桡动脉-支气管内超声引导下经支气管肺活检联合下一代基因组测序对周围型肺部感染性病变的诊断价值

抽象

背景。宏基因组新一代测序(mNGS)是一种新技术，允许无偏检测病原体。然而，关于肺活检组织mNGS诊断肺部感染的报道较少。此外，径向支气管内超声(R-EBUS)广泛用于检测周围型肺部病变(PPLs)，但很少用于诊断周围型肺部感染。目的. 本研究旨在探讨R-EBUS引导下经支气管肺活检（TBLB）与mNGS联合应用对周围型肺部感染性病变的诊断价值。方法。从2018年7月至2019年4月，天津医科大学总医院121例确诊为PPLS和肺部感染在此前瞻性随机对照研究对象。一旦病变位于，或者TBLB或R-EBUS引导-TBLB在随机选择的患者中进行，并MNGS涂敷了用于在肺活检组织病原体检测。MNGS的结果TBLB基和R-EBUS引导TBLB组之间进行比较。此外，从61名患者接受支气管镜外周肺感染性检测的临床特征和EBUS图像进行分析，并与MNGS的结果进行比较。结果. R-EBUS引导下TBLB组mNGS阳性率为78.7%（48/61），明显高于TBLB组（60.0%（36/60）。R-EBUS探头位置的不同和周围肺部感染病灶的影像学特征影响mNGS的阳性率。病灶内R-EBUS采集的组织比病灶旁采集的组织阳性率高( ,优势比17.742；95%置信区间，从1.325到237.645）。超声图像特征的消声区和亮度区与mNGS的低阳性率相关（分别为， ,优势比17.878;95%置信区间，从1.595到200.399; ,优势比16.745;95%置信区间，从1.106到253.479)。结论. EBUS引导下TBLB是一种安全有效的诊断周围型肺部感染性病变的方法。R-EBUS有助于支气管镜准确插入病灶，提高了mNGS分析在病原学检测中的阳性率。病灶内R-EBUS探头位置对mNGS分析有较高的阳性率。尽管如此，超声图像上存在消声区和亮度区与mNGS阳性率低相关。

1.简介

肺部感染是全世界死亡和发病的主要原因[1]. 然而，由于呼吸道微生物群的复杂性，病原菌的准确诊断具有挑战性。数百种病原体与肺部感染有关，包括细菌、病毒和真菌[2- - - - - -4]. 耗时的病原鉴定方法不仅增加了肺部感染的发病率和死亡率，而且滥用广谱抗生素也阻碍了抗菌药物的管理。此外，抗生素治疗的引入降低了常规病原学检测方法的敏感性和特异性。快速、准确地检测和鉴定肺部感染病原菌是及时进行抗菌治疗的关键。

通过MNGS病原体识别基于核酸从临床样品中分离，包括但不限于组织，体液，拭子，和支气管肺泡灌洗液，粪便或多种微生物脓肿[无偏的检测5]。mNGS在传染病诊断中的应用包括谱系追踪、耐药基因检测和微生物组研究[6- - - - - -10个]. 然而，在肺部感染的治疗中应用于肺活检组织的mNGS的报道仍然很少。

由于在获取组织病理学标本方面的局限性，PPLs的病因学检查与中央肺病变相比具有挑战性。传统的支气管镜检查难以准确定位周围肺的病灶。ct引导下经皮活组织检查存在较高的并发症风险，包括气胸或咯血[11个,德意志北方银行]. 一旦情况复杂，继续穿刺肺活检就很不一样，甚至是不可能的。EBUS引导下TBLB是一种安全、稳定的治疗方法，广泛应用于周围型肺癌的治疗[13个- - - - - -19个]. R-EBUS引导下TBLB在周围型肺部感染性病变的诊断中应用较少。本研究旨在探讨R-EBUS引导下TBLB和mNGS联合检测对周围型肺部感染性病变的诊断价值。

2。方法和主题

2.1。主题

2018年7月至2019年4月在天津医科大学总医院进行了支气管镜手术的前瞻性随机试验。在此期间，对151例经胸部螺旋CT怀疑为周围性肺部感染的患者进行了支气管镜检查。在这些患者中，30名患者因肺癌的组织病理学诊断而被排除在研究之外，121名患者最终被诊断为肺部感染。其中61例经R-EBUS引导TBLB诊断，60例经TBLB诊断。用mNGS对肺活检组织进行病原学鉴定。当肺病变位于节段支气管以外时被认为是PPL[18岁]. 外周肺病变的大小由CT图像上肺轴窗上病变的平均直径来测量。记录每个PPL与肋胸膜和内脏胸膜的位置和距离。根据基于CT衰减的视觉评估方法和对先前研究的修改，病变被分为结节或空洞、汇合/斑片状实变和磨玻璃样混浊（GGO）[20.]. 患者入组标准如下：（I）经CT检查发现的PPLs为异常生长，诊断为感染性疾病；（II）年龄≥18岁。排除标准如下：（I）年龄<18岁；（II）有肺部手术史的患者；和（III）有严重结构性肺病、心脑血管疾病以及其他不能接受TBLB的原因的患者。周围性肺部感染的最终诊断应结合螺旋CT、常规实验室检查、组织病理学和mNGS结果。经抗菌治疗后，患者的临床症状得到缓解或缓解。出院后随访，无复发。胸部螺旋CT显示肺部病变改善或吸收。

2.2条。仪器

使用电子视频支气管镜（Olympus BF-F260或Olympus BF-P-260F，Olympus，东京，日本）、超声主机（MAJ-935，Olympus，东京，日本）、直径1.4 mm的R-EBUS（UM-S20-17S，Olympus，东京，日本）和活检钳（JHY-FB-18-105-O-O-A1，常州久宏）进行R-EBUS引导的TBLB或TBLB。

3.过程

3.1条。TBLB和R-EBUS引导的TBLB程序

TBLB是根据由中国医师协会呼吸病杂志诊断支气管灵活应用指南（2008年版）进行社会[21]。支气管镜是通过局部麻醉利多卡因和肌肉注射杜冷丁胸科医生的监督下进行。没有意识镇静，在整个研究应用。脉搏血氧测定法来监测氧合过程中，每当需要维持氧饱和度> 90％的氧气经由鼻叉给药。

通过胸部CT检查确定病变部位。重复活检程序，直到肺组织溢出活检钳表面。在TBLB组，操作人员尽可能将支气管镜移到可疑支气管，直到遇到阻力，然后用镊子活检。在R-EBUS引导的TBLB组中，EBUS探针通过支气管镜的工作通道插入可疑支气管，直到遇到阻力才能检测到PPLs。一旦病变定位，通过支气管镜的工作通道进行R-EBUS，直到遇到阻力为止。然后，在R-EBUS引导下进行TBLB之前，将EBUS探针插入可疑支气管以检测PPLs。所有病理结果均由两位经验丰富的病理医师进行检查。为了确定是否发生医源性气胸，在手术后4 h获得初始胸片，并在第二天进行后续胸片检查。

3.2条。标本采集与处理

肺活检在2小时内分别送往临床微生物学和组织病理学实验室进行分析。剩余或剩余的组织匀浆储存在-70℃下用于mNGS。

肺活检按照标准程序切成小块。将含有0.7 mL裂解缓冲液的1.5 mL微离心管、组织样品和1°g 0.5 mm玻璃珠固定在涡流混合器上的水平平台上，并以2800–3200转/分的速度剧烈搅拌30 min。将0.3 mL样品分离到一个新的1.5 mL微离心管中，使用天安微离心管提取DNADNA试剂盒（DP316，天根生物科技）根据制造商的建议。RNA提取采用与上述相同的组织收集程序，提取试剂盒QIAamp病毒RNA小试剂盒（52904#，QIAGEN）用于提取RNA，然后通过反转录从RNA模板中生成互补DNA（cDNA）。

通过DNA片段化、末端修复、接头连接和PCR扩增构建DNA文库。采用安捷伦2100生物分析仪(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)对DNA文库进行质量控制。高质素及符合资格的图书馆由BGISEQ-50平台进行排序[22]。每个样本至少得到20M reads。高质量的测序数据是通过去除低质量和短(长度<35 bp) reads得到的，然后使用Burrows-Wheeler比对，计算减去映射到人类参考基因组(hg19)的人类宿主序列[23]。通过去除低复杂度的读数据，同时比对由病毒、细菌、真菌和寄生虫组成的四个微生物基因组数据库，对剩下的数据进行分类。分类参考资料库由NCBI (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/). RefSeq包含4061个病毒分类群全基因组序列，2473个细菌基因组或支架，199个与人类感染相关的真菌，135个与人类疾病相关的寄生虫。结合对照组和校准组的结果，数据分析算法被用于排除与感染无关的微生物。报告了具有临床意义的微生物，并对在属/种水平上检测到的微生物进行了测序。

3.3条。肺活检组织中mNGS结果的评价

基于mngs的方法的结果由2名与本研究无关的独立临床专家进行评估。

3.4条。统计分析

使用SPSS（第17.0版，SPSS公司，芝加哥，伊利诺伊州）进行统计分析。数据表示为平均值（标准差）。成对的t-试验用来比较自变量的均值。分类变量采用Pearson卡方检验或Fisher精确检验。多元logistic回归检验进一步证实了自变量分析的结果。值 <0.05 was considered as statistically significant.

4.结果

4.1条。研究人群

在前瞻性随机研究中，共有121例肺部感染性病变患者入选，其中TBLB组60例，R-EBUS引导下TBLB组61例。它们的基线特性如表所示1。该TBLB基和R-EBUS引导TBLB组之间没有观察到基线特征没有显著差异， 。

4.2条。mNGS诊断率

病灶最终诊断见表2。TBLB组细菌感染30例(50%)，病毒感染12例(20%)，真菌感染18例(30%)，非典型病原体感染6例(10%)，结核分枝杆菌(MTBC)感染9例(15%)。在r - ebus引导的TBLB组中，细菌感染33例(54.1%)，病毒感染11例(18%)，真菌感染21例(34.4%)，非典型病原体感染7例(11.5%)，MTBC感染10例(16.4%)。在r - ebus引导的TBLB组中，61例患者中有48例(78.7%)被mNGS成功识别，而在TBLB组中，60例患者中有36例(60.0%)被mNGS成功识别。R-EBUS-TBLB组与TBLB组的阳性率有显著性差异(78.7%/60.0%， )。

4.3。免疫缺陷和非免疫缺陷患者中最常见的mNGS病原体

121名患者中，半数以上患有血液系统恶性肿瘤，其中70名免疫功能低下，51名免疫功能正常。免疫功能低下的个体比免疫功能正常的个体更容易受到肺部感染。由mNGS检测到的最常见的病原体如表所示3.。

4.4条。R-EBUS组病变特征与mNGS诊断率的关系

在R-EBUS组中，病灶区域> 3cm的直径与单变量分析的显着更好的诊断率相关(表2)2, ,比值比6.080;95％置信区间（CI），从1.630至22.685）。但是，结合R-EBUS探针位置和EBUS图像特征进行多元分析后，失去了显著性(表2)2, ,优势比8.757;95%置信区间(CI)，从0.858到89.417。病灶与胸壁的距离与mNGS的诊断率无关(表2)2, )。病灶内探针的存在与桡动脉EBUS的诊断率显著高于邻近病灶时的诊断率（表2, ,优势比17.742;95%置信区间(CI)，从1.325到237.645。

支气管结构周围正常肺实质的EBUS图像有斑片状和大量高回声颗粒，通常称为暴风雪样[24]. 均匀内部回声图像的颗粒大小、回声和分布一致，回声始终略低于正常肺实质[24]. 内部回声均匀的主要病变为肺炎，以渗出液充盈的肺泡为特征[25]（图1). 非均匀内部回波在颗粒分布上呈镶嵌状，颗粒大小不一。图像特征显示无回声区域与组织病理学坏死区域一致[26]（图2)。看着发光的区域如融合不同大小和形状的巨大闪闪发光的点的，这可能是支气管破坏的结果，冷凝的空气坏死区域内，或钙化（图3.)。非发光区域可能是非肿瘤[25]. GGO病变的EBUS图像包括纯GGO和部分实GGO，称之为暴雪或混合暴雪往往是恶性的。单纯型通常表现为正常肺在EBUS上白色声影的强度和半径明显增加。在混合暴风雪标志中（图4），病变的内部回声证明与几个回声点，线性弧和血管漫异质其被不规则地分布或与暴风雪符号组合[27,28]。

在我们的研究中，mNGS成功地检测到病原体，主要是在内部回声均匀的病灶（48例中35例，72.9%）和4个内部回声均匀的病灶（13例中4例，30.8%）在mNGS分析中呈阴性。mNGS阴性者中半数以上表现为无回声区（13例中8例，占61.5%），而无回声区mNGS阳性者仅5例，其中肺结核1例，肺脓肿1例。其中8例累及亮区mNGS阳性（48例中8例，占16.7%），8例mNGS阴性（13例中8例，占38.5%）。通过单变量分析，均匀的内部回声与肺活检组织中mNGS的更好诊断率相关（表2, ;优势比6.058;95%置信区间(CI)， 1.588 ~ 23.107。但是，结合R-EBUS探针位置和EBUS图像特征进行多元分析后，失去了显著性(表2)2, ,优势比8.598;95%置信区间(CI)，从0.903到81.885。超声图像特征的消声区和亮区与mNGS诊断率较低相关(表2)2分别 ,优势比17.878；95%可信区间（CI），1.595～200.399； ,优势比16.745;95％置信区间（CI），从1.106至253.479）。

4.5条。难题

与TBLB组相关的并发症4例（6.6%），其中轻度出血2例（3.3%），气胸2例（3.3%）。在R-EBUS引导下TBLB组，1例（1.6%）出现轻度出血，1例（1.6%）出现气胸。局部应用去甲肾上腺素和静脉滴注加压素后出血明显改善。气胸在没有胸腔引流的情况下自行消失。术后无严重出血、空气栓塞、呼吸衰竭、肺部感染。没有过早终止手术，也没有一名患者因手术死亡。TBLB组与R-EBUS引导下的TBLB组在并发症发生率方面无显著差异（表1, )。

5个。讨论

缺乏准确的病因诊断仍然是肺部感染的高发病率和死亡率的主要原因，这增加了医疗费用。mNGS是一种无偏且快速的技术，能够在临床样本中同时检测广泛的致病性细菌、病毒、真菌和寄生虫。R-EBUS是一种安全且有价值的技术，已被证明可增加PPLs的诊断率[29]. 目前临床应用的R-EBUS主要是在活检前定位周围性肺部病变。mNGS在肺部感染诊断中的应用尚不多见，而联合外周超声在肺部感染诊断中的应用尚未见报道[30.- - - - - -32]. Li等人。应用mNGS对肺穿刺活检组织进行病原微生物检测，结果显示：mNGS诊断率为75%（15/20）[33]。多项研究表明EBUS有助于准确定位PPL区域，提高经支气管活检(TBB)的诊断准确性[25,34- - - - - -36]。在本研究中，mNGS成功鉴定了R-EBUS-TBLB组61例患者中的48例病原体，以及TBLB组60例患者中的37例病原体。两组诊断符合率有显著性差异(78.7%/60.0%; )。先前的研究报道，在PPL中使用带引导鞘的EBUS或EBUS引导活检的诊断率为53–75.9%[13个- - - - - -18岁,37]。我们的研究比以前的研究产生了更好的诊断结果。结果提示R-EBUS可用于确认支气管镜准确插入病灶，提高mNGS在病原菌检测中的阳性率。

本研究表明，用TBLB进行mNGS检测病原体的诊断率与周围感染病灶的大小及其与胸壁的距离无关，与以往的研究结果不一致[13个- - - - - -18岁,33,36]。原因可能是我们没有足够的样本量。在我们的研究中，病灶内探针的存在与R-EBUS的诊断率显著高于在病灶附近发现探针时的诊断率，这与之前的研究一致[13个- - - - - -18岁,33,36]。这些结果表明，当探头在病变的中心，有一个透渗出和支气管浸润由感染时相比，它邻近于所述病变。

我们的研究表明，周围型肺部感染性病变的超声图像特征与mNGS的诊断率有关。超声图像特征的无回声区和亮区与肺活检组织mNGS诊断率差有关。有无回声区和发光区的病变可能由坏死引起，其中气道炎症较轻，病原体负荷较低，病变倾向于慢性。因此，TBLB后mNGS的诊断率较低。

我们的研究有几个局限性。首先，由于在招募受试者方面存在困难，所以没有足够的样本量，所以是在一个单一的研究所进行的。其次，大多数患者患有血液系统恶性肿瘤，潜在的选择偏差可能会影响结果。第三，我们没有使用透视、电磁导航支气管镜，也没有使用R-EBUS的虚拟支气管镜，这些都可以进一步提高放射状EBUS引导活检的诊断准确性。考虑到医疗费用，入选患者没有同时接受支气管肺泡灌洗液或血清学的mNGS分析。肺部感染患者的肺组织mNGS是否优于支气管肺泡灌洗液或血清学尚需进一步研究。此外，需要设计多中心试验来验证本研究的结果。

6。结论

肺炎是一种常见的感染，往往缺乏病原诊断。快速而准确的病原体检测和病原体的识别是准确的抗生素治疗是至关重要的。许多患者对抗生素治疗，这限制了文化为基础的测试产量。因此，我们希望尽早使用MNGS测试，以确定在日常临床实践中的病原体。对于PPLS，我们可以用R-EBUS结合。考虑MNGS测试成本高，我们建议早期使用MNGS在经验性治疗和重症病例的失败案例的测试。

尽管存在一定的局限性，但本研究首先证明了用mNGS诊断TBLB周围型肺部感染性病变的病原学意义，并证明了R-EBUS引导下TBLB有助于确定支气管镜是否准确插入PPLs，从而提高mNGS的诊断率。病灶内R-EBUS探头位置与肺活检组织mNGS诊断率较高相关。无回声区和亮区周围型肺部病变的EBUS表现与mNGS的诊断率相关。

数据可用性

所有数据都是完全可用的，没有任何限制。

伦理审批

所有受试者均签署知情同意书。本研究经天津医科大学总医院伦理委员会批准(参考IRB2019-133-01)。

泄露

作者声明与本文的研究、作者和/或发表无关的潜在利益冲突。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者要感谢所有参与这项研究的病人。这项工作得到了中国国家自然科学基金（编号81970083、81270144、81570084、30800507）和国家重点技术研究开发计划（2015BAI12B00-J.F.）的资助。

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