文摘
研究已经证明,mir - 335 - 5 - p展览一个至关重要的角色,在多种肿瘤的进展,包括甲状腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌。然而,可能的表达式,详细的角色,和底层机制mir - 335 - 5 - p的子宫平滑肌瘤(UL)仍不清楚。因此,本研究旨在调查mir - 335 - 5的机制和功能在UL - p。在我们的研究中,微rna - 335 - 5 - p (mir - 335 - 5 - p)明显在UL组织和UL细胞系表达下调,尤其是HCC1688和SK-UT-1细胞。功能,超表达mir - 335 - 5 - p明显抑制由CCK-8 UL细胞系的可行性分析。此外,upregulation mir - 335 - 5 - p UL细胞株的抑制增殖集落形成试验,减少增殖细胞核抗原和ki - 67的蛋白质含量检测到免疫印迹分析。此外,过度的mir - 335 - 5 - p诱发UL细胞周期阻滞在G1期。Upregulation mir - 335 - 5 - p细胞周期蛋白A1的水平下降,细胞周期蛋白B1,细胞周期蛋白D2和移植p27蛋白的表达。此外,upregulation mir - 335 - 5 - p促进UL细胞系的细胞凋亡,伯灵顿的蛋白质含量增加,caspase-3裂解,caspase-9裂解,和减少bcl - 2蛋白的表达。此外,精氨酸和Glutamate-Rich蛋白1 (ARGLU1)预计的目标由ENCORI mir - 335 - 5 - p和miRDB证实了dual-luciferase记者分析。 ARGLU1 is negatively associated with miR-335-5p. Furthermore, overexpression of ARGLU1 partly restores the effects of miR-335-5p mimic on the viability, proliferation, cell cycle, and apoptosis of UL cell lines. To conclude, miR-335-5p may play a repressive role in UL by targeting ARGLU1 and serve as a potential therapeutic target for the treatment of UL.
1。介绍
子宫平滑肌瘤(UL)是育龄妇女中最常见的良性肿瘤(1]。也称为子宫肌瘤,UL单克隆平滑肌层的肿瘤(子宫肌层)的子宫。据报道,70% - -80%的女性患有UL一生中大约20%的人需要等临床治疗子宫切除术(2]。因此,UL是一种常见的疾病,严重危害妇女的身心健康。然而,在如此高的发病率,我们知之甚少的UL的病因和发病机理。近年来,遗传流行病学研究发现,UL的发生往往是家族聚集性,和UL的风险在增加女性不生3]。片等人发现,近40%的UL和非随机染色体异常简单4]。但到目前为止,如此高的发病率可以用基因来解释机制尚未被学术界和UL的缺乏有针对性的基因治疗。
微RNA (MicroRNA)是一种新发现的小分子RNA (nt)年龄在18岁至25岁之间5]。目前,有1572个microrna识别在人类基因组中,大约三分之一的人类基因是由microrna [6]。microrna能调节多个基因,基因也可以由多个microrna,形成复杂的监管网络和层次结构在细胞7]。microrna扮演重要的角色在细胞分化、细胞凋亡、恶性转化(8]。目前的研究证实,microrna预计将成为重要的疾病分子标记预测和诊断疾病治疗和新的工具和目标(9]。目前,很多研究结果取得了在恶性肿瘤、心血管疾病、神经肌肉组织,和干细胞10- - - - - -12]。然而,研究microrna的表达在正常子宫平滑肌和UL, microrna的关系、发生和发展的UL刚刚开始。例如,mir - 93是低表达UL组织。Upregulation mir - 93显著降低了细胞的生存能力,促进细胞周期阻滞,导致细胞凋亡,并抑制UL细胞迁移,通过针对CCND1 [13]。此外,mir - 139 - 5的表达在UL - p组织显著降低。超表达mir - 139 - 5 - p的抑制生长和诱导凋亡和逮捕UL G1期细胞通过下调TPD52 [14]。
作为mir - 335家族的一员,mir - 335 - 5 - p位于内含子区域在染色体位置7 q32.2广泛表达在许多组织(15]。研究已经证明,mir - 335 - 5 - p展览一个至关重要的角色,在多种肿瘤的进展,包括甲状腺癌、胰腺癌、非小细胞肺癌(16- - - - - -18]。
然而,可能的表达式,详细的角色和mir - 335 - 5的潜在机制仍在UL - p仍不清楚。因此,本研究设计。正如所料,mir - 335 - 5 - p在UL组织和细胞系表达下调。Upregulation mir - 335 - 5 - p特别是抑制生存和增殖,促进细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞和UL的G1期细胞,这可能是通过针对精氨酸和Glutamate-Rich蛋白1 (ARGLU1),以前被称为FLJ10154,基因与定义糟糕的细胞功能。我们的研究结果暗示,mir - 335 - 5 - p是一个肿瘤抑制,可能作为一种新的生物标志物为UL治疗目标。
2。材料和方法
2.1。样本采集
总共20 UL组织和20对应的相邻组织收集从张家港医院和患者冻结在-80°C。所有患者(24 - 48岁)没有医疗和手术并发症,每年正常。此外,没有激素治疗3个月内拍摄操作之前,所有患者术后病理证实UL。所有患者签署书面知情同意,我们的实验得到伦理委员会的批准。
2.2。细胞培养和转染
子宫平滑肌细胞PHM1-31和UL细胞系包括HCC1688 HTMMT, SK-UT-1, SKN买来BioVector NTCC Inc .(中国,北京)。所有的细胞系杜尔贝科修改鹰的培养基培养(美国DMEM,表达载体,卡尔斯巴德,CA)有10%胎牛血清(美国纽约的边后卫、表达载体、大岛)和1% penicillin-streptomycin (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)37°C下湿润孵化器有限公司为5%2。
细胞转染,mir - 335 - 5 - p模仿/抑制剂,与ARGLU1 pcDNA3.1克隆,空向量合成基因制药公司(上海,中国)。UL细胞系( )保持在6-well板块和转染mir - 335 - 5 - p模仿/抑制剂(50 nM)和/或pc-ARGLU1 (50 ng)使用Lipofectamine 2000(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。48小时后,转染效率由存在决定试验。
2.3。CCK-8化验
不同组织的细胞增殖测定CCK-8化验。HCC1688 SK-UT-1cells均匀在96孔板( 细胞每)。然后,细胞转染和培养表示时间(0,24、48和72 h),分别。细胞生存能力被CCK-8检查工具包(Beyotime生物科技、上海、中国)根据规范。光密度是由标仪检测到490海里。
2.4。集落形成实验
集落形成试验进行评价转染后UL细胞系的增殖潜力。总之,HCC1688和SK-UT-1cells密度 /被播种在6-well盘子,用新鲜培养基中取代了每2 - 3天总共14 d。然后HCC1688 SK-UT-1cells结晶紫染色使用10% 30分钟。
2.5。EdU化验
EdU试验进行了评价转染后UL细胞系的增殖。简单地说,HCC1688和SK-UT-1cells ( 每)在24-well盘子和转染培养48 h。然后,细胞与4%多聚甲醛固定,特里同x - 100是用于permeabilize核膜。最后,细胞被封锁与山羊血清1 h和彩色根据制造商的指示。
2.6。细胞凋亡测定和流式细胞术分析
的细胞凋亡率和细胞周期分布通过流式细胞仪检测转染细胞分析。细胞凋亡、HCC1688和SK-UT-1细胞注射 每口井,细胞和培养基收集在转染后48 h。500年PBS,洗涤μL绑定缓冲是添加到悬浮细胞,然后混合5μL膜联蛋白V-FITC和10μLπ。10分钟后,流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞周期, 从不同的组织收集HCC1688 SK-UT-1细胞。然后,细胞被固定70% EtOH一夜之间和彩色π为30分钟。最后,通过流式细胞仪检测细胞周期分布。
2.7。存在分析
总RNA被试剂盒试剂分开UL细胞系(美国表达载体),互补脱氧核糖核酸合成了TaqMan逆转录工具包(美国应用生物系统公司)。常规RT-qPCR使用ABI 7300 - RT PCR快速实现系统(美国应用生物系统公司)与SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒、德国)根据规范。相对microrna的表达和mRNA进行评估的2−ΔΔCt方法用U6和β肌动蛋白作为内部参考。中使用的引物序列如下:mir - 335 - 5 - p - 5 - - - - - -TCAAGAGCAATAACGAAAAATGT-3和反向5 - - - - - -TGCGGGTGCTCGCTTCGGC AGC-3 ;U6-forward 5 - - - - - -CTCGCTTCGGCAGCACATA-3和反向5 - - - - - -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ;ARGLU1-forward 5 - - - - - -GAGCAGCAGAGAAAGGGA GA-3和反向5 - - - - - -CAGCCGAGCACTCTAGCTCT-3 ;和β-actin-forward 5 - - - - - -CACGAGTACAACCT TC-3和反向5 - - - - - -CCCATACCCACCATCACACC-3 。使用条件存在:95°C 10分钟,40 95°C的周期15秒,1分钟和60°C。
2.8。免疫印迹
蛋白质UL细胞系被孤立里帕裂解缓冲和量化BCA试剂盒(Beyotime生物技术)。蛋白质提取12% sds - page,然后转移到PVDF膜(微孔、马、美国)。接下来,膜干扰5%脱脂牛奶和处理主要的抗体在一夜之间在4°C。然后,膜清洗和孵化了HRP-conjugated二级抗体(1:2000年,ab6728)在室温下1 h。最后,蛋白质印迹被观察到增强化学发光试剂盒(ECL,微孔,贝德福德,妈,美国)和量化使用ImageJ软件(NIH,版本4.3)。抗体的主要如下:anti-PCNA(1: 1、000年,ab92552),反- ki - 67(1: 1、000年,ab16667) anti-Cyclin A1(1: 1、000年,ab53699) anti-Cyclin B1(1: 1、000年,ab32053) anti-Cyclin D2(1: 1、000年,ab230883) anti-p27(1: 1、000年,ab62364) anti-Bax(1: 1、000年,ab32503) anti-Bcl-2(1: 1、000年,ab32124) anti-Cleaved caspase-3(1: 1、000年,ab32042) anti-Cleaved caspase-9(1: 1、000年,ab2324)和反β肌动蛋白(1:000,ab8227)。所有抗体都来自Abcam(马、美国)。
2.9。Dual-Luciferase记者分析
80 ng野生型和突变体ARGLU1 3 - - - - - -UTR dual-Luciferase记者向量是由subcloning人类ARGLU1 mRNA 3 - - - - - -UTR和突变体3 - - - - - -UTR序列到dual-luciferase记者载体质粒(美国麦迪逊Promega)。细胞转染80 ng荧光素酶记者向量和mir - 335 - 5 - p模拟使用Lipofectamine 2000。24小时孵化后,dual-luciferase活动测量。
2.10。统计分析
数据分析是由GraphPad棱镜实现5.0和呈现 (SD)。方差分析之后,图基的事后分析是用来分析组之间的差异。 表示是重要。
3所示。结果
3.1。mir - 335 - 5 - p是UL组织和细胞系中表达下调
评估mir - 335 - 5的表达在UL - p组织和细胞系,首先,总共20μL临床组织收集。如图1(一),mir - 335 - 5 - p显然是UL组织中表达下调与相应相比邻近组织。此外,存在分析被用来评估mir - 335 - 5 - p的表达在UL细胞系,和图的数据1 (b)表明,mir - 335 - 5 - p明显减少UL细胞系特别是HCC1688和SK-UT-1细胞相对于PHM1-31细胞。这些数据表明,mir - 335 - 5 - p可能作为肿瘤抑制UL进展。
(一)
(b)
3.2。Upregulation mir - 335 - 5 - p抑制生存和增殖,促进细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞在G1期UL细胞系
功能,CCK-8试验进行评估的角色mir - 335 - 5 - p UL细胞系的可行性。显示在图2(一个),mir - 335 - 5 - p的超表达显著地抑制HCC1688和SK-UT-1细胞的生存能力以时间依赖方式与数控模拟组。此外,集落形成和EdU化验确定mir - 335 - 5 - p的影响UL细胞系的增殖。如数据所示2 (b)和2 (c),mir - 335 - 5 - p模仿显著减少HCC1688和SK-UT-1细胞的增殖潜力相对于数控模拟组。此外,免疫印迹被用来调查mir - 335 - 5 - p的影响扩散的蛋白质的水平。正如所料,upregulation mir - 335 - 5 - p的蛋白质含量降低PCNA和ki - 67相比,数控模拟组(图2 (d))。此外,采用流式细胞仪分析探索mir - 335 - 5 - p的角色在细胞凋亡及周期分布的UL细胞系。数据的数据2 (e)和2 (g)显示mir - 335 - 5 - p模仿明显促进细胞凋亡和细胞周期阻滞在G1期HCC1688 SK-UT-1细胞相对于数控模拟组。此外,免疫印迹也被用于调查的影响mir - 335 - 5 - p水平的细胞凋亡和细胞cycle-related蛋白质。在数据显示2 (f)和2 (h),upregulation mir - 335 - 5 - p细胞周期蛋白A1的蛋白质含量,减少细胞周期蛋白B1,细胞周期蛋白D2,和bcl - 2,虽然增加了p27的蛋白质含量,伯灵顿,caspase-3裂解,裂解caspase-9相比数控模拟组。这些数据表明upregulation mir - 335 - 5 - p抑制生存和增殖,促进细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞在G1期UL细胞系。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.3。ARGLU1直接mir - 335 - 5 - p的目标
探索可能的下游目标mir - 335 - 5 - p, ENCORI和miRDB。如图3(一个),共有6个目标预测。其中,只有ARGLU1消极与mir - 335 - 5 - p(图3 (b))。此外,dual-luciferase记者分析进行进一步确认目标关系mir - 335 - 5 - p和ARGLU1。如图3 (c)的荧光素酶活性ARGLU1 3 - - - - - -UTR时显著降低细胞转染和mir - 335 - 5 - p模仿。然而,当假定的结合位点突变,mir - 335 - 5 - p模仿表现出适度的影响。此外,探讨负面关联mir - 335 - 5 - p和ARGLU1,存在试验用于检测的表达ARGLU1 HCC1688和SK-UT-1细胞转染和mir - 335 - 5 - p抑制剂。的数据图3 (d)表明ARGLU1显然是调节的mRNA表达HCC1688和SK-UT-1细胞转染mir - 335 - 5 - p抑制剂。此外,在临床UL ARGLU1组织的表达是由存在决定化验。正如所料,ARGLU1显然是调节在UL组织相应的价格相比邻近组织(图3 (e))。这些数据暗示ARGLU1 mir - 335 - 5的直接目标- p和mir - 335 - 5负相关在UL - p。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4。ARGLU1介导的抑制效应mir - 335 - 5 - p UL细胞系
调查是否mir - 335 - 5 - p在UL的发展表现出其功能作用,严重的救援实验进行。CCK-8试验(图的结果4(一))表明,过度的ARGLU1部分恢复的抑制性影响mir - 335 - 5 - p模仿HCC1688和SK-UT-1细胞的可行性。此外,集落形成和EdU化验显示pc-ARGLU1部分恢复的抑制效应mir - 335 - 5 - p模仿HCC1688和SK-UT-1细胞的增殖(数字4 (b)和4 (c))。此外,流式细胞仪分析显示,过度的ARGLU1部分恢复mir - 335 - 5 - p的影响模拟HCC1688细胞凋亡和细胞周期分布和SK-UT-1细胞(数字4 (e)和4 (g))。此外,数据的数据4 (d),4 (f),4 (h)表明的upregulation ARGLU1部分恢复的水平扩散,细胞凋亡,细胞蛋白质cycle-related HCC1688 SK-UT-1细胞转染和mir - 335 - 5 - p模仿。这些数据表明ARGLU1是链接的功能的一个重要中介mir - 335 - 5 - p UL的进展。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
4所示。讨论
UL、最常见的良性肿瘤在育龄妇女生殖系统,显著影响妇女的生育能力和辅助生殖技术的成功率19]。UL的早期识别和诊断是减少造成的不孕不育子宫的关键因素(20.]。近年来,许多报告UL和microrna已经出现。在UL的进步,许多microrna作为致癌基因如mir - 200 c, mir - 139 - 5 - p,和mir - 19714,21,22),许多microrna miR-15b等肿瘤抑制功能,mir - 93, mir - 106 b (13,23,24]。同样,在我们目前的研究中,mir - 335 - 5 - p显然是在临床UL组织和细胞系表达下调,这是高度与先前的研究一致。mir - 335 - 5 - p在结直肠癌显著下调,甲状腺癌、非小细胞肺癌(25- - - - - -27]。这些发现表明,mir - 335 - 5 - p可能作为肿瘤抑制UL。
microrna参与基因调控和许多生物学过程,即表观遗传学的主要现象(28]。然而,microrna调节UL的功能细胞的分子机制仍不清楚。mir - 197增加差别为例,对这些基因的细胞生长和诱导细胞周期阻滞于G0 / G1期在体外UL细胞,而upregulation mir - 197表达有相反的效果29日]。此外,过度mir - 93降低了细胞的生存能力,促进细胞周期阻滞和细胞凋亡,抑制UL细胞迁移(13]。mir - 335 - 5 - p,作为一个肿瘤抑制功能,据报道表现出许多肿瘤发展的至关重要的作用。例如,upregulation mir - 335 - 5 - p的抑制增殖和诱导细胞周期阻滞的非小细胞肺癌细胞(30.]。此外,过度的mir - 335 - 5 - p抑制细胞增殖和抑制大肠癌细胞的迁移能力和入侵,而击倒mir - 335 - 5 - p显示了相反的结果31日]。此外,upregulation mir - 335 - 5 - p的抑制增殖,迁移和入侵和甲状腺癌的细胞凋亡16]。细胞行为实验显示,mir - 335 - 5 - p模仿和Rho-associated卷曲螺旋含有蛋白激酶1 (ROCK1)击倒逆转的影响调节分化得罪非蛋白编码RNA (DANCR)增殖、迁移,入侵,epithelial-mesenchymal宫颈癌细胞的过渡(EMT)救援化验。本研究表明,DANCR促进宫颈癌的进展通过作为一个竞争内源性RNA(龙头)调节ROCK1表达式通过骗取mir - 335 - 5 - p,暗示小说宫颈癌(潜在的治疗目标16,17]。同样,在我们目前的研究中,超表达mir - 335 - 5 - p明显抑制生存和增殖和诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞UL细胞。这些结果和先前的发现。
激活protooncogenes或肿瘤抑制基因的失活,关键链接在肿瘤发生和发展的过程中,会引起肿瘤发生的细胞由于不受控制的增长32,33]。在生物体中,microrna的调节通过调节细胞的生物学行为相应的目标mrna的表达。例如,mir - 197是低表达UL组织。Downregulation mir - 197的促进细胞生长和诱导细胞周期阻滞于G0 / G1期通过直接针对IGFBP5 [34]。此外,mir - 139 - 5 - p是卑微的UL组织中表达,和upregulation mir - 139 - 5 - p抑制UL细胞的生长,诱导细胞凋亡,通过负调节TPD52 G1期逮捕[14]。为了进一步探索microrna的生物机制,我们需要找到并确认其目标mrna在一个特定的生物过程。在这项研究中,ENCORI和miRDB进行预测候选目标mrna mir - 335 - 5 - p,和ARGLU1被选为候选目标mir - 335 - 5 - p。此外,dual-luciferase报告基因检测系统采用确认ARGLU1直接mir - 335 - 5 - p的目标。ARGLU1是一个高度极化在带正电氨基酸蛋白质浓缩前98 n端氨基酸(8 27个精氨酸和赖氨酸,或36%)与其它序列高纯度带负电荷的残留物(49谷氨酸,或28%)[35]。之前的研究表明,异位表达ARGLU1是许多肿瘤的发生和发展密切相关。例如,ARGLU1在乳腺癌中,从而显著抑制乳腺癌的进展(36]。因此,在我们的研究中,我们发现ARGLU1 UL组织中高度表达的细胞系和upregulation ARGLU1显著恢复mir - 335 - 5 - p的影响模拟可行性、增殖、凋亡、细胞周期分布的UL细胞。然而,mir - 335 - 5的具体机制在调节发展的UL - p仍然遥遥无期。更多的研究在活的有机体内应进行验证我们的结论。
总之,我们的研究结果显示,mir - 335 - 5 - p明显UL组织和细胞系中表达下调。Upregulation mir - 335 - 5 - p显著抑制生存和增殖,促进细胞凋亡,诱导细胞周期阻滞和UL通过针对ARGLU1细胞,表明mir - 335 - 5 - p可能成为一个有效的目标治疗UL患者。
数据可用性
作者确认数据支持本研究的发现可用的文章。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
作者的贡献
严Sumei风扇和太阳的构思和设计研究。陈魏赵、Yingyan赵和凌进行文献搜索、数据收集和分析。魏赵和Yingyan赵起草了手稿。Sumei太阳球迷,燕证实所有的原始数据的真实性。魏赵和Sumei风扇提供了资金支持。所有作者阅读和批准最终的手稿。陈魏赵、Yingyan赵和凌贡献同样这项工作。