重要的是，结果显示了ghrelin对PVD的保护作用，并主张其作为临床治疗ALI的治疗药物的潜力。

暴露于LPS刺激细胞因子TNF-的分泌α和IL-6，不仅是结果不良的生物标志物，而且是阿里PVD的致病介质[17.］．实际上，已显示大鼠中重组IL-6蛋白的输注诱导肺动脉患者肺动脉血管重塑以及平滑肌细胞增殖[17.］．同样,肿瘤坏死因子-α已经证明 - 促进内皮细胞的凋亡和肺动脉高血压动物模型中平滑肌细胞的凋亡以及诱导疾病发病机制的凋亡。与先前的肺动脉高压报告和IL-6水平呈中吸入的LPS诱导的ARDS大鼠模型中的升高的IL-6水平一致，有助于PVD [18.[我们还注意到盐水+阿里组的类似发现，从而证实炎症在阿里发病机制中的作用。此外，Ghrelin的Balf中促炎细胞因子水平的减少证实了炎症反应在阿里的作用。

在本研究中，我们通过评估肺W/D比值来评估肺水肿的程度，肺水肿是全身和局部炎症的典型症状。在ghrelin + ALI组中，W/D肺比值的降低表明肺水肿和充血明显减少。这说明ghrelin能有效降低肺血管通透性，促进肺水肿的清除，证实了ghrelin对lps诱导的ALI的保护作用。这一结果与ghrelin + ALI组MPO活性下降的观察结果一致，表明ghrelin抑制了炎症细胞的隔离和向肺组织迁移。综上所述，这些结果表明，ghrelin可以保护lps诱导的ALI大鼠对抗PVD。

总之，该研究表明，通过减少肺组织中的炎性细胞浸润和促炎细胞因子分泌，Ghrelin预处理可以抑制阿里大鼠的肺炎症。我们的研究结果证实了炎症在阿里PVD发病机制中的重要性，并表明Ghrelin作为替代辅助治疗剂治疗LPS相关的PVD的潜力。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包括在文章中。

伦理批准

本研究方案经本机构动物研究伦理审查委员会批准，实验按照动物福利准则进行。

的利益冲突

作者称没有利益冲突。

致谢

本研究由武汉市新冠肺炎应急研究项目(EX20B05)资助。

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