文摘

背景。吸烟是冠心病的一个危险因素(冠心病),而其潜在的机制是没有那么明确。目的。识别并作证6冠心病与吸烟相关的关键基因通过基因coexpression加权网络分析(WGCNA), (PPI)蛋白质相互作用网络分析和路径分析。方法。冠心病病人的样本首先从基因表达综合(GEO)下载。然后,感兴趣的基因后得到方差分析(方差分析)。此后,23 coexpressed模块后,测定基因相似的表达式通过WGCNA合并。基因的生物功能的模块被浓缩的研究分析。皮尔森相关分析和PPI网络分析被用来屏幕核心基因在冠心病吸烟有关。结果。紫色的模块是最重要的与吸烟有关( , )。基因在这个模块主要参与生物功能相关的心。总共6与吸烟有关的核心基因被确定通过生物信息学分析。他们的表情在动物模型通过动物实验发现。结论。本研究确定了6个核心基因作为潜在生物标志物监测和预测吸烟者的冠心病风险。

1。介绍

冠状动脉心脏病(CAHD)是最主要的一种心血管疾病和来自各种风险因素之间的相互作用。CAHD重要的病理生理基础之一是由于冠状动脉动脉粥样硬化冠状动脉管腔的狭窄(CAAS)或心肌缺血、缺氧或坏死,由于冠状动脉的功能变化。上述所有症状被称为冠状动脉心脏病(冠心病)[1]。众所周知,吸烟是最强的可变因素的心血管疾病的发病率和死亡率,和戒烟可以明显减少冠心病的风险(2]。冠心病的风险烟低于目前的吸烟者,和不同的风险将增加烟戒烟以来随着时间的推移(3]。因此,迫在眉睫的是识别冠心病与吸烟相关的分子机制了解其发病机制。

加权基因coexpression网络分析(WGCNA)是多个样本的基因表达模式的分析方法。集群基因相似的表达模式和方法分析模块和具体特征或表型之间的关系(4]。WGCNA众多基因的信息适用于大多数或所有的变化,而不是仅仅一些差异表达基因,来识别感兴趣的基因集(5]。刘等人。6)确定8 lncRNAs明显影响患者的总生存期喉癌症通过WGCNA (LC),这些标识lncRNAs作证在许多LC细胞。丁等。7]WGCNA用于屏幕5关键基因,它揭示了未来的预后和治疗肝细胞癌(HCC)。然而,WGCNA为冠心病的潜在分子机制的研究还很不足。

此外,吸烟之间的分子机制和透明细胞肾细胞癌(ccRCC)在先前的研究通过蛋白质相互作用研究(PPI)网络和WGCNA [8]。PPI网络是至关重要的在大多数生物功能和流程,和大多数蛋白质激活函数通过彼此的交流互动。因此,PPI网络帮助研究人员更全面、系统地了解疾病的分子机制(9]。例如,霍et al。10]解释Danshensu机制对冠心病的影响通过构建PPI网络。詹森et al。11)确定多个基因相关的冠心病风险使用PPI网络。然而,据报道关于PPI在研究吸烟对冠心病风险的影响。

总之,我们的研究提供了初步信息,深入研究冠心病发病的分子机制,从而定义合适的生物标记物,可以监视和预测吸烟者的冠心病的风险。

2。材料和方法

2.1。数据源和预处理

全血细胞基因比对的冠心病患者和临床数据(补充表1)获得基因表达综合(GEO) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE20681)。病人的定量冠状 狭窄在至少1大型船被选为研究,和99年样本最终获得。探测器通过GPL4133注释。

失踪的再表达数据计算与邻居(资讯)算法和归一化LIMMA包(12,13]。对于一些只匹配一个基因签名的探针,这些探测器的平均相应基因的表达值计算和作为基因表达的最终值。方差分析(方差分析)上执行的所有基因(14]。基因差异大于四分位数的差异被选为感兴趣的基因。接下来,执行WGCNA结合性别和吸烟状况。

2.2。基因Coexpression网络建设

WGCNA建设利用R包WGCNA [4]。建立了一个示例集群树删除离群样本。随后,皮尔逊相关分析进行所有基因构建一个相邻矩阵。基因之间的相关性进一步计算合适的软阈值参数β。为此,基因之间的联系网络中受到无尺度网络分布(β是一个软阈值参数,可以强调之间的强相关性基因和惩罚弱相关)。然后,结果被转移到相邻矩阵,进一步到拓扑重叠矩阵(汤姆)。

对基因进行分类与同样的基因表达模式相似模块,基因不同程度的递阶集群(汤姆)和最小模块将包含50个基因。在主成分分析中,模块的原理组件由eigengene(我),代表每个模块的基因表达谱。接下来,模块特征值被定义为最重要的部分模块,模块中所有基因和总结成一个表达谱特征。最后,高度相似的基因模块合并(阈值:不同小于0.25)。

2.3。确定相关感兴趣的模块和模块功能注释

模块之间的关系通过皮尔森相关分析计算特征值和吸烟,吸烟和模块最相关的被选为感兴趣的模块。

之后,进一步探索基因的生物功能模块感兴趣的可能影响,去功能注释和KEGG富集分析通过使用clusterProfiler包(15)(阈值:值< 0.05和值< 0.05)。

2.4。关键基因鉴定

确定感兴趣的模块后,基因的意义(吸烟状态之间的相关性和基因模块)和模块成员(基因模块和模块特征值)计算 和 作为阈值筛选中心基因模块。

进一步筛选关键基因有更多的意义,所有感兴趣的基因列表模块上传到字符串(http://string-db.org/cgi/input.pl)网站建设PPI网络。最高的前20名的基因连接被选为PPI网络中的枢纽节点阈值: )。然后,中心模块的基因与PPI网络中的枢纽节点获取潜在冠心病与吸烟相关的关键基因。

2.5。验证关键基因

作证是否筛选关键基因参与调控生物过程相关的心,coexpression分析和相应的途径分析进行筛选潜在的相关基因在GeneMANIA吸烟(http://genemania.org/)。此后,箱线图的关键基因表达了根据不同群体的吸烟情况来验证吸烟在关键基因表达的影响。

2.6。香烟烟雾提取物(CSE)准备

真空泵(压力:300毫米汞柱)是用来过滤两个点燃香烟的烟雾(中国烟草湖南工业有限公司。焦油:12毫克尼古丁:1.1毫克,一氧化碳:14毫克,中国)。粒子在烟被移除。然后,在PBS缓冲过滤烟收集。CSE-PBS溶液的pH值控制在7.2和7.4之间。最后,fresh-prepared CSE进一步使用过滤和消毒。

2.7。动物模型建设和血球隔离

雄性BALB / c小鼠(8周)从至关重要的河流购买动物中心(中国,北京),放置在一个12 h / 12 h昼夜环境与自由饮食在室温22°c。吸烟和不吸烟的冠心病饮食刺激引起的小鼠模型。总之,10老鼠分为吸烟组和正常组(5一群老鼠)。老鼠两组与高脂饮食喂养(tp - 2003)(营养饲料,中国)包含以下组件:0.21%丙硫氧嘧啶、胆盐水合物钠0.49%,87.3%标准的食物,2%胆固醇,10%猪油。CSE两支香烟被加入到每天吸烟组的水瓶,虽然没有CSE添加到不吸烟组的水瓶。经过8周的文化上面的饮食后,血液收集小鼠眼球的,然后转移到小管(埃普多夫,德国)使用肝素钠毛细管。然后,300年μl(全血从每个鼠标了。新鲜血液是离心机在1800 g×10分钟,然后上等离子体获得血细胞被抛弃了。所有种实验动物伦理委员会批准的无锡的惠山区人民医院。

2.8。聚合酶链反应(PCR)

总RNA分离使用试剂盒从鼠标通过姬氏试剂(美国表达载体)。RNA浓度Nanodrop探测到2000后,cDNA获得通过的总RNA逆转录PrimeScriptTRT试剂(豆类、日本)。最后,获得cDNA放大了PCR使用SYBRPremix Taq交货。DNA计算的相对表达式2^{- - - - - -ΔΔCT}方法。所有的实验都重复三次,和相应的平均数据。用于PCR引物见下表(表1)。

3所示。结果

3.1。确定感兴趣的基因

探测器被注释之后,方差分析对所有基因进行基于基因表达矩阵。总共有4937个基因与方差大于所有差异的四分位数被选中(补充表2)。

3.2。WGCNA

加权coexpression基因网络是建立在99年4937个基因冠心病与WGCNA包样品。首先,3离群样本被样本聚类分析(图1(一))。然后,coexpression网络是以96样品和4937对应的基因。基因在基因之间的连接网络满足无尺度网络分布阈值β8(无标度 )(数据1 (b)- - - - - -1 (e))。此后,层次聚类进行基因以不同程度(汤姆)。得到37模块,每个模块的特征值计算。高度相似的基因模块合并有不同 ,终于决定(图23 coexpression模块1 (f))。

3.3。感兴趣的模块的功能注释

模块之间的关系和吸烟状况通过module-trait WGCNA关系计算。插图,紫模块提出最重要的与吸烟相关状态( , )(图2(一个))。接下来,去和KEGG浓缩在143个基因分析紫色模块。去分析表明基因主要富集在生物功能相关的心如凝血、止血、凝血,adherens结,粘着斑和肌动蛋白绑定(图2 (b))。KEGG表明基因主要富集在生物通路喜欢粘着斑,血小板激活和紧密连接(图2 (c))。上述结果表示,基因显著相关吸烟可能参与调节心脏的生理功能。

3.4。关键基因的确定

在这项研究中,21个基因与紫罗兰的高与吸烟相关模块作为中心基因筛选 和 阈值(图3(一个))。

PPI网络是由紫模块中的所有基因。最高的前20个基因连接筛选与PPI网络的中心节点交互 作为一个阈值(图3 (b))。PPI网络的中心节点被分割的21个基因中心的紫色模块,最后,6个潜在吸烟获得(图相关的关键基因3 (c))。

3.5。验证关键基因

来验证是否6吸烟状态相关的关键基因和冠心病风险的患者,在GeneMANIA coexpression分析这些6关键基因,和26个基因(包括这六个关键基因)获得的。发现部分生物功能相关的基因丰富的心如血小板激活,调节凝血,调节凝血、止血,调节血小板α颗粒内腔,血小板脱粒,血小板α颗粒(图4(一))。

然后,分析分组吸烟状态时表现出显著的6基因低表达在最近或目前的吸烟组,这是符合相应WGCNA模块和吸烟之间的负相关状态(图4 (b))。

上述结果展出,6个关键基因可能参与调节生物功能相关的心脏和吸烟状态相关。

3.6。关键基因的表达在吸烟和不吸烟的冠心病小鼠模型

为了测量关键基因表达吸烟和不吸烟的患者冠心病的动物实验中,我们构建了相应的冠心病的小鼠模型。F13A1的表达水平,ITGB3、PF4 PBP, SPARC和VCL鼠标通过姬氏被发现存在(数字5(一个)- - - - - -5 (f))。结果表明,ITGB3的表达,PPBP, SPARC吸烟组显著低。PF4 F13A1的表达水平,VCL吸烟组显示低表达的趋势,但无显著性差异。

4所示。讨论

冠心病动脉粥样硬化和冠状动脉主要特性动态血管痉挛和心肌梗死。心肌缺血和缺氧可能发生疾病恶化,或者更严重的是,伤残率和死亡率会增加(16]。尽快缓解冠状动脉狭窄,减少死亡率,一个合理的诊断方法检测冠心病进展是必要的。吸烟被认为是一个主要的冠心病的独立危险因素,与冠心病的风险和地位的年龄呈低度负相关,吸烟开始,每天吸烟的数量,和吸烟年(17]。奎奇立和凯普韦尔(18)发现,患者的死亡率戒烟吸烟患者相比下降36%,死亡率并不是有关病人的其他特性(如年龄、性别、类型的冠心病,和多年的研究)(18]。因此,它被认为是研究基因与吸烟可以帮助我们进一步了解冠心病发病的分子机制,从而增加吸烟患者的诊断和治愈率。

在我们的研究中,从地理访问99名冠心病患者的样本。的紫色模块最重要的相关性与WGCNA吸烟被发现。WGCNA关联分析模块和外部样本之间的特征通过搜索集群(模块)的高度相关的基因,可用于识别候选生物标志物或治疗靶点4]。接下来,浓缩在上述模块进行基因分析。结果表明,基因主要富集在生物通路喜欢粘着斑,血小板激活和紧密连接。去分析模块中表现出基因可能影响心脏的生理功能如凝血,心肌收缩和信号转导。心肌细胞的研究表现出特定的组件costamere(粘着斑)扮演一个角色在启动和维护异常信号的转导导致心脏重构和发展(19]。上面的引用和结果证实,确定基因与吸烟相关的模块,显著参与调节生理功能与心有关。

接下来,21中心从紫模块获得的基因。然后,PPI网络建立了紫色的所有基因模块,和20个枢纽节点被发现。后,PPI与基因在WGCNA中心,6个关键基因并最终获得(F13A1、ITGB3 PF4、PPBP, SPARC, VCL)。F13A1和凝固因子的活动十三世(FXII)等离子体可以影响心肌梗塞的风险(20.]。在ITGB3 rs5918多态性(PlA1 / A2)与冠状动脉(21]。ITGB3多态性可能与血小板抑制阿司匹林的凝固(22]。莱文et al。23]观察等离子PF4显著增加患者的冠状动脉。在冠心病,PPBP可能作为一个可行的协同炎症生物标记(24]。SPARC礼物在心肌膜,其表达式是升高后心肌损伤和纤维化和肥大(25]。VCL是一个至关重要的粘附分子连接粘合复合基于整合素和细胞外基质(26]。VCL-SSH1-CFL能够调解的成熟心肌细胞肌丝(27]。这些基因与冠心病密切相关和心脏肌肉细胞,建议在之前的调查中,有可能作为小说选择治疗目标来提高病人的治愈率。最后,coexpression网络分析与吸烟有关的中心进行基因GeneMANIA冠心病,然后,ITGA2B, ALOX12, ESLP,和俱乐部。Aspirin-associated基因ITGA2B相关心血管疾病患者的吸烟情况(28]。ALOX12启动子甲基化变化在动脉粥样硬化可能作为新的表观遗传指标(29日]。健身房有牵连的多态性组合在冠状动脉(DMDM地位30.]。此外,这些基因参与血小板脱粒和血小板激活,这是与冠心病密切相关(31日,32]。因此,提出,确定枢纽相关基因多态性在冠心病吸烟可能增加的心血管事件和血小板激活。

总之,WGCNA、PPI和路径分析是用来确定和证明6冠心病与吸烟相关的关键基因。这些基因的表达是通过动物实验证实。他们可能与吸烟有关的潜在生物标志物冠心病和协助对吸烟人冠心病的诊断和治疗。然而,需要做进一步的实验来探索上述基因中心的具体分子机制影响冠心病的风险。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

所有协议在本研究动物伦理委员会批准的无锡的惠山区人民医院,无锡,中国,符合指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生院(NIH没有出版。85 - 23,1996年修订)。

同意

不同意是必要的。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

:商、Jiashun太阳为研究设计做出了贡献。Jingjiao回族文学进行搜索。:商获得的数据。Jiashun太阳写了这篇文章。小云扁和李林进行数据分析和起草。鲍恩和杨Kewu邓修改这篇文章。:商给的最终批准提交的版本。:商和Jiashun太阳同样这项工作。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81870197)。

补充材料

补充1。补充表1:冠状动脉疾病患者的临床信息GSE20681数据集。

补充2。补充表2:方差分析得到的4937个基因。