文摘gydF4y2Ba

客观的gydF4y2Ba。这项研究的重点是研究影响组合的香菇多糖(LNT)和铂(Oxa)人食管癌细胞的凋亡,以及底层机制。gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba。LNT和Oxa用于治疗ec - 109人类食管肿瘤细胞在不同的剂量,和细胞存活率测定使用细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定。此外,治疗后24小时的ec - 109细胞的结合LNT Oxa,流式细胞术被用于分析其对细胞凋亡的影响。此外,LNT ec - 109细胞凋亡结果评估通过测量的结果LNT mRNA和蛋白表达水平与免疫原性细胞死亡因素CALR,一半,和HSP70 qPCR定量实时聚合酶链反应和免疫印迹分析,相应。gydF4y2Ba结果gydF4y2Ba。细胞增殖抑制只有当ec - 109细胞添加LNT在1200日圆gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL的最大浓度,但LNT和Oxa低剂量(800gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升,20gydF4y2BaμgydF4y2Ba分别为M)极大地增加他们对Oxa的敏感性,降低扩散(gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba和细胞凋亡明显增加了LNT (gydF4y2Ba )。gydF4y2BaCALR免疫原性细胞死亡相关的基因,一半,HSP70显著增强mRNA和蛋白表达水平与LNT和治疗后Oxa (gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba结论。gydF4y2Ba这些数据暗示LNT增加食管癌的易感性癌细胞通过驾驶Oxa ec - 109细胞显示免疫原性死亡。因此,LNT结合Oxa食道癌管理可能是一种有效的方法。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

人类肿瘤发病率和死亡近年来一直稳步上升,食道癌的发生率,尤其是,仍然很高。食道癌的第六个癌症相关死亡的主要原因是男人,和总体5年生存率潜水员从全世界15 - 25%gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(AC)是食道癌的两个主要的亚型。gydF4y2Ba

目前食管癌的主要治疗技术是手术,单独或与化疗或放疗,和食管恶性肿瘤的患病率近年来仍然很高(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。然而,尽管手术治疗和全身化疗可以用于治疗食道癌和延长病人生存在某种程度上,他们无法有效地治疗晚期食道癌。目前,还没有有效的药物治疗食道癌,除了那些针对PD-L1 PD-L1-positive癌症(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。铂- (Oxa -)为基础的化疗方案仍然是一个主要的临床治疗食道癌治疗,但Oxa阻力的发展及其毒性限制了其疗效在治疗食道癌的gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。降低其细胞毒性和预防食道癌Oxa阻力的发展仍然是一个尚未解决的挑战在治疗癌症。gydF4y2Ba

从天然食品和草药提取物癌症治疗得到了研究人员的广泛关注由于其副作用小的优点[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。香菇多糖(LNT)是一个来自香菇多糖化合物地区香菇菌丝体,因此展品疗效如抗氧化应激、抗炎、抗癌和已广泛应用于癌症辅助治疗临床试验(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。Oxa是一种常用的以铂为基础的化疗剂和与其他药物联合使用。LNT结合紫杉醇、顺铂有效抑制胃癌细胞生长和促进细胞凋亡,和LNT与顺铂的不利影响减少到最低限度的顺铂,可以成功地提高肺癌患者的生活标准。然而,它在食道癌中的作用目前还不清楚。在目前的研究中,我们评估的抗肿瘤免疫结果LNT单独和Oxa组合确定变更对食道癌的食道癌细胞凋亡机制。gydF4y2Ba

本研究将演示香菇多糖的作用和Oxa食管肿瘤和解释潜在的机制,将对患者的治疗。gydF4y2Ba

2。结果gydF4y2Ba

2.1。LNT和Oxa抑制增殖和诱导细胞凋亡在ec - 109食管肿瘤细胞gydF4y2Ba

我们cocultured ec - 109细胞与不同浓度的LNT (0 1600 g / mL)和Oxa(0 80) 24到72小时测试的影响LNT和Oxa ec - 109食道癌细胞的增殖,然后用细胞计数Kit-8 (CCK-8)分析确定LNT的生长抑制作用和Oxa ec - 109细胞。两个LNT(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)和Oxa(图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)降低ec - 109细胞的生长和细胞毒性是反向与药物浓度和持续时间的治疗以细胞增值速度。下面的公式是用来估计细胞生存能力:gydF4y2Ba

我们使用流式细胞仪和一个膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) / propidium碘(PI)细胞凋亡测定来确定ec - 109细胞的细胞凋亡率与LNT治疗后48小时,看看LNT ec - 109细胞生长的抑制作用相关的凋亡诱导作用。ec - 109细胞的细胞凋亡率增加剂量依赖性的方式随着LNT浓度增加,类似于CCK-8实验的结果。这些发现表明LNT诱导细胞凋亡在ec - 109细胞(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

2.2。LNT增强Oxa ec - 109细胞的敏感性gydF4y2Ba

使用药物组合在恶性肿瘤的治疗实践是一个频繁的练习。LNT的合相的影响,Oxa ec - 109细胞的增殖和凋亡是评估使用CCK-8化验和流式细胞术,看看LNT和Oxa可能增加的细胞增殖抑制活性和凋亡诱导效应Oxa ec - 109细胞。结果探索它,和TLN Oxa结合显著提高增殖的抑制作用和Oxa ec - 109细胞的凋亡诱导效应(数字gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

使用qPCR和免疫印迹分析,我们研究了伯灵顿的mRNA和蛋白表达水平,bcl - 2,和半胱天冬酶3在ec - 109细胞的结合LNT, Oxa与mRNA和蛋白表达水平升高有关的基因参与凋亡通路。结果显示LNT的有效性和Oxa伯灵顿和半胱天冬酶3 mRNA和蛋白表达增加(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba而抑制bcl - 2 mRNA和蛋白表达(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba(数据gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

结合指数(CI)是一种重要的测量指标来评估药物之间的相互作用的程度。一个gydF4y2Ba 表示,可能有两种药物之间的协同影响,gydF4y2Ba 表明2药物是敌对的关系,和一个gydF4y2Ba 表示两种药物的累积效应。了解更多关于如何LNT机制和Oxa确定这是一个累积或协同效应机制,我们分析了组合指数(CI)使用CompuSyn软件。结果表明,CI是< 1,这意味着Oxa和LNT联合行动ec - 109细胞主要是协同(图gydF4y2Ba3 (e)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

2.3。LNT增强ec - 109细胞的敏感性Oxa通过激活免疫原性细胞死亡通路在ec - 109细胞gydF4y2Ba

免疫原性细胞死亡(ICD),控制细胞死亡的一种,与抑制(有关分子模式),这发生在抗原释放细胞,导致细胞伤gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。已经表明,LNT能促进H22细胞死亡通过诱导表达更多CALR, HMG1, HSP70 H22细胞的表面。我们进一步研究了如何LNT, Oxa治疗相结合,提高Oxa-induced使用ELISA ec - 109细胞凋亡,存在的分析,和免疫印迹分析测量水平的关键分子与ICD和ATP,除了流式细胞术评估表面(细胞)免疫抗原的表达ec - 109细胞。上层清液的ELISA结果显示明显高于CXCL10和IL17 (gydF4y2Ba )gydF4y2Ba和显著调节以及HSP70水平(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba上层清液的LNT和Oxa + LNT组织与控制有关。HMGB1的相对mRNA表达水平、CALR ANXA1, IFNA1相当大(gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba虽然HSP70的相对蛋白质表达水平,一半,和CALR急剧增加,据中存在的结果和免疫印迹研究(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba这些结果表明,LNT可以增强Oxa毒性细胞通过激活ICD的释放蛋白质在ec - 109细胞(图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3所示。材料和方法gydF4y2Ba

3.1。细胞培养gydF4y2Ba

人类食管黑色素瘤ec - 109细胞(中国科学院上海细胞库,上海,中国)一直在培养rpmi - 1640完全培养基(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)含100 U /毫升青霉素和链霉素(表达载体)和10%胎牛血清(表达载体)37°C孵化器有限公司为5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

3.2。CCK-8化验gydF4y2Ba

细胞计数Kit-8 (CCK-8)测试(Beyotime生物科技、上海、中国)用于计算细胞存活率。ec - 109细胞对数生长期采集和种植密度在96 - 5000细胞/好盘子,然后,细胞连接和融合增长到60%,并且每个板孵化24或48 h与相应浓度的药物。盘子里然后在37°C孵化后1 - 4小时10毫升CCK-8解决方案被介绍给每一个。细胞存活率百分比被估计为每个组通过检测光密度值在450 nm (OD450),如下:gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba

3.3。使用CompuSyn软件分析药物的协同作用gydF4y2Ba

基于CCK-8测试的结果,ODgydF4y2Ba_{450年gydF4y2Ba}价值和存活率比例在每个药物浓度与CompuSyn获得和分析软件(ComboSyn Inc .)、帕拉默斯(NJ), 2005年。gydF4y2Bahttp://www.combosyn.comgydF4y2Ba(捐赠给生物医学社区免费下载,注册后,8月1日开始。2012年通过gydF4y2Bahttp://www.combosyn.comgydF4y2BaPD科学LLC)。]。如果gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba这种药物有协同效应,值越小,更重要的协同效应;如果gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba这意味着该药物有累积效应;如果gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba这意味着药物具有拮抗作用,价值更大的价值,更重要的拮抗效应。gydF4y2Ba

3.4。细胞凋亡检测gydF4y2Ba

确定细胞死亡的方式,研究人员使用一个膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC) / propidium碘(PI)细胞凋亡检测设备(Keygentec、南京、中国)(细胞凋亡与坏死)。所收集的细胞在步骤2.2中,指数期生长ec - 109细胞收获,镀在96 -孔板,并接受适当的药物剂量。流式细胞仪是用于检查ec - 109细胞对数生长期的细胞凋亡使用膜联蛋白V-FITC /πdouble-staining方法。从每个小组收集细胞,离心,享年1000岁gydF4y2BaggydF4y2Ba35分钟,洗两次预冷磷酸盐(PBS),最后resuspended浓度gydF4y2Ba /毫升。gydF4y2Ba

250毫升的那时细胞悬液混合稀释绑定缓冲,和100毫升的混合物放入5毫升流式细胞术管。细胞悬液混合好,孵化15分钟后在黑暗中在环境温度增加5gydF4y2BaμgydF4y2BaL的膜联蛋白V-FITC和10gydF4y2BaμgydF4y2BaL 20 g / mLπ的解决方案。的细胞悬液后使用流式细胞仪检测400 L PBS添加到反应管。gydF4y2Ba

3.5。量化的分泌ATP, IL-17 CXCL10, HSP70,一半gydF4y2Ba

48小时后的孵化800 g / mL LNT Oxa或20米,收集上清液,细胞颗粒离心后丢弃(15000 rpm, 30分钟)。免疫印迹分析和酶联免疫吸附分析被用来评估的数量IL17, CXCL10, HSP70,一半释放到上清液(ELISA)。根据制造商的指示,上层清液中总蛋白质含量是决定使用皮尔斯bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验设备(热费希尔科学Inc .)、沃尔瑟姆,妈,美国)。后上层清液中总蛋白质含量的测定,能整除的20 - 30克的蛋白质结合加载缓冲区,在沸水浴煮5分钟,并冷却到室温。整除被分离的蛋白质10% sds - page凝胶和转移到PVDF膜使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)。膜被阻塞1小时在室温下用5%的脱脂奶粉Tris-buffered盐水(TBS)含0.1% Tween-20 (TBST),紧随其后的是隔夜孵化与主要抗体特定HMGB1 (Sigma-Aldrich 1: 1000年,伯灵顿,妈,美国)。之后,膜清洗和孵化与二次抗体结合辣根过氧化物酶(1:2000年,MilliporeSigma)(合)。参考蛋白质牛血清白蛋白(BSA)。此外,IL17的水平、CXCL10 HSP70,一半在收集上清液测定使用IL17根据制造商的指示,CXCL10, HSP70,一半ELISA试剂盒(克隆云,武汉,中国)。化学发光ATP测定工具被用来确定收集ATP的上层清液(A22066,英杰公司,上海,中国)。 The fluorescence decay was measured using a luminometer after separately mixing each collected supernatant with the chemiluminescent ATP determination kit reagent (containing the reaction mixture of the luciferin and firefly luciferase without ATP). A series of ATP standard curves were developed with varied ATP concentrations to determine the quantity of ATP in the supernatant.

3.6。定量实时聚合酶链反应(qPCR)分析gydF4y2Ba

试剂盒试剂(英杰公司)是用于从细胞中提取总RNA不同治疗方法根据制造商的指示。整个RNA然后利用将信使RNA cDNA使用逆转录工具包(美国WI Promega公司麦迪逊;猫# A2801)。的相对表达水平gydF4y2Ba伯灵顿gydF4y2Ba,gydF4y2BaBCL2gydF4y2Ba,gydF4y2BaCASP3gydF4y2BaCALR,gydF4y2Ba一半gydF4y2Ba,gydF4y2BaHSP70gydF4y2Baec - 109细胞被qPCR测量分析qPCR大师混合工具包(猫# A6000;Promega公司),使用gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba作为内部参考。2 -△△gydF4y2Ba^ctgydF4y2Ba方法利用计算相对mRNA表达水平。gydF4y2Ba

3.7。免疫印迹分析gydF4y2Ba

提取的蛋白质浓度测定采用BCA蛋白质分析工具从ec - 109细胞总蛋白提取后的三个治疗组根据设备指令(热费希尔科学Inc .)。利用sds - page分离蛋白质,随后转移到PVDF膜节中描述。免疫印迹分析以下抗体被用来评估蛋白表达水平的伯灵顿,BCL2,半胱天冬酶3 CALR,一半,和HSP70: anti-BAX(猫# ab3191;Abcam,剑桥,英国),anti-BCL2(猫# ab196495;Abcam)、anti-Caspase 3(猫# ab179517, Abcam) anti-HSP90(猫# ab203085, Abcam)和anti-HSP70(猫# ab2787, Abcam)。免疫印迹分析利用anti-GAPDH(猫# ab8227;Abcam)作为内部参考蛋白质。gydF4y2Ba

3.8。统计分析gydF4y2Ba

数据从三个独立研究提供平均标准偏差。单向方差分析被用来发现不同群体之间在统计分析。所有的分析都使用IBMSPSS统计21.0进行。的差异gydF4y2Ba 被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

人类肿瘤发病率和死亡近年来一直稳步上升,食道癌的发生率,尤其是,仍然很高。肿瘤复发的主要原因之一或困难的治疗是弱免疫原性或缺乏肿瘤抗原的表达,和身体的免疫耐受肿瘤会导致逃避反应肿瘤攻击时的身体,导致治疗失败(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。因此,降低肿瘤耐药性和改善肿瘤免疫原性食管肿瘤治疗成功的关键。gydF4y2Ba

越来越多的自然免疫原性增强物质收到研究人员越来越多的关注。传统化疗或放射疗法的药物的组合与天然植物提取物用于减少化疗或放射疗法的药物的抗肿瘤,同时增加化疗的有效率的行动或放射疗法的药物(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。目前,天然植物提取物被认为是有效提高药物疗效,降低毒性物质,广泛应用于各种癌症。从自然中提取的多糖复合物香菇已广泛应用于临床实践。lnt已被证明有抗氧化剂、tumor-metastatic tumor-proliferative,体内免疫调节活动gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。然而,tumor-inhibitory活动的具体机制尚不清楚。这项工作调查了体外细胞水平的增加肿瘤抑制的影响LNT结合Oxa通过激活ICD在食道癌细胞阐明LNT独特的行动模式的食道癌Oxa治疗后抑制。gydF4y2Ba

大量的研究表明,LNT和Oxa可以显著抑制肿瘤增殖,转移和入侵。LNT报道抑制SHG-44人类神经胶质瘤细胞(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba],MCF-7人类乳腺癌细胞HepG2人类肝癌细胞(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba不同程度,可以作为辅助结合化疗药物对肿瘤抑制作用(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。Oxa是一种常用的以铂为基础的化疗剂和与其他药物联合使用。LNT结合紫杉醇、顺铂有效抑制胃癌细胞生长和促进细胞凋亡,和LNT与顺铂的不利影响减少到最低限度的顺铂,可以成功地提高肺癌患者的生活标准。张等人证明(gydF4y2Ba10gydF4y2BaLNT)可以调节自噬和凋亡抑制直肠癌的发展。LNT和Oxa发现H22-bearing小鼠有显著的协同抗肿瘤效应,有效减少了有毒副作用Oxa所致。LNT的抗增殖作用和Oxa ec - 109细胞的时间和剂量依赖,根据研究结果。联合治疗组明显显示抑制细胞增殖而LNT或Oxa孤单。此外,CI与CompuSyn分析软件还表示LNT结合Oxa协同抗增殖的影响。流仪分析显示,ec - 109细胞凋亡明显高于posttherapy在LNT和比单独使用Oxa Oxa (gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba这意味着两种药物组合可能通过增加细胞敏感性Oxa抑制细胞增殖。gydF4y2Ba

ICD是一种不同类型的控制细胞死亡,从而抑制相关从细胞相关抗原的释放导致肿瘤细胞生产伤(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。从细胞表面抗原分子释放区域是ICD的重要标志之一,包括ATP, HMGB1,一半,HSP70。天然植物提取物已被证明是有效的调查能够诱导的分泌增加ATP,一半,并从肿瘤细胞HSP70可更有效地抑制肿瘤的生长、扩散和转移。王w . et al。gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)表明,LNT能促进H22细胞死亡CALR诱导表达,HMG1, HSP70 H22细胞的表面。类似的结果在这项研究中,一个显著增加CALR水平被发现的文化上层清液LNT-treated ec - 109细胞,这表明CALR从细胞内转移到细胞表面,进而促进ICD在ec - 109细胞。Oxa没有发现有一种角色可以促进ICD Oxa-treated ec - 109细胞。LNT和Oxa被发现产生ATP的释放,CALR, HSP70,和一半的ec - 109细胞,增加ec - 109细胞的细胞死亡。gydF4y2Ba

本研究的优势是,这项研究证明了LNT在协助Oxa在食管肿瘤细胞的功能,这将为患者带来光明。然而,也有本研究的局限性。机制不明确澄清,需要进一步的研究。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

这项研究的结果显示,治疗的ec - 109细胞LNT和Oxa显著增加ATP水平和释放CALR和其他免疫原性与细胞凋亡相关的信号物质,这增加了细胞凋亡率同时增加autoimmunogenicity。在未来的研究中,我们将分析ec - 109细胞诱导的ICD过程LNT结合铂及其具体的作用机理和途径。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

支持本研究使用的数据可以从相应的作者。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

一位霍和甄裴的贡献同样这项工作。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项研究受到了2020年科技创新项目的学院和大学山西(2020 L0394)。gydF4y2Ba