文摘
背景。据报道,肝星状细胞(hsc)在肝纤维化的发展发挥重要作用。血红素oxygenase-1 (HO-1)是一个关键的病原反应酶,从而减少胶原合成和肝损伤。然而,它还难以捉摸的HO-1的功能和机制。方法。一个HO-1诱导物氯高铁血红素或HO-1抑制剂ZnPP-IX用于治疗激活HSC-T6,分别。采用MTT试验检测细胞增殖。采用免疫染色是用来测试的水平alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma)、过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPARγ),核factor-kappa HSC-T6 B (nf -κB)的水平。HO-1, PPARγ和NF -κB表达水平测量中存在和免疫印迹。然后使用ELISA检测的水平转化生长因子-β(TGF) 1 (TGF -β1)、白细胞介素- 6 (il - 6)、血清透明质酸(HA)和血清III型胶原aminopeptide (PIIIP)。结果。HSC-T6在Hemin-treated抑制hsc增殖。的水平αsma、HA和PIIIP和ECM的生产低Hemin-treated肝星状细胞,而那些可能被ZnPP-IX获救。NF -κB激活降低,但PPARγ后表达增加HO-1 upregulation。此外,TGF -的水平β1和il - 6,激活下游NF -κB在HSC-T6,减少。PPAR-specific抑制剂GW9662可以阻止那些提到的影响。结论。我们的数据表明,HO-1感应可以通过调节PPAR抑制HSC增殖和活化γ表达和NF -κ直接或间接激活,这使得它有前途的治疗肝纤维化的目标。
1。介绍
据报道,肝星状细胞(hsc)在肝纤维化过程中发挥重要作用。步骤经历一个从静止细胞转变成活跃的细胞在肝损伤,这是细胞外基质(ECM)的主要来源。因此,预防肝星状细胞的增殖和活化逆转肝纤维化是一种有效的策略。
核factor-kappa (NF - BκB),一个至关重要的核转录因子,可以治疗各种炎症相关蛋白的表达,包括肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和interleukin-1 (il - 1)。NF -κB与肝星状细胞的表型相关。激活NF -κ促进HSC的增殖和ECM的生产,这是明显的肝纤维化的过程中(1]。的过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR) ligand-activated核受体广泛存在于生物体和有三个亚型:α,β,γ。PPARγ肝星状细胞表达有利于维护肝星状细胞的静态表型(2]。PPARγupregulation导致显著降低HSC激活和逆转肝纤维化的进展。PPARγ可以直接结合的p50 / p65亚基NF -κB形成转录抑制复杂,这可能降低NF -绑定活动κNF - B和抑制DNA合成κB,从而抑制其表达(3]。PPARγ还可以抑制NF -κ由竞争性结合coactivating因素B转录CREB-binding蛋白质(CBP)和P300和可以诱导肝星状细胞凋亡的4]。
血红素oxygenase-1 (HO-1),病原反应酶,降解的血红素铁,胆绿素,和一氧化碳,分享抗氧化、抗炎、抗凋亡活动(5]。越来越多的证据支持HO-1可以保护肝细胞免受损害由多种原因造成的,如急性肝损伤和肝移植(6]。研究表明,HO-1启动子区域包含绑定网站NF -κB;因此,HO-1 NF -直接相关的活动κB (7]。HO-1可以抑制NF -κ在巨噬细胞(B表达8]。此外,研究发现,之间有相声HO-1和PPAR9]。在HO-1启动子区域基因多态性影响PPAR亚型的转录活动(10]。细胞增殖的抑制作用引起的PPAR配体可以逆转的表达下调HO-1活动。的HO-1-induced upregulation PPAR可能抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖,可减毒的siRNA敲下来HO-1表达式(11]。
在先前的研究中,杜et al .,有努力调查HO-1之间的关系和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)和证明了诱导HO-1可以消除性脂肪肝和肝纤维化进展的非酒精性脂肪肝(6),从而充实一个重要的角色对heme-mediated HO-1 steatohepatitis-related肝纤维化。
在我们之前的研究中,我们报告的作用在CCl四氯化碳(HO-14-)诱导肝纤维化(12]。我们的数据表明,HO-1感应可以减少胶原合成和纤维化的程度,从而防止肝纤维化进展。然而,精确HO-1对肝星状细胞的影响和潜在的机制仍不清楚。目前,仍然也有有限的证据HO-1 HSC激活和发病机理。我们假设HO-1感应可能影响HSC增殖和活化,可能会减少从肝星状细胞炎症因子的释放,这可能上调PPARγ和抑制NF -κB通路在肝星状细胞。
2。材料和方法
2.1。材料和化学物质
杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)和胎牛血清(的边后卫)从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。氯高铁血红素(第九ferriprotoporphyrin HO-1的有力诱导物(13])和锌原卟啉IX (ZnPP-IX特定HO-1拮抗剂(14σ)的产品(圣路易斯,密苏里州,美国)15]。氯高铁血红素的最终浓度和ZnPP-IX都是0.5毫克/毫升。anti-HO-1和anti-PPARγ抗体得到从细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。anti-phospho-NF -κB p65和反α光滑的肌肉肌动蛋白(α从圣克鲁斯生物技术获得的sma)抗体(圣克鲁斯、钙、美国)。GW9662和罗格列酮是开曼群岛的产品化学(圣路易斯,密苏里州,美国)用作PPARγ特殊技能拮抗剂受体激动剂,分别。
2.2。细胞培养和药物浓度的选择
HSC-T6获得博士中富赵(山西长治医学院,中国),生长在DMEM含有10%的边后卫在37°C公司5%2孵化器。HSC-T6被用于实验4 - 6通道内和孵化与不同浓度的氯高铁血红素(6.5,13日和26日μ克/毫升)或ZnPP-IX(3、6和12μg / ml) 12、24、48小时。乳酸脱氢酶(LDH)工具被用来确定氯高铁血红素的细胞毒性或ZnPP-IX [16]。MTT检测设备采用细胞生存能力的分析是基于制造商的指示。对上述实验,13岁μg / ml氯高铁血红素和6μg / ml ZnPP-IX用于24小时;这些剂量有效、无害的细胞中。
2.3。细胞组和治疗
确定HO-1 HSC-T6增殖和活化的影响,HSC-T6被分为4组。细胞组织培养在正常24小时钠作为一种消极的控制。细胞暴露于13μ克/毫升氯高铁血红素或6μg / ml ZnPP-IX,分别命名为B组和c组与13 D组的细胞培养μg / ml氯高铁血红素和3μ克/毫升ZnPP-IX。此外,HSC-T6细胞被分成5组评估PPAR的水平γNF -κB,炎症因素。Hemin-treated除了对照组,细胞组和ZnPP-IX-treated组添加到相同剂量的氯高铁血红素和ZnPP-IX如上所述。但细胞氯高铁血红素+ GW9662 cotreated组与5的挑战μmol / l GW9662氯高铁血红素前30分钟。ZnPP-IX +罗格列酮cotreated组细胞暴露在10μmol / l罗格列酮ZnPP-IX前30分钟。
2.4。免疫染色的αsma, PPARγ和NF -κB
HSC-T6培养在6-well板块包含无菌盖玻片在每个固定有4%聚甲醛在4°C 30分钟。0.1% Triton x - 100透化作用后,细胞被封锁10%正常山羊血清,然后用反探测αsma, anti-PPARγ或anti-NF -κb .幻灯片与相应的生物素化的探索或异硫氰酸荧光素(FITC)标记的第二抗体30分钟。细胞与生物素化的avidin-biotin复杂15分钟服用3,3 - - - - - -diaminobenzidine 5分钟。细胞然后用核染料苏木精复染色,在显微镜下检查。FITC-labeled细胞,将盖玻片的幻灯片,并通过荧光显微镜观察。图像使用计算机程序进行了分析和计算。
2.5。定量实时PCR HO-1,αsma, PPARγ和NF -κB表达
总RNA与RNA分离试剂盒隔离试剂盒(美国表达载体)。一个PrimeScript™链cDNA合成装备(豆类生物技术有限公司)是用于反向cDNA逆转录。PCR反应进行了使用PCR 7500系统和电力SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司;热费希尔科学Inc .)。这项研究包括以下引物:HO-1: 5(向前) - - - - - -CGTGCAGAGAATTCTGAGTTC-3 ,(反向)5 - - - - - -AGACGCTTTACGTAGTGCTG-3 ;αsma(前锋):5 - - - - - -CTGAAGAGCATCCGACACTG-3 ,(反向)5 - - - - - -AGAGGCATAGAGGGACAGCA-3 ;PPARγ(向前)5 - - - - - -TGTGGACCTCTCTGTGATGG-3 ,(反向)5 - - - - - -AGCTCTTGTGAACGGGATGT-3 ;NF -κB: 5(向前) - - - - - -AACACTGCCGAGCTCAAGAT-3 ,(反向)5 - - - - - -CATCGGCTTGAGAAAAGGAG-3 ;和β肌动蛋白(前锋):5 - - - - - -GAGCTATGAGCTGCCTGACG-3 ,(反向)5 - - - - - -AGCACTTGCGGTCCACGATG-3 。比较量化与2 -确定ΔΔCq方法β肌动蛋白作为内生控制(17]。
2.6。西方墨点法
HSC-T6里帕细胞溶解的缓冲区(博士德,中国)。量化后的蛋白质浓度与Bicinchoninic酸工具包(Beyotime、上海、中国),40岁μg蛋白每车道被隔离在sds - page凝胶12%,转移到PVDF膜。屁股被封锁与5%脱脂乳和孵化主要抗体(4°C;一夜之间),其次是孵化HRP-conjugated二级抗体(1 h)。蛋白质乐队发展与化学发光检测试剂。蛋白质的强度与ImageJ量化。
2.7。酶联免疫吸附试验(ELISA)测定哈,PCIII TGF -β1,il - 6浓度在细胞培养基
上层清液的收集HSC-T6检测浓度的哈,PCIII TGF -β1,il - 6与ELISA试剂盒(HopeYear医疗产品有限公司,中国)。每个治疗了五复制。
2.8。统计分析
所有的数据表示为 。在多个组之间比较分析用单向方差分析Newman-Keuls事后测试,而两组中的数据被学生相比 - - - - - -测试。值< 0.05的标准用于统计学意义。所有数据用SPSS软件分析(版本15.0)。
3所示。结果
3.1。最合适的浓度,为氯高铁血红素和ZnPP-IX潜伏期
很重要,选择最有效的浓度和潜伏期氯高铁血红素和ZnPP-IX确保研究是成功的。HSC-T6降低了氯高铁血红素的扩散浓度的方式开始在12小时和24小时是重要的。ZnPP-IX也存在剂量依赖的相关性推广HSC-T6扩散,这是重要的在24小时(图1(一))。LDH工具包进行仔细验证氯高铁血红素的细胞毒性或ZnPP-IX HSC-T6。与6.5或13 HSC-T6孵化μg / ml氯高铁血红素为12或24小时没有表现出显著差异在LDH释放,但增加48小时26μ在所有时间点检测g / ml比控制。在ZnPP-IX-treated细胞LDH释放相比没有明显不同,在控制,除了12。治疗组μ克/毫升浓度24小时和48小时(图1 (b))。这些结果表明,高浓度的氯高铁血红素或ZnPP-IX和长潜伏期是培养HSC-T6有毒。因此,13μg / ml氯高铁血红素和6μg / ml ZnPP-IX被用来治疗细胞24小时在随后的实验中,取得了最佳的活动。
(一)
(b)
3.2。氯高铁血红素的影响或ZnPP-IX HO-1表达和HSC增殖
的mRNA水平HO-1 HSC-T6氯高铁血红素组显著增加,虽然ZnPP-IX组下降了11.6%。然而,没有观察到显著差异相对于控制( )。然而,HO-1 mRNA表达组织暴露于氯高铁血红素和ZnPP-IX仍相对较高,在控制和降低相比,仅在氯高铁血红素治疗组(图2(一个))。免疫印迹分析进一步支持中存在的结果(图2 (b)),这表明HO-1表达HSC-T6被氯高铁血红素抑制ZnPP-IX和调节,而感应被低浓度的ZnPP-IX部分逆转。
(一)
(b)
(c)
MTT分析进一步表明,HSC-T6扩散在B组下降了16.15%,而高水平的HO-1表达式由13μg / ml氯高铁血红素,但在C组增加了12.28%,低水平的HO-1表达式被6μ克/毫升ZnPP-IX。在13个治疗组μg / ml氯高铁血红素和3μg / ml ZnPP-IX, HSC-T6扩散反弹,仅在氯高铁血红素治疗组相比,但这仍明显升高的价格相比控制(图2 (c))。以上数据表明,感应HO-1表达可以抑制HSC增殖,抑制HO-1可以逆转的。
3.3。HO-1对肝星状细胞的活化标志物的水平
αsma和ECM生产过剩都是HSC活化的重要标记。与氯高铁血红素治疗后,的表达αsma ZnPP-IX-treated组明显减少,但增加与控制(图3(一个))。西方墨点法和存在都确认了αsma表达cotreated组高于Hemin-treated组但低于ZnPP-IX-treated组(图3 (b))。这个结果进一步验证了αsma培养HSC-T6(图的染色3 (c))。HA和PCIII水平被认为是减少氯高铁血红素组但ZnPP-IX-treated组显著增加,类似的结果αsma表达(图4)。这些结果表明,Hemin-induced HO-1表达减少αsma表达和HA、PCIII生产在肝星状细胞,而这些影响ZnPP-IX可以逆转。
(一)
(b)
(c)
3.4。HO-1对PPAR的影响γ感应和NF -κB抑制肝星状细胞
我们以前的研究表明,PPAR HO-1可能减轻肝纤维化和规范γ和NF -κ在肝脏B表达使用纤维化大鼠模型(12]。然而,这仍然是未知的上述效应是否通过HSC的监管。因此,我们创建了一个组PPAR的地方γ表达抑制之前HO-1感应和一群PPAR的地方γ表达诱导前HO-1抑制观察PPAR的mRNA和蛋白水平γ和NF -κ在HSC-T6 B。结果了,PPARγ信使rna显著增加和NF -κB mRNA Hemin-treated组相比,减少控制。虽然ZnPP-IX-treated组,PPARγ信使rna是减少和NF -κ(图B mRNA增加5(一个))。我们还发现HO-1 mRNA和PPAR下降了19.6%γ信使rna下降了27.3%在GW9662治疗组和氯高铁血红素仅相对于组织暴露于氯高铁血红素,但NF -κB mRNA增加了38.1%。HO-1表达在这组相比,下降了16.05%,在组仅接受氯高铁血红素。此外,PPARγ表达下降了17.17%,而NF -κB表达增加了28.94%,这与他们的mrna(图是一致的5 (b))。疣状分析PPARγ和NF -κ(图B进一步验证这些结果5 (c))。这些表明,HO-1主要监管机构参与通过PPAR HSC激活γupregulation和NF -κB抑制;HO-1和PPAR之间有一个互动γ,HO-1表达式的感应可能直接或间接地调节NF -κ通过PPAR B激活γ在肝星状细胞。
(一)
(b)
(c)
3.5。HO-1 TGF -的影响β1,从肝星状细胞il - 6的分泌
进一步验证HO-1-mediated抑制NF -κB在肝星状细胞活化,TGF -的分泌β1和il - 6在HSC-T6发现,炎症因素从激活下游NF -κb的水平TGF -β1和il - 6在Hemin-treated组相比,减少了控制、减毒的初加工GW9662。然而,TGF -的水平β1和il - 6在ZnPP-IX-treated升高组相对于其他组织,也被卷入减毒与罗格列酮预处理,TGF -虽然没有显著差异β1两组(图之间的分泌6)。这些证明了感应HO-1可能抑制TGF -β从步骤1和il - 6的分泌,影响HO-1与PPAR的水平相关联γ。
4所示。讨论
HSC活化和增殖是肝纤维化的重要事件,控制ECM沉积和炎性因子的释放。HO-1,一个有效的内源性cytoprotective酶,可以诱导多种人类和哺乳动物组织应对各种形式的氧化应激和炎症损伤。越来越多的证据表明,诱导HO-1表达式是一个至关重要的防御机制对多个肝损伤(18- - - - - -20.]。我们最近的研究创新领导力4全身的大鼠肝纤维化模型表明,HO-1表达式结果的归纳在一个明显的减少αsma级、胶原合成和肝损伤,从而防止肝纤维化的进展。虽然此前有报道强烈表明,HO-1在肝纤维化的发展,保护作用的分子机制仍然是难以捉摸的。实际上,动物的内部环境是复杂的,结果可能是受到其他不可避免的因素的影响。HSC-T6已转染肉瘤病毒40 (SV40)体外活化表型(21]。在这个实验中,HSC-T6作为一个方便的模型来研究肝纤维化的机制,从而避免内部环境的影响,并使我们能够检测的精确分子机制HO-1的保护作用。
验证在肝星状细胞HO-1的积极和消极影响,氯高铁血红素和ZnPP-IX作为一种特定的受体激动剂和抑制剂,分别。在目前的研究中,澄清HO-1的感应是否可以通过ZnPP-IX减毒,一组是暴露于氯高铁血红素和ZnPP-IX设计,除了组织暴露于氯高铁血红素或ZnPP-IX孤单。我们发现的快速抑制HSC增殖,αsma表达,HA或PCIII分泌伴随着HO-1 upregulation,由ZnPP-IX部分逆转。这些证据表明HO-1的影响是通过调节HSC增殖和活化在肝纤维化的进展。
PPARγ和NF -κB是两个重要的核转录因子在肝纤维化的发展。一项研究报道,PPARγ可以维持肝星状细胞的静止的表型,这在肝损伤肝纤维化进展密切相关(22]。PPARγ可以激活和上调Caspase-3和伯灵顿bcl - 2表达和可以减少和NF -κB表达诱导HSC凋亡[23]。PPARγ也会影响与HSC增殖相关信号通路,激活,和细胞凋亡,尤其是NF -κB通路(24]。因此,我们可以通过激活PPAR防止肝纤维化的进展γ然后干扰NF -κB通路。研究表明,HO-1和PPARγ可以相互调节(9],HO-1启动子区域也结合位点NF -κ我们先前的研究显示,HO-1的变化在大鼠肝脏肝纤维化发展密切相关。HO-1 upregulation能抑制肝纤维化的进展。它也表明,HO-1抑制或诱导可能影响PPARγ和NF -κ大鼠肝脏B的表达。然而,目前尚不清楚是否liver-protective HO-1与肝星状细胞的影响。进一步调查HO-1在肝星状细胞的抑制机制,我们在PPAR HO-1的影响分析γ和NF -κB在HSC-T6细胞表达。上述结果表明,Hemin-induced HO-1 PPAR表达显著增加了γ表达和NF -下降κB在HSC-T6表达式,这将防止HSC增殖和胶原蛋白的生产。
进一步调查HO-1在PPAR的表达的影响γ和NF -κB,我们设计了“氯高铁血红素+ GW9662”集团在这个实验中,PPARγ表达式是由其特定抑制剂抑制GW9662之前HO-1归纳。我们还设计了“ZnPP-IX +盐酸罗格列酮”集团,PPARγ之前是由其特定的受体激动剂罗格列酮盐酸盐HO-1抑制。结果显示,HO-1表达式可能会受到PPAR的影响γ,而PPARγ和NF -κB可以相互调节。此外,我们的实验还表明,较小的增加HO-1表达HSC-T6 NF -可能导致一个明显的下降κB的表达。HO-1可能发生的放大效应通过直接监管NF -κB结合HO-1启动子区域。然而,HO-1也可以抑制NF -κ通过影响PPAR B信号转导通路γ表达式,然后抑制HSC增殖和活化。在其他领域的研究表明coregulation HO-1和PPAR之间存在γ。我们的研究结果表明,HO-1不仅可以抑制HSC增殖和活化直接移植PPARγ表达或抑制NF -κ也间接地抑制NF - B的活动κ通过PPAR B活动γ。叶等。25)报道,HO-1感应可以调解PPAR的效果γ在抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖,但这种效应被击倒的小干扰rna转染HO-1通过。刘等人。26]表明HO-1激活可以减弱的炎症相关的细胞因子,减少心肌细胞凋亡的发生通过抑制NF -κB和激活蛋白1 (AP-1)易位。李等人。27]表明upregulation HO-1可以缓解严重急性pancreatitis-associated肺损伤大鼠通过减少NF -κB活动大大和抑制血清TNF水平α明显和il - 6。超表达HO-1可以防止TNF -α介导气道炎症,减少NF -κB活化培养人类气管平滑肌细胞和老鼠。
越来越多的证据表明,PPARγ可以抑制Smad3磷酸化和Smad目标基因的转录,进一步抑制HSC增殖,激活,炎性细胞因子和ECM释放通过阻断TGF -β1 / T i信号通路。此外,TGF -β1 /结缔组织生长因子(CTGF)表达水平明显下降(28]。值得注意的是激活的增加NF -κB在肝星状细胞可能进一步激活其下游基因的水平(il - 6、TNF -α、cox - 2 ICAM-1等)引发或加剧炎症损伤肝脏。TGF -β1和其他炎性细胞因子进一步激活NF -κB和增加HSC活化,最终导致肝纤维化(29日]。因此,检测TGF -β1和肝星状细胞的il - 6水平也可以直接反映HSC增殖和活化和反映激活PPAR的水平γ和NF -κB在肝星状细胞。在这项研究中,TGF -β每个HSC-T6组1和il - 6水平被抑制或触发HO-1表达式后,发现这也验证了通过调节PPAR HO-1对HSC活化的影响γ和NF -κb在这个研究中,我们发现upregulation HO-1可以从肝星状细胞减少炎症因子的释放。这个结果与我们之前的动物实验是相一致的,这表明HO-1 upregulation可以减弱病理和肝脏炎症变化。这项研究进一步证明了TGF -β1和il - 6表达水平组使用PPAR反弹γ之前您抑制剂GW9662氯高铁血红素治疗组相比,氯高铁血红素。与此同时,TGF -β组中1和il - 6水平降低与PPAR进行预处理γ特殊受体激动剂罗格列酮盐酸盐之前ZnPP-IX ZnPP-IX治疗组相比。TGF -的变化β1和il - 6水平符合NF -κB水平但HO-1和PPAR相反γ的水平。HO-1表达式的结果共同表明,感应会抑制TGF -β1,从肝星状细胞il - 6的分泌;抑制效果直接由表达下调NF -κB活动和可能通过上调PPARγ间接影响到NF -水平κB的活动。
总之,HO-1感应可以上调PPARγ表达式,同时直接或间接地表达下调NF -κB在激活肝星状细胞活化,从而影响炎性细胞因子的释放。这些途径代表HO-1在肝脏的保护机制通过抑制HSC增殖和活化,它提供了一种有前途的治疗肝纤维化的策略。
缩写
| 肝星状细胞: | 肝星状细胞 |
| HO-1: | 血红素oxygenase-1 |
| PPARγ: | 过氧物酶体proliferator-activated receptor-gamma |
| NF -κB: | 核factor-kappa B |
| ECM: | 细胞外基质 |
| αsma: | α光滑的肌肉肌动蛋白 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子-α |
| LDH: | 乳酸脱氢酶 |
| TGF -β1: | 转化生长因子-β |
| il - 6: | 白细胞介素- 6 |
| 哈: | 透明质酸 |
| PCIII: | III型胶原。 |
数据可用性
作者确认数据支持本研究的发现可用的文章。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
回族杨写的手稿。回族杨和Liaoyun张的构思和设计研究。Liaoyun张、中富赵、张Yun负责实验数据的收集和分析。Liaoyun张和回族杨解释数据,并起草了手稿。李张、陈杰张全新课题,小华张,龙凤赵修订后的手稿至关重要的知识内容。所有作者阅读和批准最后的手稿。回族杨和Liaoyun张同样贡献了这个工作。
确认
这项工作是由山西省国际科技合作项目(201803 d421064)和山西奖学金委员会支持的研究项目(2020 - 168)。