文摘

背景。腹主动脉瘤(AAA)属于一个进步,逐步主动脉破裂,从而导致死亡不需要手术干预。调节AAA的发生和进展的关键因素尚不清楚。越来越多的研究表明,微rna (microRNA)在癌症的发展起着重要的作用。mir - 124作为一个肿瘤抑制在一些肿瘤,及其upregulation可以大大抑制生命活动如恶性肿瘤细胞生长和迁移。目的。本研究的目的是探索mir - 124 a的协会AAA和发现mir - 124 a的监管机制在AAA发展。方法。AAA级患者的标本用于观察mir - 124表达,和人类主动脉内皮细胞(hAoECs)处理AngII建立AAA电池模型。定量反向transcriptase-polymerase连锁反应(存在),CCK-8, transwell分析,流式细胞术测定,和免疫印迹进行发掘mir - 124 a的监管机制在AAA, dual-luciferase记者分析是用来研究下游mir - 124 a的目标。结果。mir - 124 a明显下调的全血的病人,和减少mir - 124也观察到AAA电池模型。Overexpressing mir - 124 a可以有效地抑制增殖和迁移,促进AAA的凋亡细胞。dual-luciferase记者化验证实BRD4是下游mir - 124的目标,和BRD4 upregulation明显逆转mir - 124 a的影响在AAA细胞的表型。此外,它是发现mir - 124 a可以调节Wnt /活动β通过针对BRD4连环蛋白和P53通路。结论。我们的数据表明,mir - 124 a可以调节Wnt /的活动β连环蛋白和P53抑制通过针对BRD4 AAA发展。

1。介绍

腹主动脉瘤(AAA)是一个危险的血管疾病,患者和90%的死亡率AAA与断裂相关的肿瘤1,2]。一些患者AAA可能表达非典型症状,如腹部和背部疼痛可能不能归类为AAA的临床特征;因此,大多数患者的症状变得严重时诊断筛查的研究(3,4]。目前,特定药物和手术干预治疗AAA是可用的。然而,即便是与当前技术,病人的预后和存活率仍不满意(5]。此外,尽管许多研究则深入研究了AAA的致病机制,一些可用于药物的发展目标(6]。因此,继续专注于探索的分子方法仍是AAA处理紧急事件。

最近,越来越多的证据表明,小分子核糖核酸(microrna)把发展的很大一部分AAA (7,8]。microrna组成的核苷酸年龄在18岁至25岁之间发挥生物学作用的细胞通过涉及特殊的翻译抑制蛋白(9,10]。microrna的障碍已经贡献作为一个关键原因,导致多种疾病的进展包括炎症、癌症。可见microrna的表达谱差异存在于AAA患者和健康人的血液单核细胞,和一些microrna已经被证明是重要的参与者为AAA的发展(11,12]。因此,干涉microrna的表达逐渐认为有前途的治疗策略AAA. mir - 124 a,一个丰富的microrna在中枢神经系统,与肿瘤进展。mir - 124 a是在多个肿瘤,肿瘤抑制和mir - 124 a upregulation可以有效地抑制生命活动,如恶性生长和肿瘤细胞的迁移12]。一个研究表明,mir - 124 a的水平的病理全血患者异常,表明潜在mir - 124 a和AAA(之间的联系13]。然而,mir - 124的功能——AAA的进展仍然未知。

本研究着重于调查mir - 124的作用——AAA和揭示mir - 124 a的监管机制在AAA,旨在为AAA的治疗提供参考。

2。材料和方法

2.1。样品制备

该研究证明了济南人民医院伦理委员会隶属于山东第一医科大学。患者的全血标本15 AAA和15个健康受试者被用于这项研究。病人的血是离心机( )10分钟在4°C血清的制备,然后,血清是储存在-70°C。

2.2。细胞培养和AAA模型建立

人类主动脉内皮细胞(hAoECs)被用于这项研究。细胞与DMEM培养包括10% FPS, 100 U /毫升的青霉素,100μ克/毫升链霉素。这些细胞被培养与37°C和5%孵化器有限公司₂。细胞治疗1μM / l AngII建立体外AAA模型。

2.3。细胞转染

mir - 124 microrna的模仿和消极的控制(miR-NC)从Generay购买生物技术(上海,中国)在这项研究中,使用和pcDNA-BRD4控制pcDNA由Generay设计和纯化生物技术(上海,中国)被用来调节BRD4在细胞的水平。细胞培养在6-well板块融合70%,然后,转染子被添加到每个。简而言之,4μ100 g的DNA, pmol RNA或10μl Lipofectamine 2000人,与250年分别稀释μl血清,然后5分钟的混合物被孵化。稀释转染子是完全混合和孵化稀释Lipofectamine 2000在相同体积25°C为20分钟。在那之后,细胞每增加500μ最终混合物的l和培养24小时。

2.4。中存在

mir - 124 a的水平和BRD4整个血液和细胞测量中存在。总RNA分离血清样本使用miRVana巴黎工具包(美国Ambion、奥斯汀、TX)根据制造商的指示。细胞治疗试剂盒提取总RNA,试剂和附着细胞治疗前与trypsase RNA提取。之后,提取的总RNA转录的互补的PrimeScript®RT试剂盒(美国马萨诸塞州热费希尔)。mir - 124 a的引物和BRD4合成PrimeScript®RT试剂盒(美国马萨诸塞州热费希尔)被用于实验。反应系统(10μl)中存在的准备根据操作指令的KAPA存在工具包(Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)。U6作为内生控制。使用下列条件:变性在95°C 3分钟,其次是放大40周期在95°C 12和53°C 40年代,30年代和70°C。microrna的相对水平或信使rna与2计算^−(ΔΔCt)方法(14]。mir - 124 a的引物序列,BRD4, U6表中列出1。

2.5。免疫印迹

细胞总蛋白提取的缓冲区里帕(美国马萨诸塞州热费希尔)。BCA分析工具被用来测量提取物的浓度,结果被用来调整所有提取物的浓度。30μl的提取物添加到凝胶分离,分离和蛋白质聚丙烯酰胺凝胶。之后,蛋白质在凝胶被聚偏二氟乙烯(PVDF)膜的湿传递方法。随后,膜被封锁的5%牛奶1小时,和主要的抗体的蛋白质如BRD4, Wnt,β连环蛋白、P53和β肌动蛋白是用来孵化相关膜在一夜之间在4°C。第二天,膜与TBST洗了三次,然后第二抗体孵育1小时。与TBST洗涤三次后,蛋白质的水平被化学发光检测系统量化。抗体被用于如下:anti-BRD4 (ab2610136 1: 1000年,热费舍尔,麻萨诸塞州,美国),anti-Wnt (ab11154198 1: 1000年,热费舍尔,麻萨诸塞州,美国),反βab2533039连环蛋白(1:1000年,热费舍尔,麻萨诸塞州,美国),anti-P53 (ab11004789 1: 1000年,热费舍尔,麻萨诸塞州,美国),和反β肌动蛋白(ab2223496 1: 1000年,热费舍尔,马萨诸塞州,美国)。

2.6。迁移分析

细胞的迁移被transwell试验观察。简言之,参议院transwell室的涂层与基底膜基质 细胞被播种在每个transwell的参议院。孵化24 h后,细胞被固定的4%多聚甲醛和0.4%台盼蓝染色。之后,细胞迁移到低钱伯斯被计入三3在显微镜下随机选择地区(奥林巴斯、东京、日本)。

2.7。CCK-8化验

细胞被播种到96孔板。细胞转染48小时后,在每个添加CCK-8解决方案(Amyjet,武汉,中国),和空白井只有添加CCK-8控制解决方案。孵化后4小时,吸光度值被标以450海里(分子器件、中国上海)。

2.8。Dual-Luciferase报告基因分析

突变体和野生3 - - - - - -UTR BRD4序列插入pmirGLO荧光素酶记者向量。包含突变序列和野生的向量序列BRD4被命名为BRD4-mutant类型(BRD4-mut)和BRD4-wild类型(BRD4-wt),分别。BRD4-mut和BRD4-wt分别转染到hek - 293 t细胞连同mir - 769模拟或miR-NC,然后,48小时内的细胞被孵化。最后,hek - 293 t的荧光素酶活性被dual-luciferase记者观察分析系统。

2.9。流式细胞术分析

SGC7901细胞被胰蛋白酶处理(0.25%,EDTA-free)。收获细胞被冰磷酸盐(PBS)洗3次。在那之后, 细胞被5μl的冰膜联蛋白V-FITC绑定缓冲(10μg / ml),然后在黑暗中这些细胞被孵化了10分钟。最后,10μ碘化propidium(π20 lμg / ml)被添加到细胞,细胞的凋亡水平和立即流式细胞术观察到设备(美国新泽西州BD生物科学)。

2.10。统计分析

所有实验进行了至少3次,独立。SPSS 20.0进行分析的数据,数据被绘制GraphPad Prism 8.0。卡方检验、方差分析与图基的事后测试是用来计算组之间的差别。 意味着两组存在统计学意义。

3所示。结果

3.1。mir - 124 a是肿瘤全血和AAA下调细胞模型

探索mir - 124 a的作用在腹主动脉瘤,mir - 124 a的表达差异分析了在肿瘤和paracancerous全血中存在。结果表明,mir - 124 a极其表达下调的全血病人与健康主题(图1(一), )。此外,与正常细胞相比,mir - 124 a明显downregualted AAA电池模型与正常相比hAoECs(图1 (b), )。这些观察表明,mir - 124——AAA的进展有关。

3.2。mir - 124 a抑制肿瘤细胞的发展

鉴于mir - 124 a的异常表达在肿瘤细胞中,它假设mir - 124 a参与调控肿瘤细胞的表型。来验证这个假设,mir - 124模拟被转染到AAA电池模型,和CCK-8化验,transwell试验,用流式细胞仪观察mir - 124 a对模型细胞的影响。这是观察到低表达的细胞生存能力使转染后mir - 124 a(图2(一个), )。transwell试验表明,mir - 124显著地抑制细胞的迁移能力模型(图2 (b), )。此外,模型细胞凋亡水平的增加也观察到细胞中mir - 124高水平(图2 (c), )。

3.3。BRD4 mir - 124 a的目标,和BRD4是调节肿瘤全血和AAA电池模型

进一步揭示mir - 124 a的下游因素,TargetScan被用来预测mir - 124的目标。发现BRD4是mir - 124 a的目标。dual-luciferase记者分析被用来测试mir - 124 a的约束力和BRD4。结果表明,mir - 124能有效地行为的野生型BRD4而BRD4(图的突变类型3(一个), )。此外,BRD4 mRNA水平的增加也观察到肿瘤全血和AAA电池模型,它也发现mir - 124 a是极其调节在AAA电池模型与正常相比hAoECs(数字3 (b)和3 (c), )。

3.4。BRD4可以挽救mir - 124 a的抑制肿瘤细胞

虽然mir - 124 a可以直接目标3UTR BRD4,是否BRD4监管起着关键作用的mir - 124 a对肿瘤发展尚不清楚。在接下来的研究中,mir - 124——模仿和BRD4-expressed向量cotransfected到肿瘤细胞,观察其对肿瘤细胞的细胞表型的影响。CCK-8显示肿瘤细胞诱导的抑制可行性mir - 124 a upregulation被BRD4(图逆转4(一), )。transwell测定反映BRD4可以显著救援高的肿瘤细胞的迁移能力减弱mir - 124 a级(图4 (b), )。此外,减少细胞凋亡水平的肿瘤细胞也观察到在细胞cotransfected mir - 124 a模仿,只BRD4与细胞转染mir - 124 a模仿(图4 (c), )。这些观察表明,mir - 124的禁忌与BRD4肿瘤有关。

3.5。mir - 124 a的规定参与Wnt肿瘤/β连环蛋白和P53通路

进一步调查mir - 124 a的监管机制在肿瘤发展,免疫印迹被用来观察活动相关信号通路的变化。结果表明,mir - 124显著抑制Wnt和的表达式β连环蛋白(图5, )。此外,P53水平的增加也使转染后的细胞中观察到mir - 124模拟(图5, )。除此之外,它也发现mir - 124 a的影响在Wnt的水平,β连环蛋白和P53 BRD4(图可以逆转5, )。这些观察建议mir - 124 a可以调节Wnt /的活动β通过针对BRD4连环蛋白和P53通路。

4所示。讨论

尽管巨大的努力使用传统方法降低AAA疾病的死亡率和发病率,根本原因的识别以及适当的医疗干预仍然是一个重大的临床挑战[15]。新方法的理解和战斗AAA是必要的。由于复杂的动脉瘤的病理机制,和破裂,药物设计的一般方法针对特定的酶,细胞表面受体,或单一蛋白质不足以应对上述情况(16]。发现一个全新的方法,通过microrna基因调控及其验证标记和调节器的血管重建在病理条件下对发展创新的治疗方法提供新的治疗途径(12,17]。这项研究揭示了mir - 124 a的连接和AAA, mir - 124和监管机制——在AAA也调查的进展。

最近,越来越多的证据指出,microrna的障碍需要一个重大影响促进癌细胞的发展(18]。在这项研究中,也发现mir - 124 a是显著下调肿瘤全血和AAA模型细胞与正常的全血和细胞。低mir - 124水平已被确定为一个独立的事件所带来的不良预后和存活率的急性淋巴细胞白血病患者19]。此外,先前的研究已经表明,mir - 124 a显然表达下调与胶质母细胞瘤患者的全血,和它的异位表达可以有效地阻止癌细胞的迁移活动(20.]。事实上的差别,对这些基因的一个microrna, mir - 124 a,在这项研究中可以抑制肿瘤细胞的异常增殖和迁移,从而阻止肿瘤的发展,它反映了个体的有效功能microrna参与复杂的生理和疾病表型的肿瘤。

microrna总是作为阻滞剂调节转录抑制蛋白参与细胞的生命活动通过针对3 - - - - - -UTR相关的mrna (21]。张等人已经确认,mir - 194是减少与腹主动脉瘤的恶性增殖,KDM3A, mir - 194的目标,作为肿瘤促进剂促进肿瘤的进展通过调停BNIP3的激活22]。miR-24被证实是一个血管炎症和AAA病理学的主要监管机构。这份报告显示存在1 (Chi3l1)是一个主要目标和效应的控制下miR-24,负责调节细胞因子合成在巨噬细胞以及它们的生存,促进主动脉平滑肌细胞迁移和细胞因子的生产,和刺激血管内皮细胞粘附分子的表达23]。mir - 124 a证明作为神经胶质瘤细胞,肿瘤抑制剂和mir - 124 a可以抑制肿瘤细胞的增殖和迁移通过针对IQGAP1。给出了考虑mir - 124 a的干预腹主动脉瘤通过关键蛋白质的转录抑制;BRD4决心的下游目标由TargetScan mir - 124 a。此外,增加BRD4也观察到肿瘤全血和细胞系。BRD4作为肿瘤促进剂在多个癌症和参与细胞活动来提高肿瘤细胞的不能控制的增长(24]。最近的证据进一步添加BRD4在癌症中的作用的复杂性,表明这种蛋白质有额外nontranscriptional功能影响过程如DNA损伤修复、激活检查站,或者端粒体内平衡。BETi-mediated抑制这些BRD4不在经典里的活动可以显著影响肿瘤细胞的生长和存活。最近的研究强调BRD4在乳腺癌的肿瘤促进剂的作用,和BRD4沉默可以有效降低蜗牛的转录激活,然后阻止肿瘤的进展(25]。除此之外,显然也发现BRD4可以拯救mir - 124 a的抑制效应在AAA电池。结果表明,BRD4抑制明显抑制恶性增长,移民,多种肿瘤细胞和炎症。赵等人已经证实可以有效地抑制可行性,差别BRD4对这些入侵的能力,和垂体腺瘤细胞的迁移26]。因此,建议mir - 124 a可以抑制通过针对BRD4 AAA细胞的表型。

信号通路的功能障碍,如河马Wnt /β连环蛋白和P53已被广泛接受为癌症发展的主要原因,和一直考虑连接mir - 124及相关通路(27]。在这个研究结果确定,mir - 124 a upregulation显著抑制Wnt /的激活β连环蛋白和促进P53的表达,而这些现象由BRD4 upregulation可以逆转。在神经胶质瘤干细胞,它已被证实BRD4可以增强Wnt /的活动β连环蛋白通路通过促进mir - 142 - 5 - p的表达,和BRD4也被确认为P53的抑制促进急性髓系白血病的进展(28,29日]。因此,它表明,mir - 124 a可以通过调节激活抑制AAA的发展变化Wnt /β由BRD4连环蛋白和P53通路介导。

在这项研究中,mir - 124的证据——AAA提供的规范发展;下游目标和监管机制mir - 124 a的AAA也通过细胞模型研究和演示。然而,本研究的一个限制是,虽然mir - 124——一个被认定为AAA发展的监管机构,我们没有进行更多的实验研究探索未知函数的microrna的体内及其相互作用与其他microrna表达的AAA组织。

数据可用性

本研究中使用的数据可从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

李案进行了实验,分析数据,并写了手稿。美丰Lv设计研究。Mingshu Lu和HongLiang关修订后的手稿至关重要的知识内容。所有作者同意负责这项研究的所有方面的准确性和完整性。