在活的有机体内Ceftolozane / Tazobactam阻力铜绿假单胞菌引起AmpC和Non-AmpC-Mediated通路

文摘

两双ceftolozane / tazobactam易感/耐药铜绿假单胞菌接触后分离得到2例吗β-lactams。ceftolozane / tazobactam抗性的遗传基础是评估,和β-lactam-resistant机制被表型分析评估。全基因组测序鉴定突变AmpC包括突变(V213A)和删除7Ω-loop氨基酸(P210-G216)。表型分析显示,与AmpC ceftolozane / tazobactam电阻应变_V213A变体与增加β内酰胺酶水解活动。另一方面,删除7氨基酸的Ω-loop AmpC没有显示增强β内酰胺酶的活动。ceftolozane / tazobactam阻力铜绿假单胞菌与AmpC变化联系在一起;然而,明显的损失β内酰胺酶活动AmpC∆7表明non-AmpC机制可以在阻力发挥重要作用β内酰胺/β内酰胺酶抑制剂的组合。

1。介绍

耐多药(MDR)的崛起铜绿假单胞菌威胁可用抗生素的使用,包括碳青霉烯(1,2]。新头孢菌素/β内酰胺酶抑制剂组合ceftolozane / tazobactam (C / T)提供了一个可行的替代治疗由于MDR的感染铜绿假单胞菌(1,2]。事实上,许多报道已经证实的成功应对这些生物体(C / T3,4]。不幸的是,抵抗这种抗生素的有效性(C / T妥协3,4]。先前的报道表明,C / T耐药性的机制与Ambler类C的变化相关联β内酰胺酶AmpC [4,5]。

在这工作,2患者C / T阻力在治疗MDR的描述和他们的隔离铜绿假单胞菌之前(敏感)和之后(耐)治疗β-lactams被恢复。我们研究了C / T抗性的遗传基础的全基因组测序,和AmpC的贡献β内酰胺酶抗性表型是评估活动。

2。案例展示

案例1。21岁的非洲裔美国女性历史的自身免疫性溶血性贫血(口头接受强的松5毫克每天)出现急性血管坏死的股骨头后下降。菌血症病人有幼童腹壁薄弱,包括铜绿假单胞菌,需要延长疗程的抗生素头孢他啶(CAZ),头孢吡肟,meropenem和阿米卡星。在她住院期间,病人被发现bacteremic铜绿假单胞菌(容易aztreonam CAZ、C / T, ceftazidime-avibactam (CZA)和多粘菌素B(隔离PA2312))。Aztreonam 1 g静脉注射(IV)每8小时(h)处置开始成功的间隙后五天,和病人转向CAZ 1 g h IV处置一个额外的13天。四天CAZ停止后,由于她开发了一个周期性的血液感染铜绿假单胞菌。复发性隔离(PA2428)是对所有药物,包括氨基糖甙类、C / T, CZA,除了多粘菌素B(表1)。病人开始第四粘菌素3毫克/公斤12 h + CAZ 1 g h IV处置。四天后,治疗转换到第四多粘菌素B 15000单位/公斤12 h(25000单位/公斤负荷剂量之后)+ C / T 1.5 g h。尽管记录了微生物学的间隙,病人治疗7天后过期。

例2。一个57岁的人与非缺血型心肌病的历史,需要左心室辅助装置(使用),提出了使用的排水退出网站。病人有反复感染,包括使用退出网站大肠杆菌,不动杆菌spp。肠球菌,耐多药铜绿假单胞菌(容易C / T)。最后一集,铜绿假单胞菌HOU2365被隔离的退出网站,病人接受C / T入学前10周。住院期间,病人接受外科清创术的使用,和一个孤立的铜绿假单胞菌收集使用(HOU2366)。这个隔离被发现MDR,包括高级抗C / T和CZA(表1)。该患者使用多粘菌素B 15000单位/公斤四12 h(25000单位/公斤负荷剂量之后)+ meropenem 1 g抓起h(肾功能调整)。病人保持在这种组合直到他原位心脏移植。

3所示。材料和方法

3.1。敏感性测试

最低抑制浓度(麦克风)是由汤采用CLSI[推荐的6),除了C / T CAZ CZA麦克风,由浓度梯度法在Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯)推荐的制造商。

3.2。全基因组分析

Paired-end序列读取生成Illumina公司MiSeq编曲。软件用于组装、可视化数据的注释,基因组学和SNP调用包括CLC工作台V.8.5.1,拉斯特V.2.0, MLST V.1.8, ResFinder V.2.1, BWA, SAMtools, GATK VCF工具和SnpEff。

3.3。由邻氯青霉素检测AmpC生产过剩(CLOX)

CAZ麦克风的铜绿假单胞菌由浓度梯度法在尼古拉斯单独或与CLOX 1000µg / ml和孵化一夜之间在37°C。≥2倍的差异仅在CAZ麦克风和CAZ测试结合CLOX视为AmpC生产过剩是积极的(如前所述7]。

3.4。"生产测试

CarbaNP方法进行了定义和解释的临床和实验室标准协会(CLSI) [6]。

3.5。水解活动Nitrocefin退化

原油细胞溶解产物的酶活性是通过使用一个光度法测定nitrocefin退化如前所述[8]。原油细胞溶解产物得到总蛋白质含量和规范化。Nitrocefin(0.337毫米)作为底物,在486 nm和吸光度的变化都被记录下来的β内酰胺环是退化。PA27853和PAVIM2用作正面和负面的控制,分别。

4所示。结果与讨论

表1显示了MDR的药敏资料2套铜绿假单胞菌收集(PA2312和HOU2365)之前和之后(PA2428和HOU2366)β内酰胺疗法。所有抗衍生品显示阻力不仅C / T CZA。这一发现表明,这些组合之间可能出现抗力移转和C / T耐药性的机制也可能影响avibactam的活动。重要的是,C / T-resistant铜绿假单胞菌PA2428出现独立的C / T曝光。

C / T-resistant隔离被发现是相同的C / T-susceptible同行,pulsed-field凝胶电泳(数据没有显示)。因此,巴勒斯坦权力机构和侯铜绿假单胞菌进一步的特点是全基因组测序。PA2312和PA2428属于序列类型(ST) 111年HOU2365 HOU2366 ST308。的基因编码序列β-lactamases在所有分离株的基因组研究为了确定抗性的遗传基础β内酰胺/β内酰胺酶抑制剂的组合。PA2312和PA2428被发现bla_AmpC,bla_OXA-50,bla_OXA-9,bla_CARB-2,而HOU2365和HOU2366存在bla_AmpC和bla_OXA-50。比较基因组测序显示所有C / T-resistant隔离表现出突变染色体ampC或其相关的基因,而非其他bla基因。PA2428庇护一个Val213⟶阿拉巴马州(V213A)替换的Ω-loop AmpC相比,C / T-susceptible PA2312。HOU2366存在删除7氨基酸(P210-G216)(Δ7)Ω-loop AmpC。附加相关的变化显示在表2。值得注意的是,变化Ω-loop之前妥协底物结合位点,以及这些变化被认为影响催化效率和频谱AmpC的底物特异性β-lactams,特别是与ceftolozane等笨重的侧链(9,10]。E247K替换和删除19个氨基酸(G229-E247),包括在HOU2366Δ7存在,最近证明大大提高C / T和CZA麦克风(5]。V213A突变(PA2428)被描述与CZA阻力铜绿假单胞菌和Δ7 (HOU2366)也发现了在C / T-resistant临床分离株(4,11,12]。然而,他们的特定的角色在C / T阻力尚未阐明4,11,12]。

AmpC变化是与C / T阻力在临床分离株铜绿假单胞菌,贡献AmpC C / T的发展阻力计算。铜绿假单胞菌亲代菌株PA2312容易受到CAZ有无CLOX,表明缺乏AmpC生产过剩(7]。相反,增加CLOX减少CAZ麦克风的C / T-resistant PA2428从≥256µ24 g / mlµg / ml,符合AmpC酶的生产过剩。值得注意的是,AmpC生产过剩铜绿假单胞菌已被证明是与AmpD变化相关,存在于PA2428(表吗2),火山泥等人报道的增加相对mRNA的表达ampC由于V10G突变AmpD [13]。在侯铜绿假单胞菌集,AmpCβ内酰胺酶生产过剩是HOU2365观察。有趣的是,C / T-resistant导数HOU2366 AmpC生产过剩的没有任何证据,支持不变CAZ麦克风在CLOX的存在。全基因组分析发现没有相关的这双AmpD变化。然而,两菌株进行AmpD移码突变,导致截断和异常的蛋白质。因此,AmpCβ内酰胺酶生产过剩是一个潜在的机制在PA2428 C / T抵抗,但在HOU2366可能并非如此。‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

β内酰胺酶活动的原油溶解产物被分光光度测定评估使用nitrocefin作为衬底。如图1(一)PA2428能够水解nitrocefin∼25%的速度比C / T-susceptible母公司PA2312,支持的增加β内酰胺酶的活性AmpC作为一种重要的中介在这双C / T的抵抗。与此形成鲜明对比的是,没有观察到C /水解T-resistant导数HOU2366(图1(b))。相反,HOU2366水解概要文件显示类似的消极控制。在一起,这些结果表明,C / T的可能机制抵抗HOU2366不得与高有关β内酰胺酶水解。

最后,阐明这些菌株的耐碳青霉烯的机制,我们首先使用CarbaNP方法评估"这些菌株的生产(6]。如表所示1,所有铜绿假单胞菌"生产隔离是否定的。因为压抑或失活的外膜孔蛋白OprD耐碳青霉烯是一种常见的机制铜绿假单胞菌(14),我们审问oprD这些隔离使用全基因组数据的基因。所有隔离有移码突变由于删除(13-bp删除HOU2365 / HOU2366和1-bp删除PA2312 / PA2428),导致截断和异常的蛋白质。总的来说,这些结果支持缺乏碳青霉烯的易感性铜绿假单胞菌菌株,无论C / T的易感性。

5。结论

总之,本文提供的临床病例和应变特性描述C / T耐药性的出现暴露之后β-lactams。我们的数据表明,C / T的抵抗力铜绿假单胞菌可能出现由于生产过剩的突变AmpC但也可以独立于AmpC还是β内酰胺酶的活动。进一步评估机制的C / T的抵抗力铜绿假单胞菌迫切需要和替代疗法。

的利益冲突

VHT已收到从默克和爱力根无限制的研究经费。创新艺人经纪公司也收到了来自默克研究资助和爱力根。JMM已经收到了辉瑞的无限制的研究资助。

确认

我们感谢Morouge Alramadhan技术支持。我们也感谢大学厄尔博斯克对全基因组测序的金融支持。这项工作是由美国国立卫生研究院(赠款K08-AI113317 (TTT)和K24-AI121296 (CAA)),年科学项目的经济和旅游业发展,智利政府(JMM),和这场Nacional de Investigacion Cientifica y Tecnologica (CONICYT) FONDECYT 1171805,教育部,智利政府(JMM)。

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