文摘
对象。扩散和入侵是乳腺癌(BC)细胞的典型特征。长非编码RNA NUTM2A-AS1已被证明是在肿瘤特异表达。本研究旨在探讨影响NUTM2A-AS1 BC细胞系的增殖和入侵。方法。使用肿瘤数据库(TCGA)和分析平台(GEPIA) NUTM2A-AS1表达在乳腺癌病例与正常的情况下。此外,kaplan meier总体存活率曲线根据不同层面的NUTM2A-AS1评估。然后,我们构建了一个可拆卸的NUTM2A-AS1并成功地减少了表达的质粒在公元前NUTM2A-AS1细胞的功能。结果。我们发现NUTM2A-AS1可以促进增殖和恶性表型入侵BC。的机制研究,NUTM2A-AS1主要是位于公元前细胞的细胞质,表明NUTM2A-AS1可能通过转录和转录后的调控途径实现其功能。而推倒NUTM2A-AS1,我们发现几个装饰家庭的主要分子。结果表明,只有trim37 mRNA明显受到影响,和蛋白质检测也显示,击倒NUTM2A-AS1表达式可以减少trim37的表达。把实验的结果表明,结合SRSF1 NUTM2A-AS1发挥了关键作用,影响SRSF1之间的交互和trim37 mRNA。信使rna的稳定性试验也证实在NUTM2A-AS1击倒,trim37的mRNA稳定性显著降低,但下降趋势中也是SRSF1可以逆转。上述结果表明,NUTM2A-AS1能保持稳定和表达trim37 SRSF1通路。救援实验结果显示trim37的过度表达,而推倒NUTM2A-AS1可以反向公元前细胞的增殖和侵袭性的减少引起NUTM2A-AS1击倒。结论。因此,trim37被视为必要的目标NUTM2A-AS1公元前施加的生物功能。此外,NUTM2A-AS1公元前的恶性表型来调节通过NUTM2A-AS1 / trim37途径。
1。介绍
更为普遍的女性乳房癌(恶性肿瘤病例1]。即使最初的治疗明显先进和死亡率下降随着时间的推移,长期预后仍值得考虑盛行的癌症死亡(2]。根据统计报告,2020年全球癌症乳腺癌的新病例的数量已经超过了肺癌,排名第一在女性癌症的发病率3]。在2019年,有268600名额外的转移性乳腺癌发生和48100导管原位肿瘤发生[41760人死亡4]。有很多选项可用于乳腺癌的治疗。大多数女性接受手术治疗乳腺癌和许多人也接受额外的手术后,如化疗、激素疗法,或辐射。手术前化疗也可以使用在某些情况下。虽然已经取得了巨大的成就在治疗应用,临床过程仍然需要护理的靶向治疗病死率高。因为乳腺癌的机械论的解释是未知的,更多的小说研究和肿瘤形成有关的基因和澄清的机械论的解释仍然需要5]。
长非编码RNA (lncRNA)是一种RNA序列的200年至一百万年,但没有翻译为蛋白质(6]。再不断地在病理条件下,其功能是侵略者或抗癌基因的负面或正面反馈系统(7]。这些非蛋白编码rna可以调节染色体重塑,转录,基因重组、基因印记,细胞生长、迁移、细胞死亡,核浆运输等生物功能(8]。众多研究表明lncRNAs为一个复杂和广泛参与癌症的出现和发展,希望他们会有一天作为一个指示器用于严重的疾病和治疗的目标9]。
NUTM2A-AS1 3.7 kb-lncRNA端点分化引发发现在19世纪人类的染色体(10]。NUTM2A-AS1细胞质蛋白,功能区分需要激活和必要的区分基因的信使rna。一旦NUTM2A-AS1枯竭,这些组织遗传性状的某些进步总没有感应,引起NUTM2A-AS1缺乏表皮表现出不寻常的终端形态特征的区别,这表现为基因皮肤病与异常的皮肤完整性,如角化过度寻常的和角化过度的小丑11]。此外,大量的研究人员已经发现,NUTM2A-AS1异常显示在各种癌和它的解释与扩张,细胞死亡,入侵和转移性传播,这意味着NUTM2A-AS1可能被用作生物合成途径和治疗干预的目标(12- - - - - -14]。
然而,相对较少的转录因子和机制的调查NUTM2A-AS1癌。NUTM2A-AS1是HER-2-specific lncRNA乳房癌高度增加的按照一定的研究。淘汰赛NUTM2A-AS1可以抑制乳腺癌肿瘤发生和复制过程在体外和促进凋亡细胞死亡(15]。NUTM2A-AS1有表现出促进作用。NUTM2A-AS1被发现癌细胞细胞系中高度表达,和NUTM2A-AS1水平升高与不良预后有关(16]。因此,我们开始研究乳腺癌NUTM2A-AS1生产的数量,难以找出NUTM2A-AS1从事乳腺癌的发病和进展。NUTM2A-AS1被证明是高度升高在这个调查,乳房癌和upregulation与发病的年龄、肿瘤体积,TNM阶段。进一步的研究表明,NUTM2A-AS1促进肿瘤细胞生长和迁移通过调节其基因编码trim37。最后,NUTM2A-AS1函数作为一个癌症和致癌可能被利用作为生物标志物的诊断和治疗。
2。材料和方法
2.1。生物信息学分析
GEPIA (http://gepia2.cancer-pku.cn/指数)是一个可访问的资源,结合数据从癌症基因组图谱(TCGA)和Genotype-Tissue表达式(GTEx)程序逻辑回归和基因关联分析病人的结果(17]。NUTM2A-AS1表达在乳腺癌病例与正常的情况下。此外,kaplan meier总体存活率曲线根据不同层面的NUTM2A-AS1评估。
2.2。细胞培养
在我们的研究中,我们使用三个不同的BC细胞系。这些细胞生长在high-glucose DMEM (GIBCO大岛屿)与细胞培养混合含有10%的边后卫(美国Sigma-Aldrich) 37摄氏度,5%的公司2。
2.3。小干扰RNA转染
细胞行被孵化到six-well盘子的最低强度 。两组形成控制(sh-NC)和干扰(sh-NUTM2A-AS1)。转染试剂应用于6-well板块在手册的推荐摄入量。进一步测试的标本收获后48 - 72小时的培养。实时聚合酶链反应和免疫印迹后被用来评估生产NUTM2A-AS1抑制(RiboBio,中国)。
2.4。细胞计数Kit-8化验
CCK-8测试用于测量细胞增殖是制造商的指导方针(恩佐生命科学)。100年μl裂解缓冲的传播在37 96 -孔板和增长,5%的二氧化碳。在指定的时间,10毫升CCK-8的解决方案是添加到每个。同时,盘子被放置在一个孵化器4小时37°C。每个样品的荧光被量化为450 nm只使用多功能酶标记设备。
2.5。免疫印迹分析
控制细胞(sh-NC)和干扰细胞(sh-NUTM2A-AS1)收获。这些蛋白质纯化使用里帕在4°C的环境下的解决方案。设备描述的方法(皮尔斯,罗克福德,IL)被用来确定蛋白质含量。反应混合物与1补充在等量加载缓冲区被4孤立percent-12百分比sds - page和电子涂层/ PVDF膜。房间的温度,5%无脂牛奶被用来阻止细胞膜1小时。膜被治疗夜间在4°C与特定的抗体NUTM2A-AS1和微管蛋白(美国Sigma-Aldrich)。与TBS冲洗后30分钟,这是准备通过稀释1小时HRP-labeled山羊anti-rabbit免疫球蛋白。样本然后使用成像实验室自动化测量凝胶分析软件和浏览使用荧光染料的化学物质。
2.6。实时聚合酶链反应
RNAiso +工具包用于从细胞中提取总RNA。RNA是反向转录成互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA工具包(试剂盒,德国)。互补脱氧核糖核酸模板被放大实时PCR与豆类SYBR绿色PCR试剂盒。GAPDH是利用内部控制。实时PCR是通过DNA进行引擎内髓2实时周期计(MJ研究,Inc .)。相对叠化mRNA水平计算。从Sangon生物技术、GAPDH和NUTM2A-AS1引物是购买的。以下引物序列用于qPCR: GAPDH向前,5 - - - - - -TTTGGTATCGTGGAAGGACTC−3和反向,5 - - - - - -GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3 ;NUTM2A-AS1向前,5 - - - - - -TACCTCTAGTTCTTCCCGGC-3和反向,5 - - - - - -TTTTGCTTTTCTCCTGGCCC-3 。
2.7。集落形成实验
Mono-cell悬浮液注入six-well板块在剂量的2毫升的浓度600细胞/。两周,细胞培养的氛围在37°C和5%的公司2。每隔一天,使用不同的培养基。当克隆细胞集群出现肉眼可见,文化将会停止。后,PBS的细胞被冲洗,固定在4°C甲醛15分钟,然后用0.5%结晶紫颜色的在室温下20分钟。
2.8。流仪结果
样本接种到six-well板块 细胞/。小干扰rna转染细胞收集后三天。然后,然后细胞定居和培育在4°C预冷冰冷的70%乙醇立即在4°C;冲洗彻底,沾染了25毫升的π(25毫升),500毫升的缓冲区(500毫升),和10毫升的核糖核酸酶A(10毫升)在37°C为30分钟37°C与细胞周期和凋亡暗室工具包(表达载体)。
2.9。统计分析
GraphPad Prism 8.0软件用于描述性统计。这些发现被记录为平均值的标准偏差。的 - - - - - -测试是用来确定方差的统计显著性。为了便于比较两组多,单向方差分析是利用。超过0.05被认为是临床上重要的。
3所示。结果
3.1。描述和表达的NUTM2A-AS1 BC组织和细胞
探索NUTM2A-AS1是否可能影响BC患者的长期生存,我们搜查了“GEPIA”和发现高NUTM2A-AS1水平参与TCGA公元前病人的操作系统基于数据集(图1(一))。初步探索NUTM2A-AS1是否,我们搜查了“GEPIA”,这表明NUTM2A-AS1呈现高表达在公元前标本TCGA基于数据集(图1 (b))。此外,rt - pcr的结果还表明,公元前细胞系NUTM2A-AS1表达高于正常MCF-10A(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。NUTM2A-AS1能促进乳腺癌细胞的增殖和入侵
核扩散和入侵是乳腺癌细胞的典型特征。为了探索NUTM2A-AS1对乳腺癌细胞株的增殖和入侵,我们构建了一个可拆卸的质粒NUTM2A-AS1和成功地降低NUTM2A-AS1的表达在乳腺癌细胞(图2(一个))。随后,CCK8实验表明,乳腺癌细胞株的增殖能力显著降低的击倒NUTM2A-AS1(图2 (b))。Transwell试验还表明,乳腺癌细胞系的入侵能力显著降低的淘汰赛NUTM2A-AS1(图2 (c))。这些结果表明,NUTM2A-AS1能促进乳腺癌的恶性表型的扩散和入侵。
(一)
(b)
(c)
3.3。通过SRSF1 Trim37 NUTM2A-AS1可以保持稳定
为了进一步探索NUTM2A-AS1的生物机制调节乳腺癌的恶性表型,然后我们发现NUTM2A-AS1的胞内定位。结果表明,NUTM2A-AS1主要是坐落在乳腺癌细胞的细胞质(图3(一个)),这表明NUTM2A-AS1可能通过转录和转录后的调控途径实现其功能。修剪家族是一个潜在的致癌基因影响乳腺癌的生物学功能。为了澄清NUTM2A-AS1在削减家庭的影响,我们发现几个主要分子NUTM2A-AS1削减家庭而垮掉了。结果表明,只有trim37mRNA显著影响(图3 (b))。蛋白质检测也显示,推倒NUTM2A-AS1的表达可以减少trim37的表达(图3 (c))。lncRNA影响下游靶基因mRNA的稳定性通过RNA结合蛋白通路,是一种很重要的方式,lncRNA实现其功能。把结果表明NUTM2A-AS1之间有互动和RNA结合蛋白SRSF1(图3 (d))。把实验还表明,之间有一个互动SRSF1蛋白质和trim37mRNA,但这种交互NUTM2A-AS1击倒的下降。上述结果表明,NUTM2A-AS1扮演了一个角色通过绑定SRSF1和影响之间的交互和trim37mRNA(图3 (e))。mRNA稳定性试验还表明,NUTM2A-AS1淘汰赛,trim37的mRNA稳定性显著降低,但下降趋势中也是SRSF1(图可以逆转3 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。复苏的实验显示,过度的trim37可以反向NUTM2A-AS1击倒造成的表型变化
上述结果表明,NUTM2A-AS1能保持稳定和表达trim37 SRSF1通路。为了进一步澄清NUTM2A-AS1是否可以通过trim37工作,我们设计了救援的实验。结果显示trim37的过度表达,而推倒NUTM2A-AS1可以逆转的减少造成的BC细胞株增殖和侵袭性NUTM2A-AS1击倒(数字4(一)和4 (b))。Trim37是必要的链接NUTM2A-AS1意识到乳腺癌的生物学功能。NUTM2A-AS1调控乳腺癌的恶性表型通过NUTM2A-AS1 / trim37途径。
(一)
(b)
4所示。讨论
众多报道研究lncRNAs公元前作为潜在的预测和治疗指标特定患者在最近几天18]。根据TCGA数据库和rt - pcr结果,这项研究是成功的在决定NUTM2A-AS1小说BC-related lncRNA BC标本和细胞系表达升高。Trim37已广泛应用在治疗严重的管理在最近几十年(公元前19]。NUTM2A-AS1表达水平被发现高残留的肿瘤,这表明NUTM2A-AS1可能增强BC细胞增殖。强NUTM2A-AS1表达式与远处转移,肿瘤分级和贫穷-预后根据临床试验。多元回归也验证NUTM2A-AS1小说公元前特有的潜在因素。最终,它将是第一个研究证明NUTM2A-AS1可能作为未来治疗指标在公元前。
NUTM2A-AS1关键lncRNA组织学分化的体细胞(20.]。早先的研究已经表明,NUTM2A-AS1扮演关键经验几个细胞机制的致瘤的起源和发展21]。NUTM2A-AS1可以减少恶性肿瘤细胞浸润和转移通过调制mir - 544 a / FBXW7途径[22]。在胃癌中,一个伟大的水平NUTM2A-AS1可以刺激细胞生长通过改变KLF2 mRNA稳定(23]。NUTM2A-AS1在乳腺癌的作用和机制是我们研究的重点。NUTM2A-AS1生产证明是增加肿瘤样本和细胞系。此外,高架NUTM2A-AS1翻译与更大的恶性级别。先前的研究也NUTM2A-AS1连接到一个坏的结果。这些发现表明,NUTM2A-AS1可以使用作为一个预测和治疗指标乳腺癌。功能性收缩研究进行探讨致癌NUTM2A-AS1参与乳腺癌。Upregulation NUTM2A-AS1已被证明在体外加速乳腺癌细胞的增殖,这很可能会影响由维护细胞周期和命运。同时,NUTM2A-AS1可以提高细胞迁徙的转录。
我们建立NUTM2A-AS1可以控制TRIM37乳腺癌,尽管通路是未知的。NUTM2A-AS1已被证明在细胞质连接SRSF1通过NUTM2A-AS1结构和通过SMD控制下游mRNA的稳定。SRSF1可以立即连接到目标使用UPF1信使RNA, RNA双形成针对mRNA和lncRNA抑制快速mRNA解体(24]。早期的研究和当前核胞质分离分析和RNA IP已经证明NUTM2A-AS1主要是胞质中发现的乳腺癌细胞和在转录后的转录过程中发挥作用通过合作SRSF1 [25]。集成SRSF1和NUTM2A-AS1 / TRIM37确认,在NUTM2A-AS1 Alu元素之间的相互作用和TRIM37 3-UTR,以及确认TRIM37 mRNA的一致性直接影响NUTM2A-AS1 SRSF1表达谱,支持我们的假设,NUTM2A-AS1介导SMD的途径可能是NUTM2A-AS1-TRIM37 [26]。那么多的上述调查结果表明,“NUTM2A-AS1-SRSF1-TRIM37”途径可能在乳腺癌的发展很重要。Sp1和H3K27显示从事NUTM2A-AS1转录的激活。我们的研究仍然令人不满意。在未来的体内实验需要进一步的探索。此外,大规模多中心应该在未来进行案例研究。
总而言之,这种分析发现一个新颖的机制与乳腺癌的发展。我们的研究结果强调的重要性NUTM2A-AS1-SRSF1-TRIM37轴控制乳腺肿瘤发生和传播。我们的研究结果强调的机械解释NUTM2A-AS1调节乳腺肿瘤恶化。NUTM2A-AS1可以使用作为一个乳腺癌筛查标记和治疗目标,以及提供一个临床实验诊断和管理的基础。
数据可用性
使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项研究是由基金会2017年武汉健康医学研究项目委员会,WX17Q01。