文摘

的目标是。结肠癌(CRC),发病率和死亡率高,是一种常见的和高度恶性肿瘤,它总是有一个糟糕的预后。因此迫切需要采用合理的方式来评估患者的预后。我们开发和验证一个基因CRC风险预测模型。方法。综合(GEO)基因表达数据库被用来提取CRC患者的基因表达谱( )从地理识别基因差异表达CRC患者之间和控制,然后稳定签名基因1000年首先使用健壮的基于可能性建模与算法迭代和随机变量生存的森林打猎。使用聚类分析方法是最长的距离,和kaplan meier(公里)生存分析被用来比较集群。与此同时,风险评分评估在三个独立的数据集包括地理和Illumina公司HiSeq测序平台。相应的风险指数计算,样本集群分为高和低风险组中值显示。和生存ROC分析是用来评估预后模型。最后,基因集富集分析(GSEA)进行进一步的功能富集分析。结果。10-gene模型获得,包括7负面影响因素(SLC39A14, aac、ERP29 LAMP3、TMEM106C TMED2,和SLC25A3)和3积极的(CNPY2, GRB10 PBK),与几个重要的致癌途径(喀斯特信号,TNF -α信号通路和WNT信号通路)和一些癌症相关的细胞过程(上皮间充质转变和细胞凋亡)。通过使用结肠癌数据集从癌症基因组图谱(TCGA),模型验证在公里生存分析( )和重要的分析与复发时间( )。结论。本研究首先建立了一个稳定、有效的10-gene模型通过使用新颖的组合方法,和CRC患者可以使用它作为预测预后标记他们的生存和监控他们的长期治疗。

1。介绍

结直肠癌(CRC)是一种常见的恶性全球(1,2]。病人通常被诊断为晚期和经验转移复发甚至在治疗切除。尽管CRC联合治疗策略的发展,整体CRC晚期患者的5年生存率仍然很低(3]。

致癌的CRC是一个多步骤、多因素过程涉及基因和表观遗传学和基因控制肿瘤生长,如致癌基因或肿瘤抑制基因,激活或灭活4]。最近识别的新型生物标志物和治疗目标在CRC改善这种疾病的诊断和治疗。然而,由于这种癌症的异质性,单一的生物标志物是有限的,可怜的功效。因此,它会更有利于临床策略来确定如何影响结直肠癌预后的基因档案,以及准确的风险评估基于遗传筛查(5]。

从生物信息学的发展,基因组分析恶性肿瘤已经成为一个有用的工具来识别潜在的癌症生物标记(6]。生物标志物发现的微阵列分析有良好的潜在的临床结果和生存的预测,以及对不同亚型的分类。近年来,研究旨在建立比例风险模型构成的一个关键步骤生物信息学分析(7,8]。一系列的方法筛选潜在的预后基因已经被开发出来,包括随机变量生存森林狩猎算法和健壮的建模、基于可能性生存等(9,10]。然而,尽管这两个模型已报告在CRC的模型建设有用的工具,以前的研究在这一领域主要是基于一个预后统计方法,使用两个或两个以上的预后与一些研究统计方法领域的CRC (11- - - - - -13]。

在这项研究中,基因表达谱分析了CRC的确定基因大多数与预后密切相关。我们首先结合预后的方法通过使用RSFVH和健壮的基于可能性生存模型建立一个新的风险预测模型。经过综合分析,10-gene表达式签名被认定为小说CRC预后模型。TCGA的CRC数据集被用来确定这部小说风险模型的稳定性和有效性,这可以用来识别CRC患者高死亡率风险。除了作为预后签名CRC患者长期治疗和监测结果,一个稳定和有效10-gene模型也可以作为长期生存的一个指标,这将为临床医生提供参考为CRC患者选择治疗方法。

2。材料和方法

2.1。源和数据处理

微阵列基因表达谱的GSE41258作为训练数据集和从GEO数据库下载。首先,181年专利的原位肿瘤样本的存活时间> 1个月选择减少分析误差造成的极端条件下这些临床数据排序后样品。然后,数据标准化是由日志₂转换。TCGA CRC Illumina公司HiSeq和GA Illumina公司数据作为测试数据集。

识别CRC预后模型的多步战略图说明1,总结每一步的结果。

2.2。微分分析预后的基因

选择基因显著变化和微分表达式如下:(1)表达水平的总值和方差计算从地理数据集;(2)选择基因的表达水平是平均超过20%的平均所有基因的表达水平。

单变量Cox回归分析进行差异表达基因。基因与微分表达式 被选为重要的预后的基因。

2.3。数据处理

所选基因进一步筛选简化构造预测模型,提高模型的可靠性。随机生存与森林有关的和健壮的基于可能性进行建模,其中常见的基因被选为功能基因。

2.4。随机建模与森林有关的生存

随机森林预测变量狩猎算法,是一种高效且精确的模型,用于选择相关的变量和估计累积事件函数。根据预测信息,计算累积发病率和随机森林组成的决策树构造。此外,我们确定变量对预后产生重大影响的计算提出了合奏的预测误差估计和变量选择和第一个节点之间的距离和决策树的根节点14]。

2.5。强大的基于可能性生存建模

另一个生存模型、健壮的生存可能性模型被用来选择显著表达基因通过rbsurv R语言如下:(1)随机样本分布是用来把样本分为两组,其中1/3的训练集和验证集样本2/3的样本(2)然后,10日志可能被用来选择最常见的基因组合。基因的选择可能性最大的意思是日志进行进一步分析。下一个最好的基因被确定通过评估所有二基因模型,和理想的基因选择可能性最大的是日志(3)上述过程重复了1000次(15- - - - - -19]

2.6。预后基因的聚类分析和相关分析

根据10个常见基因的表达获得了使用两种筛选模型,每个样本分为两组,无人监督的层次聚类来验证所选基因对预后的影响。简单地说,欧氏距离计算公式 检测样本之间的距离。最长距离法(最长距离法构建一个距离矩阵和集最初的新类通过使用样本之间最远的距离和新类的距离)作为聚类方法(20.]。

确定预后差异样本分类后,kaplan meier生存分析。同时,皮尔森相关分析是用来测试功能基因之间的相关性。

2.7。建设的预后模型

预后指数线性模型被用来构造一个预后风险模型的基于Cox比例风险回归功能基因。该模型的基本形式 ,在这表示每个基因的回归系数表明基因表达谱(21]。因此,π值是病人的预后的指标,与一个更高的水平代表着更大的风险和患者预后较差。

2.8。预测模型的验证

为了验证上述新型风险评分模型的鲁棒性,三个独立数据集被用来评估风险评分,包括地理、Illumina公司HiSeq, Illumina公司GA测序平台。相应的风险指数计算,样本集群分为高和低风险组中值显示。公里生存分析显示两组之间的预后进行比较。

为了避免造成过度拟合样本异质性,进行重采样,随机选择样本的80%。之后将所选样本划分为高和低风险组,重复kaplan - meier和步骤执行生存分析500次。< 0.05的值被认为是表明一个显著差异。

2.9。生存预后模型的中华民国

ROC曲线反映了连续变量的精度来确定因变量在不同标准下,AUC反映了评判价值的独立变量。根据剩余两个变量的函数,生存ROC曲线将预后信息转换为因变量的ROC曲线,代表独立变量的预后判断价值。更高的AUC表明一个更精确的预后预测的指数(22]。

2.10。功能富集分析

在这项研究中,高危组和低风险组形成基于风险的分数。基因(tcga-Hiseq GSE: 19820: 19474年,tcga-ga: 17972)被录取到GSEA过程。三种类型的基因集被用于这项研究。标志和KEGG基因集从MSigDB下载(http://www.gsea-msigdb.org/gsea/downloads.jsp)。GSEA是由R“fgsea”包。基因集与规范化值< 0.05和绝对的标准化丰富得分(NES)大于1被认为是极大地丰富。

2.11。统计分析

如上所述,基因与微分表达式 被选为单变量Cox回归分析重要的预后基因的差异表达基因。基于公里生存分析,预测样本组之间的差异被发现。同时,皮尔森相关分析是用来测试功能基因之间的相关性。生存ROC曲线预测模型。基因集GSEA规范化值< 0.05。< 0.05的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。样本的选择、数据来源、加工

390年共有19820个基因组表达谱从GSE41258 CRC患者选择,和181年formalin-fixed肿瘤石蜡包埋组织都包括在内。此外,验证模型是基于TGCA数据集。364年和215年获得从Illumina公司HiSeq Illumina公司GA TCGA测序平台的数据集,分别。这项工作总结在图的总体流程图1。

3.2。微分分析预后的基因

12546个差异表达基因被确定。在单变量Cox回归显著性水平的差异表达基因调整之上 ,共有1723个预后显著表达基因被确定(表1)。

3.3。预后基因筛选

首先,23预后基因筛选使用随机森林预测变量狩猎算法从基因表达综合(GEO)数据(参数50重复和50次迭代),包括SLC39A14, aac, STX18, CNPY2, PSMA5, GRB10, ERP29, LAMP3, TMEM106C, OLR1, NEO1, ALG6, PBK, MTUS1, GRP, SLC39A8, TMED2, SLC25A3, XPO7, HOXC10, ppc, MLLT11, SDF4。

然后,12预后基因筛选最常见的基因组合到一千年强劲基于可能性生存分析,包括ERP29 TMED2, SLC39A14, aac, CNPY2, PTHLH, SLC25A3, PBK, LAMP3, CAMSAP2, GRB10和TMEM106C(表2)。

最后,相同的基因参与两个筛选方法,包括SLC39A14, aac, CNPY2, GRB10, ERP29, LAMP3, TMEM106C, PBK, TMED2, SLC25A3,被选为功能基因使用两种方法。

3.4。预后基因的聚类分析和相关分析

无人监督的层次聚类应用于10个功能基因的表达谱的数据集和地理数据集(图样本2),两个集群识别集群作为集群1和2。

kaplan meier生存分析集群的集群1和2(图3(一个)显示显著差异在集群之间的预后集群1和2 ( )。此外,根据皮尔逊相关分析,大多数的10个基因(图弱相关3 (b)),证明少10基因信息重叠和低冗余。

3.5。建设的预后模型

根据生存Cox回归分析,预测模型被定义如下: ,表明较高的基因的表达水平与积极的系数,平均生存时间越短,越高的基因表达水平与负系数,存活时间越短。

地理数据的中位数作为分界点,每个样本的激活因子确定,1代表一个积极的结果,0代表一个负面的结果。和十个基因的分数之和作为额外的分数。

根据模型的风险指数,我们将样本分成两组根据他们感染的风险:高风险和低风险与所有有意义的风险指数分割点(≥1,≥2,≥3,≥4…),和公里(图进行了分析4)。从图可以看出,分割点≥6时,值最小( )。因此,6或更被选为最优分割点额外的模型风险指数和≥6-gene集群模型被确认为最终模型的10-gene预后特征。

3.6。预测模型的验证

公里低收入和高危人群的生存分析显示,预后显著差异的地理数据(图5(一个), )(图和TCGA Illumina公司HiSeq测序平台数据5 (b), )。的生存率有显著区别的高风险和低风险组为每个数据集。

重采样和公里生存分析估计的差异存活时间到500年80%的病例选择随机抽样事件。500年地理数据的随机抽样的不同事件和312年Illumina公司TCGA HiSeq测序平台的数据随机抽样事件显著(分别为100%和62.4%),而没有显著差异(78%)78年,TCGA的Illumina公司GA测序平台数据随机抽样事件。

3.7。接受者操作特征(ROC)曲线生存的预后模型

5年生存ROC曲线是根据风险指数,三组的生存时间和生存状态。AUC的地理数据为0.828(图6(一)),TCGA Illumina公司HiSeq测序平台的数据为0.677(图6 (b))。

3.8。识别10-Gene Signature-Associated生物学途径和过程

基因集富集分析(GSEA)进行了识别与相关的生物学过程相关的信号通路;我们执行10-gene模型在GSE41258和TCGA Illumina公司HiSeq和Illumina公司GA测序平台。我们发现识别基因模型正相关的几个重要致癌途径,包括喀斯特信号,TNF -α信号通路和WNT信号通路,在训练集和验证集(图7, , )。同时,其他癌症相关的细胞过程,如上皮间充质转变和细胞凋亡(图7, , ),这部小说呈正相关10-gene模型,表明签名可能参与癌症相关的通路。

4所示。讨论

CRC是一种常见的消化道恶性肿瘤,发病率和死亡率高。尽管CRC筛查和治疗的进步,CRC的高复发和转移率导致糟糕的结果。因此,准确评估预后的CRC患者是很重要的。尽管广泛的调查在CRC确定预后的基因签名,签名用于临床前和临床研究仍然不足。作为这项研究的一部分,我们开发和验证一个稳定、有效的预后基因模型基于10基因(SLC39A14, aac、ERP29 LAMP3、TMEM106C TMED2, SLC25A3, CNPY2, GRB10,和PBK)预后的属性对CRC患者的预后危险因素进行评估。确认差异表达基因签名从地理数据库中提取(GSE41258),两种筛查方法,名叫健壮的可能性生存猎建模和随机森林变量算法为基础,协同应用。无人监督的层次聚类和公里生存分析进一步证实了所选择的准确性和合理性签名。

实现一个先进的分子分类器和预测,多元生存分析加上一个额外的模型分析被用来验证模型的稳定性和有效性从地理和TCGA使用独立的数据集。TCGA的预测价值基于队列Illumina公司HiSeq低于基于地理群体,可能是因为TCGA的数据是由大型研究团队和比地理更标准化。我们的分析表明,10-gene集群模型确实能够从选中的数据集分类的病人和额外的数据分成高和低风险组生存时间的显著差异。

10基因识别在这项研究之前显示在各种癌症,包括CRC差异表达。SLC39A14,二价阳离子转运蛋白编码基因,有两个接头与互斥的外显子4亚型,生成两个亚型:SLC39A14-4A和SLC39A14-4B23]。基于分析涉及244结直肠组织样本,Sveen等人建议基于SLC39A14-exon4B转录变异生物标志物可能有助于区分CRC和其他结肠疾病(24]。因此,治疗策略的发展目标在CRC可变剪接可能有效。ERP29处理起着关键作用的分泌蛋白在真核细胞的内质网。在结肠癌,这个分子是集成到一个小说面板与转移,并根据CRC的预后风险分层,这表明ERP29强烈的表达与肿瘤细胞的转移和复发25]。LAMP3,编码膜蛋白1型积分,已经被确认为一种调节糖蛋白可能参与肿瘤发生的生物过程CRC (26]。组织芯片免疫组织化学分析表明上皮LAMP3可能是一个独立的预后标记对CRC和胃癌(27]。SLC25A3参与慢性阶段的歧视从爆炸危机慢性粒细胞白血病,因此有助于确定风险在诊断治疗策略(28]。然而,它在CRC直到现在还没有被确认。Upregulation TMEM106C表达与肝癌患者的不良预后有关,表明TMEM106C可能作为一种新的基因治疗的潜在目标的恶性肿瘤(29日]。TMED2显著调节在乳腺癌和相关不利的结果(30.]。在细胞溶质,aac催化酮的合成胆固醇和脂肪酸。这项研究首次表明,aac TMEM106C, TMED2 SLC25A3与CRC相关联,影响预后的CRC的负面影响因素。

CNPY2调节CRC的发展可能通过促进血管生成,细胞增殖,迁移,以及通过抑制细胞凋亡的负调节p53通路。CNPY2可能代表一个CRC的预后指标31日]。血清CNPY2被认为是一个有价值的诊断标志物CRC检查(32]。GRB10编码一个适配器蛋白,调节耦合的多个细胞表面受体激酶参与特定信号通路。张等人观察到显著upregulation PI3K-Akt GRB10表达式中14个基因的信号通路在CRC (33]。GRB10不仅是CRC survival-related基因,但也涉及与CRC转移相关的信号通路(34]。PBK基因的超表达已经涉及到肿瘤发生[35]。PBK / TOPK的表达,免疫组织化学分析,可以作为一个独立的预后标记对CRC患者(36]。这些基因的功能和角色CRC值得进一步研究,和意义的重要基因10-gene签名不能被夸大。

此外,GSEA显示表达水平的若干关键oncogenous途径,包括喀斯特信号,TNF -α信号通路,WNT信号通路与构造10-gene模型呈正相关。因此,这些发现可能发挥重要作用在发展中新的靶向抗癌疗法。新颖的分子靶点,10预后基因可能的治疗潜力。

总之,10-gene表达式构造签名是稳定和有效的聚类患者显著差异在临床结果分为高和低风险组。四的10个基因被发现与CRC第一次,从而影响患者的预后。这个功能基因模型增加了分子对CRC和可能的帮助预测CRC患者的预后。

5。结论

在目前的研究中,我们开发了一个10-gene表情签名的CRC首先使用两个新颖的生物统计方法。kaplan meier生存分析和ROC曲线分析了这部小说的功效的两种模型,这可能是一种新颖的CRC患者的预后预测的工具。然而,这项研究的局限是缺乏临床实践和验证的基因模型,这需要进一步发展。

数据可用性

使用的数据或分析在当前的研究可从相应的作者(Kangmin壮族)合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

燕孟,如林副会长周、林Zhizhao和群彭co-first作者。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81802965),总统基金会的南方医院、南方医科大学(2020 b020),在广州和科技项目(202201011101)。