青年2型糖尿病患者动脉硬化相关的高密度脂蛋白相关蛋白和亚种

抽象的

低密度脂蛋白（HDL）在具有2型糖尿病（T2D）中的高密度脂蛋白（HDL）的血浆水平与较高的脉搏波速度（PWV），动脉刚度的标志物相关。证据表明HDL蛋白或粒子亚种在T2D中改变，这些可能会推动这些关系。在这项工作中，我们开始揭示任何特定的蛋白质和亚种与来自蛋白质组学数据的T2D有关的动脉僵硬度。先前从瘦和T2D青少年获得血浆和PWV测量。将每个等离子体样品分离成18个级分并通过质谱评定。然后，我们应用了验证的基于网络的计算方法来揭示与PWV相关联的HDL亚级。在68个检测到的磷脂相关蛋白中，我们发现七种与PWV呈负相关，表明它们可能是动脉保护剂。相反，九个蛋白质显示出与PWV的阳性相关性，表明它们可能与动脉僵硬有关。有趣的是，我们的结果表明apoA-1和富含组氨酸的糖蛋白可以逆转其保护作用并在T2D的设置中变得拮抗。此外，我们揭示了两个动脉僵硬相关的HDL亚种，其中每一个含有多种PWV相关的蛋白质。 Correlation and disease association analyses suggest that these HDL subspecies might link T2D to its cardiovascular-related complications.

背景

2型糖尿病(T2D)是发生心血管疾病(CVD)的主要危险因素[1］．在患有T2D的人中升高CVD风险的重要贡献者是血脂血症[2]，其特征在于高浓度的小致密低密度脂蛋白（LDL）颗粒和血清甘油三酯和低浓度的高密度脂蛋白 - 胆固醇（HDL-C）。专注于改善T2D中的CVD风险的疗法主要集中在降低致动脉粥样硬化LDL颗粒上。不幸的是，即使具有最有效的LDL降低药物，CVD的显着残留发病率仍然存在于此人口中[3.］．这促使了许多旨在提高HDL-C的临床试验[4- - - - - -6］．然而，尽管这些药物成功地将HDL-C提高了>70%，但未能降低CVD风险[4，6，7］．最近的一个例外能够减少Satisin治疗的CVD，但效果相对谦虚[8］．

HDL目标疗法具有显着的潜在挑战，因为HDL比以前识别的更复杂。HDL的蛋白质组学研究已鉴定至少95个与HDL相关的不同蛋白质[9- - - - - -14.］．所有这些蛋白质不可能驻留在单个粒子上。相反，很可能是几种蛋白质在不同的颗粒上相互作用，可能执行特定的功能。一个很好的例子是锥虫裂解因子(TLF)，它包含载脂蛋白A- i (apoA-I)、触珠蛋白相关蛋白和apoli。该颗粒已被证明对原生动物有特殊的溶解活性锥虫属brucei通过溶酶体破坏[15.］．

最近的研究表明，HDL是具有独特蛋白质/脂质组合物的异质亚种，其在HDL-C测量中没有反映[13.，16.- - - - - -18.］．HDL亚种上的不同蛋白质可能具有物理相互作用或在没有物理相互作用的情况下在同一粒子上分开。这些不同的HDL亚种类为HDL的许多不同功能提供了合理的解释[19.］．虽然HDL最识别出介导反向胆固醇运输（RCT）的能力[20.，它从外周组织中清除过多的胆固醇和其他脂质，并将它们运输回肝脏进行分解代谢，HDL也被证明具有抗炎、抗氧化和抗凋亡的特性[21.- - - - - -25.］．

用凝胶过滤色谱法通过尺寸分离脂蛋白，我们以前发现具有2型糖尿病的青少年与肥胖和贫青少年相比大的HDL颗粒耗尽[17.］．这种降低与脉搏波速度（PWV）的增加，动脉刚度的早期测量结果呈逆转和显着相关。另外，我们检测到45个HDL相关的蛋白质，其中7个在T2D组中较低。这些结果表明，具有T2D的年轻成人中的HDL组合物的变化。然而，在我们之前的论文中，如果这些颗粒上的特异性蛋白质或蛋白质亚种可能与动脉僵硬有关，我们尚未检查。

在这里，我们试图确定是否有任何蛋白质或蛋白质组可能与PWV测量的动脉硬度有关。最近，我们开发了一种基于网络的计算方法，从复杂的蛋白质组数据推断HDL亚种[16.］．由多条证据支持，我们的方法揭示的蛋白质集群可能对应于HDL亚种。在这项工作中，我们综合患者临床数据，生物实验和生物信息学分析，揭示动脉僵硬相关的HDL蛋白和亚种，其可以用作与HDL-C相关的标记物，用于将T2D与CVD连接。

2.方法

2.1。研究队列

该分析包括5名17-27岁的T2D青少年和6名瘦肉对照组[17.］．桌子1列出了研究队列的临床特征。基于美国糖尿病关联标准诊断为T2D的受试者[26.］．瘦对照组BMI小于第85百分位(年龄≤20)或小于25(年龄> 20)。精益控制的参与者没有慢性疾病的证据。手压测量三次，并用水银血压计取平均。通过颈动脉到股动脉PWV测量动脉硬度，PWV是冠状动脉疾病和中风的危险因素[27］．对于每个受试者，使用SpyGmocor Scor-PVX系统收集PWV。测量每个参与者的三个PWV值并平均。

２.２.血浆分离与蛋白质组学

对于每个受试者，血液通过凝胶过滤层析按大小分成18个含脂馏分[13.］．通过这种方法，已经广泛描述了[13.，18.级分13-30含有可检测的磷脂，其对应于血浆脂蛋白VLDL，LDL和HDL。为了使凝胶过滤结果与传统的密度为中心定义相关，VLDL / LDL范围由于Apob的存在而定义为级分14-18。剩余的级分19-30定义为HDL范围，因为它们的直径与密度分离的HDL的测量一致，并且由于主要HDL蛋白，ApoA-1的丰度。使用合成的硅酸钙水合物，脂质去除剂（Supelco）分离脂质相关的蛋白质，并且通过质谱法（MS）确定每个级分中的相对丰度，如前所述[17.，28］．简而言之，使用氯仿和甲醇将样品齐平。接下来，用二硫醇和碘乙酰胺（Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo）处理样品以减少和碳酰胺甲基化蛋白质。最后，蛋白质被胰蛋白酶化并进行MS。Agilent 1100系列自动进样器/ HPLC用于绘制0.5 L进样至C18反相柱(GRACE;150 × 0.500 mm)，采用乙腈浓度梯度(5-30%在0.1%甲酸水溶液中)洗脱多肽，通过飞行时间QSTAR XL质谱(Applied Biosystems)。柱清洗采用5-85%乙腈梯度进行两次循环，每次循环持续15分钟。使用PeakView 2.1版本将原始数据文件转换为峰值列表(.mgf)文件。得到的质谱用Mascot(版本2.2.2，http://www.matrixscience.com)和X !串联(版本2001.01.01.1)搜索引擎针对UniProtKB/Swiss-Prot蛋白知识库(2011，包含540,958个条目)。搜索标准包括人类分类学和作为变量修改的氨基甲基化;多肽耐受性设置为±20ppm, MS/MS耐受性设置为±0.6 Da，最多允许3个遗漏的胰蛋白酶裂解。来自MS/MS的肽和蛋白鉴定使用Scaffold软件(版本3.3.1)进行验证，只有鉴定概率为>95%的肽和鉴定概率为>99%的蛋白被纳入分析。此外，在分析中，每种蛋白至少需要考虑2个肽段。肽识别错误发现率小于0.6%(计算独家光谱项的总和的百分比诱饵蛋白除以独家的和光谱项目标蛋白质)和蛋白质识别不到0.1%(计算数量的诱饵蛋白除以数量的目标蛋白质)。通过MS多肽计数半定量地鉴定组与组之间的差异。虽然肽谱计数因其反映蛋白质丰度的准确性而受到批评，但它不会影响我们在这项工作中的分析，因为我们只考虑了HDL蛋白的趋势或分布模式。 Spectral counts were used in no instance to reflect the absolute quantity of a protein. For data preprocessing, we filtered the MS detected proteins with the HDL Proteome Watch [29在所有精益和T2D参与者中。HDL蛋白质组观察是一个精心策划的数据库，记录了在多个MS研究中发现的与HDL相关的所有蛋白质。我们进一步去除了极低含量的蛋白质(所有受试者小于3个肽段)。

2.3。相关分析

为了研究任何单独的HDL蛋白与动脉僵硬有关，我们计算了级分19-31和PWV测量中的HDL蛋白的相对丰度之间的Pearson相关系数（PCC）。仅针对瘦和T2D组合数据集，仅限瘦数据集和T2D数据集计算PCC。我们意识到精益和T2D组合数据集的PCC可能主要由瘦群驱动（补充图1)．如果HDL的组合物确实在T2D中改变，则在相同的尺寸分数中可能具有诸如特异性图案的稀薄物质。因此，在这项工作中，我们分开了精益和T2D组并单独分析它们。具体地，对于每个等离子体HDL分数 ，我们计算了PWV和两组内所有受试者部分hdl相关蛋白肽计数之间的单变量PCC。我们采用了双尾- 最低，然后是Benjamini-Hochberg程序，以纠正多种比较，以测试PWV和蛋白质之间无相关性的零假设。

2.4。基于网络的HDL亚种的识别

为了推断HDL亚种，我们应用了之前为聚类聚合蛋白质而开发的基于网络的方法[16.］．这种方法基于假设具有在等离子体分馏期间具有类似洗脱模式的蛋白质非常可能驻留在同一HDL亚种上。我们用级分13-30分别为瘦和T2D组构建了一种用于瘦和T2D组的荧光蛋白 - 蛋白质相互作用（PPI）网络。通过单变量PCC测量的逐个相似性，并且选择强烈相关的链接来形成网络。网络中的蛋白质使用网络聚类方法群集，群集群集[30.］．将鉴定在级分19-30中的鉴定的蛋白质簇被推断为HDL亚种。

2.5。疾病协会分析

为了确定HDL亚种是否与特定疾病有关，我们使用独立分析仪进行疾病关联分析TOPPCLUSTER [31］．在疾病关联分析中，ToppCluster通过超几何分布检验计算了我们从多个公共人类疾病数据库中收集到的与人类疾病注释相关的HDL亚种的富集分数。在关联测试和被纠正的测试中应用了默认的Bonferroni校正 用来选择重要的相关疾病。

3.结果

3.1。HDL相关的蛋白质和动脉刚度

我们首先试图确定血浆HDL组分中单个HDL相关蛋白是否与动脉僵硬有关。在所有馏分中共鉴定出68个hdl相关蛋白。数据1和2分别在HDL尺寸级分中显示58个蛋白质的单变量PCC与PWV，分别。在两组中，我们确定了14个不同的HDL蛋白，与PWV具有显着相关性（ ， 后Benjamini-Hochberg过程)。在瘦肉组中，有7个蛋白与PWV呈较强的负相关(图)1)．这些包括经典载脂蛋白apoA-I、pcap - iii和apoJ，以及补体C1s亚组分、富含组氨酸的糖蛋白、α间胰蛋白酶抑制剂2和色素上皮衍生因子。在高密度脂蛋白的大小范围内检测到显著的蛋白质，在较大或较小的颗粒中没有显示出优先分布。与PWV呈负相关，提示这些蛋白可能是动脉粥样硬化保护颗粒的组成部分。

相比之下，在T2D组中，有9个蛋白与PWV呈正相关(图)2)．这些蛋白主要分布在含有较小高密度脂蛋白颗粒的26~29组分中。这些蛋白分别是-2- hs -糖蛋白、抗凝血酶- iii、apoA-I、gelsolin、hemopexin、富含组氨酸糖蛋白、激肽原-1、纤溶酶原和白蛋白。与PWV呈正相关，提示这些可能是致动脉粥样硬化的。值得注意的是,apoA-I和富含组氨酸糖蛋白在两组被发现,但负相关的采集精益集团和T2D组的正相关,这表明也许蛋白质分布(大小颗粒赶到)改变在疾病、proatherogenic呈现它。除上述显著的PWV相关蛋白外，大多数磷脂相关蛋白与PWV测量结果无明显相关性。

３．２．PWV相关蛋白的分布模式

基于相关性分析，我们想知道这些PWV相关蛋白是否与改变的HDL粒度有关。这促使我们研究了这些PWV相关蛋白质的分布。我们比较了瘦和T2D组之间所有显着相关蛋白质的分布模式（ )．使用一个- 最低，我们确定5/14 pWV相关的蛋白质在特定分数上具有显着的分布变化（ )．这些包括凝溶胶蛋白，挥霍-1，纤溶酶原，α-胰蛋白酶间抑制剂2（ITIH2）和颜料上皮衍生因子（PEDF）。我们注意到另外五种蛋白质（即，ApoA-1，α-2-Hs-糖蛋白，血红素，富含组氨酸 - 富含糖蛋白和白蛋白）表现出可观察模式的变化，但其值略大于0.05。数据3(一个)- - - - - -3 (c)显示pwv相关蛋白有明显的模式变化。纤溶酶原和PEDF在较小的高密度脂蛋白范围内发生改变，而ITIH2在较大的高密度脂蛋白范围内发生改变。数据3 (d)和3 (e)显示两个示例，其模式变化是可观察到的，但在某些分数下不显着。例如，与瘦对象相比，ApoA-1在分数21的T2D受试者中减少（图3 (d)）在级分23（图中，富含组氨酸富含糖蛋白的糖蛋白（图3 (e))．它们的变化都出现在较大的高密度脂蛋白中。在14种pwv相关蛋白中，只有4种蛋白的分布没有明显变化:抗凝血酶- iii、pha - iii、补体C1s亚组分和apoJ(图)3（f）)．模式分析表明，这些蛋白质所在的HDL亚种中只有一部分在年轻时T2D发生了改变。

３．3.高密度脂蛋白亚种和动脉硬度

接下来，我们试图确定可能与动脉僵硬相关的潜在HDL亚种。我们之前设计了一种计算方法来揭示假定的HDL亚种[16.］．在这项工作中，我们采用了相同的方法，分别为精益和T2D受试者构建了comigration PPI网络，如本节所述2．跨越级分13-30的68蛋白的光谱计数应用于网络施工。PEL和T2D组的PPI网络如图所示4．网络仅包括强相关的识别链路（PCC≥0.8， ）并且，结果，42个相关的HDL蛋白。瘦网络中显示4(一)图中T2D网络中包含62条通信链路4 (b)只有35个链接。纤维蛋白原α链，纤维蛋白原β链和纤维蛋白原链（黄色）形成纤维蛋白原，血浆中的糖蛋白。这三个亚基应在分解网络中互连，因为它们以分馏的血浆作为单个蛋白质共同化和行进。两个图中的三个亚基的互连4(一)和4 (b)，验证了我们的网络建设。

在图4(一)，我们鉴定了几组蛋白质，可以使用聚簇方法找到聚集在一起[30.］．这些集群可能包括不同的HDL亚种，并在瘦对照中以不同的颜色标记。不属于任何集群的节点用水绿色标记。在T2D网络中(图4 (b)），我们应用了与图中相同的布局和配色方案4(一)比较。精益和T2D网络之间存在全球拓扑差异。计算聚类系数（CC）以测量网络中的节点倾向于聚集在一起的程度。贫网络的CC为0.508，而T2D网络的CC降至0.225。这种还原表明贫受试者可能具有比T2D受试者更完整的蛋白质亚种。

网络的另一个重要拓扑特征是连接组件（NCC）的数量。在图形中，其连接的组件是每个连接的最大子图的集合。较低的NCC表示较少的子图，并表明网络连接更强。Lean和T2D网络的NCC分别为8和23。在链路数量方面，精益网络与具有相同PCC截止的T2D网络具有更多链接。这表明贫液中的HDL蛋白具有比T2D受试者中的更强的识别关系。T2D网络中的链接丢失主要在群集中（例如，绿色和黄色集群）。另一方面，T2D网络涉及额外的链接;例如，Kininogen-1与粉红色群集切开。网络之间的差异表明某些HDL亚种的组成改变可能会在T2D中发生青少年。

在进一步检查时，首先指出，在T2D组中不存在apoA-1和ApoA-II之间的边缘。尽管并非所有含有ApoA-1的颗粒包括apoA-II，但众所周知，ApoA-1和ApoA-II经常存在于相同的HDL复合物上[14.，18.，29，32］．一个独立的研究[32[已在凝胶过滤基等离子体分级（PCC = 0.96）后，已报道APOA-1和ApoA-II。在目前的研究中，瘦群中ApoA-1和ApoA-II迁移模式的PCC为0.871（ ），而T2D组中的PCC降至0.747（ )．它们在瘦瘦和T2D组之间比较了它们的综合模式（图5（a）和5（b）)．apoA-II的分布发生了明显的变化，特别是在分数21-23附近。这在我们的原始论文中已有报道[17.］．PCC较低可能是由于T2D患者中小的HDL颗粒的丢失或T2D青少年中含有apoA-II的HDL亚种成分的改变。此外，结合珠蛋白相关蛋白和补体因子H之间的连接在T2D网络中丢失。他们的迁徙模式(数字5（c）和5（d）)显示结合珠蛋白相关蛋白在T2D组中有明显的模式改变。另一方面，我们发现了一些只出现在T2D网络中的边。

数据5（e）和5 (f)显示Kininogen-1在瘦对照中的级分26处具有峰值，但T2D受试者的级分27处的峰值。这种右移使Kininogen-1具有类似的迁移模式，以T2D在青年中占用。

在HDL-associated PPI网络中，我们观察到三个簇，其中至少包含两个与PWV高度相关的蛋白。这些是蓝色簇包含4个蛋白质(apoA-IV，抗凝血酶iii, kallistatin，和白蛋白)，绿色簇包含5个蛋白质(apoA-I, apoA-II，补体C3，补体C1s亚组分，和Ig gamma-1链C区)，粉色簇包含6个蛋白质(血凝蛋白，gelsolin，纤溶酶原，补体C9, apoH，和alpha-2-HS-glycoprotein)。蓝色簇中的蛋白质不太可能形成一个亚种。它们只是因为体型相似而一起迁移。如果它们形成一个亚种，它们的总分子量至少为205 kDa，没有任何相关的脂质，因此可以在早期馏分中洗脱。因此，这个分组将不被称为亚种。然而，其余的2个簇都可能像在一个亚种一样一起迁移，因为它们洗脱的部分包含的蛋白质比它们各自簇中的任何单个蛋白质都大。2个亚种在lean组和T2D组的迁移模式如图所示6．同样，我们首先向图中所示的控制提供纤维蛋白原6（a）和6（b）为了说明如果它们驻留在相同的“粒子”上，则如何将不同的蛋白质分配，并且在先前观察到的情况下显示出瘦和T2D之间的模式的差异。图中的其余部分6在精益和T2D中展示了两个新发现的集群的模式。绿色的集群(图6（c）和6 (d)）含有在贫组中鉴定的两个负pWV相关蛋白质。在T2D组中，模式变化是透明的，因此在T2D组中不存在瘦粒子中蛋白质之间的链接。

似乎包含两种动脉粥样硬化保护蛋白的完整亚种被重塑为不相连的原动脉粥样硬化成分。最后，在粉红色的集群中(图6 (e)和6 (f)），六个成员中的四个部分是T2D组中的PWV相关蛋白。只有α-2-HS-糖蛋白才能证明可观察的模式变化。由于这两个集群可能对应于等离子体中的HDL亚种，因此我们预计这些亚种与动脉僵硬有关。

3．4．HDL亚种与疾病

我们进一步迈出了一步，我们试图探索这些亚种与之相关的人类疾病。我们使用了toppcluster [31]建立疾病群集关系网络( Bonferroni调整后)。如图所示7，网络的方形节点代表与这些集群显著相关的所有疾病。网络中的边代表重要的关联，这些关联是基于超几何检验计算出来的。我们用不同的颜色标记与糖尿病相关、cvd相关和血脂异常相关的术语。这两个群集似乎与某些cvd相关或血脂异常相关的疾病有关。这种强烈的关联表明，亚种内的蛋白质可能共同作用，并对这些疾病的发病机制作出贡献。因此，这种疾病相关性进一步支持这些HDL亚种可能与动脉硬化有关。

4。讨论

许多证据表明，T2D患者中某些HDL蛋白或亚种的改变可能与动脉僵硬有关[17.，33- - - - - -37］．例如，与健康对照对象相比，从T2D受试者中分离的HDL的内皮保护活性减少[37］．此外，显示用葡萄糖孵育的HDL抗炎和抗氧化活性受损[36］．因此，T2D特异性HDL蛋白质或亚种的鉴定不仅可以作为CVD的不同阶段的早期生物标志物，但也有助于设计特定的HDL相关疗法，以保护来自CVD并发症的T2D的人。

尽管先前的研究表明，HDL相关的蛋白质在T2D中以青少年改变[17.，哪些蛋白质或亚种与动脉僵硬特别相关，目前仍不清楚。在这里，我们通过比较来自lean和T2D参与者的临床和蛋白质组学数据，确定与动脉僵硬相关的HDL蛋白和亚种。这项工作在两个方面是新颖的:(1)它通过结合生物学分析、临床测量和HDL蛋白质组学揭示了许多显著的pwv相关蛋白;(2)它超越了单个蛋白，从HDL亚种的角度研究了T2D的影响。

关于与动脉刚度相关的单独HDL蛋白质，有关几种结果，包括ApoA-1，富含组氨酸的糖蛋白的PCC的变化，具有PWV的血红蛋白。在目前的分析中，apoa-i与动脉僵硬具有阴性和正相关，这表明apoa-i可以作为HDL颗粒的平台，其可以是动脉保护和致动脉粥样硬化的。由于凝胶过滤技术通过流体动力直径分离HDL颗粒，因此分布图案的改变表明粒径的变化，从而表明HDL亚种的组成变化。T2D组中的apoa-i在较大的HDL范围内表现出较低的标准化丰度，并且粒径较小的粒径增加。从HDL亚种的角度来看，apoa-i是HDL的主要组成部分和结构脚手架，可能涉及多个HDL亚种。基于不同级分的PCC（图1和2)，可能是较大的apoA-I在分数21-22中包含亚种和较小的apoA-I在分数25-28中包含亚种之间的平衡，可能是apoA-I在瘦肉组中具有明显的动脉粥样保护作用，也可能是T2D组中动脉刚度增加的基础。不幸的是，根据目前的分析，不可能区分两种可能性:(1)T2D导致保护性HDL粒子分解为有害的更小的粒子，或(2)血浆中存在两个不同的HDL亚种，具有一定的代谢平衡，而T2D倾向于改变这种平衡。为了解决这些问题，了解这些物种的代谢起源将是很重要的。

此外，T2D组富组氨酸糖蛋白和血凝蛋白与PWV呈正相关。这两种蛋白在凝血、补体和纤溶途径的调节功能中发挥作用。到目前为止，我们还没有足够的信息来推测这些蛋白质是如何导致血管僵硬的，或者它们是否在这方面有因果关系。

我们的网络分析揭示了精益组和T2D组之间蛋白质网络的明显整体差异。从这两种网络的全局拓扑参数可以看出，lean网络的连通性更强，簇数更多，而T2D网络的拓扑结构更分散。在T2D中，某些蛋白质可能从关键的HDL亚种中缺失，从而改变了它们的功能。Fisher等人[38]描述了功能障碍HDL的形成。预期当产生功能障碍HDL而不是成熟球面HDL时，HDL的蛋白质网络可能显示出明显的拓扑差异。我们的网络分析与先前的观察结果一致，即T2D组中的HDL亚种确实由T2D改变[17.，33，34]，与精益组相比，集群内连接减少(如apoA-I和apoA-II连接丢失，以及集群内的其他连接)。

两个候选亚种包含至少两个可能与动脉僵硬相关的pwv相关蛋白被鉴定。值得注意的是，在lean组和T2D组之间，鉴定的亚种个体蛋白的分布模式发生了一些变化(图)6)．这表明在T2D受试者中，这些粒子的组成可能会发生改变。这种成分改变可能会影响HDL的某些功能，从而导致CVD的进展。这些HDL亚种可能提供了T2D和CVD并发症之间的联系。目前，我们的研究主要集中在动脉硬化和CVD。由于T2D有多种典型并发症(如CVD、神经病变、肾病、视网膜病变、听力障碍、阿尔茨海默病)，我们推测不同的HDL亚种或脂质相关颗粒可能与不同的并发症有关。

这项工作的一个限制是有限的样本量。由于受试者募集的限制以及血浆分馏程序的相对有限的产量，该研究在代表性主题组上进行而不是大群。因此，我们不能完全排除各种差异引起的偏见的可能性。然而，没有其他研究致力于偶联脂蛋白并在非常详细地追踪它们的蛋白质组。该研究的另一个限制是，我们不能用100％确定在分析中是否留在HDL粒子上的每种蛋白质。然而，该研究专门设计用于增加我们只看HDL相关蛋白的可能性。本研究中使用的方法涉及分馏HDL的多元方法。首先，整个血浆尺寸分级。其次，LRA用于将含脂质的颗粒分离各部分。虽然LRA有效地结合富含脂质的物种，但我们不能自信地排除一些血浆蛋白质结合LRA的可能性。 Thus it is possible that, even with the LRA selection process, some plasma proteins were detected by MS analysis. However, finally, the resulting list of MS identified proteins (approximately 110 proteins) was filtered against the HDL Proteome Watch, a curated database that reports proteins that have been detected on HDL by multiple mass spectrometry studies. Thus, it is reasonable that the proteins reported in the final subspecies analysis are likely to be HDL-associated proteins. Future work will focus on validating these results in larger groups.

5。结论

总之，我们从复杂的蛋白质组学数据中鉴定出7种HDL蛋白与动脉僵硬度呈负相关，以及9种蛋白与动脉僵硬度呈正相关。此外，我们还分别构建了lean组和T2D组的蛋白质聚合网络。使用基于网络的复杂识别，我们发现了两个pwv相关的HDL亚种，它们与T2D的多种并发症有关。我们警告说，目前的发现仅仅是基于相关性分析。然而，这些相关性足以支持进一步的实验研究。我们发现，这些蛋白质的分布可能有助于更好地理解患有T2D的年轻人中HDL蛋白是如何改变的，以及它们如何与动脉僵硬有关。我们的结果还表明，某些HDL蛋白(如载脂蛋白a - i和富含组氨酸的糖蛋白)可能逆转其保护作用，并在T2D条件下导致动脉粥样硬化。这也许可以解释为什么HDL-C提高疗法[7]没有达到理想的结果。这些PWV相关的蛋白质和亚种可以是未来的确定性实验中的优异目标，用于调查特定的HDL亚种。

缩写

HDL：	高密度脂蛋白
T2D：	2型糖尿病
PWV：	脉搏波速度
心血管疾病:	心血管病
低密度脂蛋白:	低密度脂蛋白
HDL-C：	高密度脂蛋白胆固醇
TLF:	锥虫裂解因子
apo：	载脂蛋白
个随机对照试验:	反向胆固醇运输。

数据可用性

有关资料的可用性，请参阅原始研究[17.］．

伦理批准

这项研究已经得到辛辛那提儿童医院医疗中心IRB委员会的批准。

同意

18岁或以上的参与者或18岁以下参与者的父母或监护人的书面知情同意。

利益冲突

作者宣布没有利益冲突。

作者的贡献

L. Jason Lu设计了本文的研究方案;Amy S. Shah和Scott M. Gordon进行了实验并收集了临床数据;朱晓婷、李海龙、任胜分析数据;Amy S. Shah, Debi K. Swertfeger和John T. Melchior协助研究设计;朱晓婷、Debi K. Swertfeger、李海龙、L. Jason Lu撰写手稿;W.肖恩·戴维森和L.杰森·卢指导了这项研究。

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院(R01-HL111829 to L. Jason Lu, K23-HL118132 to Amy S. Shah, R01-HL104136 to W. Sean Davidson)的支持，Scott M. Gordon的博士前奖学金和美国心脏协会大河分会的John T. Melchior的博士后奖学金。基金资助:国家自然科学基金资助项目(no. 5130442);31601083)。

补充材料

补充图 ：apoa-i相对丰度在馏分21与PWV测量中的相关性。精益，T2D和组合数据分别标有蓝色，红色和绿色。组合数据和PWV的PCC似乎主要由瘦群驱动，因此该PCC未能反映PWV和蛋白质之间的关系。（补充材料）

参考文献

1. S. M.Grundy和等，“预防会议VI：糖尿病和心血管疾病：写作第四组：生活方式和危险因素的医疗管理，”循环，卷。105，没有。18，pp。E153-E158,2002。查看在：出版商的网站|谷歌学术
2. 先生。Taskinen，“糖尿病血脂血症，”动脉粥样硬化补充剂，卷。3，不。1，pp.47-51,2002。查看在：出版商的网站|谷歌学术
3. J.-c.Fruchart，F. Sacks，M. P. Hermans等，“残余风险减少倡议：呼吁采取行动，以减少患有血脂血症患者的残留血管风险”美国心脏病学杂志第102卷第1期10日,2008年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
4. D. KEENE，C.价格，M. J. Shun-Shin和D. P. Francis，“对高密度脂蛋白的心血管风险的影响靶向药物治疗烟酸，纤维剂和CETP抑制剂：荟萃分​​析随机对照试验，包括117,411名患者，”英国医学杂志，第349卷，文章编号g4379, 2014。查看在：出版商的网站|谷歌学术
5. R.S.Birjmohun，B.A.Hutten，J.J.P.Kastelein，以及大肠杆菌毒素，“高密度脂蛋白胆固醇的化合物的疗效和安全性”：随机对照试验的荟萃分析，“美国心脏病学学院学报第45卷第5期2，页185-197,2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术
6. S.J.Nicholls，H.B.B.B.B.P.P.Kastelein等人，“CETP抑制剂Evacetrapib的影响或与HDL和LDL胆固醇的他汀类药物组合的”CETP抑制剂EVACETRAPIB：随机对照试验，“美国医学协会杂志，第306卷，第306号19，第2099-2109页，2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术
7. R. S. Wright，“最近的临床试验评估药物治疗的益处，用于改性HDL胆固醇，”心脏病学的最新观点第28卷第2期4，页389-398,2013。查看在：出版商的网站|谷歌学术
8. L. Bowman, J. C. Hopewell, F. Chen等人，“anacetrapib在动脉粥样硬化血管疾病患者中的作用，”新英格兰医学杂志，卷。377，没有。13，pp。1217-1227，2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
9. F. Rezaee, B. Casetta, J. h.m. Levels, D. Speijer，和J. C. M. Meijers，“高密度脂蛋白的蛋白质组学分析”，蛋白质组学，第6卷，第2期2，页721-730,2006。查看在：出版商的网站|谷歌学术
10. T.Vaisar，S.Pennathur，P. S. Green等，“霰弹枪蛋白质组学意识到HDL的抗炎性质中的蛋白酶抑制和补体激活，”临床调查杂志，第117卷，第117号3，页746-756,2007。查看在：出版商的网站|谷歌学术
11. H. Karlsson, P. Leanderson, C. Tagesson，和M. Lindahl，“脂蛋白组学II:用二维凝胶电泳和质谱法绘制高密度脂蛋白中的蛋白质”，蛋白质组学，第5卷，第5期。5，pp。1431-1445,2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术
12. M. Heller, D. Stalder, E. Schlappritzi, G. Hayn, U. Matter，和A. Haeberli，“用于人类血浆脂蛋白分子蛋白表征的质谱分析工具”，蛋白质组学，第5卷，第5期。10，页2619-2630,2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术
13. S. M. Gordon，J. Deng，L. J. Lu和W. S. Davidson，“通过凝胶过滤色谱法分馏的人血浆高密度脂蛋白的蛋白质组学表征”蛋白质组研究杂志，第9卷，第5期。10，第5239-5249页，2010。查看在：出版商的网站|谷歌学术
14. W. S. Davidson, R. A. G. D. Silva, S. Chantepie, W. R. Lagor, M. J. Chapman, and A. kontuush，“定义的hdl亚群的蛋白质组学分析揭示了颗粒特异性蛋白簇:与抗氧化功能的相关性，”动脉硬化、血栓形成与血管生物学，第29卷，第2期6, pp. 870-876, 2009。查看在：出版商的网站|谷歌学术
15. J. Raper, R. Fung, J. Ghiso, V. Nussenzweig, S. Tomlinson，“从人血清中提取的一种新的锥虫分解因子的特性”，感染和免疫，第67卷，第5期第4页，1910-1916,1999。查看在：谷歌学术
16. H.Li，S. M. Gordon，X.Zhu等，“基于网络的人血浆正交分离的基于网络分析，发现了明显的高密度脂蛋白复合物”蛋白质组研究杂志，卷。14，不。8，pp。3082-3094,2015。查看在：出版商的网站|谷歌学术
17. S. M. Gordon, W. S. Davidson, E. M. Urbina等，“2型糖尿病对男性青年脂蛋白组成和动脉硬化的影响”，糖尿病第62期8, pp. 2958-2967, 2013。查看在：出版商的网站|谷歌学术
18. A. Heink，W.S. Davidson，D.K.Swertfeger，L.J.Lu和A. S. Shah，“通过质谱增强脂蛋白蛋白质检测的方法”的比较，“蛋白质组研究杂志，卷。14，不。7，pp。2943-2950,2015。查看在：出版商的网站|谷歌学术
19. S. M. Gordon，S. Hofmann，D. S.歪斜和W.S. Davidson，“高密度脂蛋白：它不仅仅是关于脂质运输，”内分泌和新陈代谢的趋势，卷。22，没有。1，pp。9-15，2011年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
20. J.A.Lealset，“血浆卵磷脂：胆固醇酰基转移酶反应”荔枝研究杂志，第9卷，第5期。2，页155-167,1968。查看在：谷歌学术
21. M. i.麦克风，S. Arrol和P. n.Durrington，“律酶溶解在低密度脂蛋白中的脂溶脂积累，”费用字母，卷。286，没有。1-2，PP。152-154,1991。查看在：出版商的网站|谷歌学术
22. J.-r.Nofer和G. Assmann，“高密度脂蛋白相关溶酶索哌啶的动脉保护作用”心血管医学的趋势，卷。15，不。7，pp。265-271,2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术
23. C. Wadham，N.Albanese，J. Roberts等，“高密度脂蛋白中和C反应蛋白质促炎活性”循环，卷。109，没有。17，pp。2116-2122,2004。查看在：出版商的网站|谷歌学术
24. J. T. Kuvin, N. A. Harati, N. G. Pandian, R. M. Bojar, and K. R. Khabbaz，《现代外科时代的术后心脏填塞》，胸外科的历史第74卷第1期4、2002年。查看在：出版商的网站|谷歌学术
25. S.Kulkarni，K. J.Woollard，S. Thomas，D. Oxley和S.P. Jackson，“从促进粘合剂表型转换血小板转换：PAF在空间上调节中性粒细胞粘附和展开的作用”血号，第110卷。第6页，1879-1886,2007。查看在：出版商的网站|谷歌学术
26. 美国糖尿病协会，《糖尿病医疗护理标准- 2012》，糖尿病护理，卷。35，PP。S11-S63,2012。查看在：出版商的网站|谷歌学术
27. S. Laurent，J. Cockcroft，L. Van Bortel等，“关于动脉僵硬的专家共识文件：方法论问题和临床应用，”欧洲心脏杂志》上，卷。27，不。21，pp。2588-2605,2006。查看在：出版商的网站|谷歌学术
28. D. K. Swertfeger, H. Li, S. Rebholz等，“绘制人体血浆中动脉粥样硬化保护功能和相关蛋白/脂蛋白的大小分割图，”分子与细胞蛋白质组学，卷。16，不。4，pp。680-693,2017。查看在：出版商的网站|谷歌学术
29. W. S. Davidson，“高密度脂蛋白蛋白质组观察，2016，”http://homepages.uc.edu/~davidswm/HDLproteome.html．查看在：谷歌学术
30. T. Nepusz, H. Yu, and A. Paccanaro，“检测蛋白-蛋白相互作用网络中的重叠蛋白复合物”，自然方法，第9卷，第5期。5，pp。471-472，2012。查看在：出版商的网站|谷歌学术
31. V. Kaimal, E. E. Bardes, S. C. Tabar, A. G. Jegga，和B. J. Aronow，“ToppCluster:用于比较富集聚类和基于网络的生物系统解剖的多基因列表特征分析仪，”核酸研究第38卷第2期2、文章编号gkq418, pp. W96-W102, 2010。查看在：出版商的网站|谷歌学术
32. S. M. Gordon和等人，“多维共分析​​分析显示蛋白质蛋白相互作用定义血浆脂蛋白亚种，”分子和细胞蛋白质组学，卷。12，不。11，pp。3123-3134，2013。查看在：谷歌学术
33. 冯·埃卡德斯坦和j - r。Nofer，“青少年2型糖尿病患者的高密度脂蛋白脆弱和动脉硬化，”糖尿病第62期8，pp。2662-2664,2013。查看在：出版商的网站|谷歌学术
34. J. W. Brinck, A. Thomas, E. Lauer等，“糖尿病与高密度脂蛋白鞘氨醇-1-磷酸含量降低和高密度脂蛋白心肌细胞保护受损有关。”动脉硬化、血栓形成与血管生物学第36卷第2期5，第817-824页，2016。查看在：出版商的网站|谷歌学术
35. C. CALVO，C.塔拉斯特，G. Ponsin和F.Berthézène，载脂蛋白A-I的非酶促糖糖。对自我关联和脂质结合特性的影响，“生物化学与生物物理研究通讯，卷。153，不。3，pp。1060-1067，1988。查看在：出版商的网站|谷歌学术
36. C. C. Hedrick，S. R. Thorpe，M.-X.Fu等人，“糖化损害高密度脂蛋白功能，”糖尿病症号，第43卷。3，页312-320,2000。查看在：出版商的网站|谷歌学术
37. S.A.Sorrentino，C.Besler，L.Rohrer等人，“高密度脂蛋白的内皮 - 血压血液蛋白的患者患者在患有2型糖尿病患者中受到损害，但在延长释放烟酸疗法后得到改善”循环，卷。121，没有。1，pp。110-122，2010。查看在：出版商的网站|谷歌学术
38. E. A. Fisher，J.E.Feig，B. Hewing，S. L. Hazen，J. D.Smith，“高密度脂蛋白功能，功能障碍和反向胆固醇运输”动脉硬化、血栓形成与血管生物学，第32卷，第2期12，页2813-2820,2012。查看在：出版商的网站|谷歌学术

版权

版权所有©2018朱晓婷等。这是一篇发布在知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。