文摘
客观的。探讨TLR4基因基因在炎症性肠病的作用。方法。DSS小鼠模型建立了诱导BALB / C和5% DSS的解决方案。DSS老鼠的行为被发现,m6A修改被m6A甲基化芯片检测。同时,TLR的表达式和基因被荧光实时定量PCR检测。结果。结果表明,葡聚糖硫酸钠结肠炎小鼠模型是成功的,和小鼠的结肠膜明显肉眼炎症。通过比较,发现有差异m6A修改之间的空白组和模型组与空白组相比,PKD1 DSS组的表达显著降低,TLR4的表达显著增加。结论。TLR4抑制抑制炎性反应在炎症性肠病(IBD) m6A-dependent方式通过调节PDK1-induced代谢重编程。
1。介绍
炎症性肠病(IBD)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病与不清楚病因,主要包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。许多因素,如遗传、环境、感染、发病机制和免疫,其中肠道炎症和免疫功能紊乱中发挥重要作用1]。遗传易感性差异可以部分解释了IBD的发病机理。随着分子生物学技术的进步,表观遗传学的方法来调节基因的表达,逐步探索和建立在IBD,及其与炎症性肠病的关系尤其密切(2]。成熟的研究DNA甲基化。DNA甲基化的变化修改建议在IBD患者的外周血或结肠组织(3,4]。核糖核酸甲基化是近年来新发现的表观遗传修饰的RNA,它可以调节信使核糖核酸(mRNA)的表达。最常见的改性方法是N6-methyladenine (m6A)。越来越多研究RNA甲基化和疾病,包括肿瘤、神经系统疾病、肥胖、和免疫反应,但与炎症性肠病的关系还不清楚。
M6A修改涉及几乎所有方面的RNA代谢。它会影响信使rna和蛋白质的表达水平影响信使rna前体拼接,信使rna运输、退化和调节信使核糖核酸的翻译,是推测的基础m6A参与炎症性肠病炎症和免疫调节。因此,本研究探讨了PDK1-induced代谢重编程和m6A之间的关系。
树突状细胞(dc)是抗原递呈细胞,协调身体的保护性免疫和免疫耐受。他们的迁移和活化异常加重肠道粘膜炎症5]。发现m6A甲基化促进了DCS的激活,m6A修改的水平增加了在DCS的成熟,和信使rna的转录和翻译表达CD40, CD80、适配器和人数/ il - 1受体蛋白质m6A修改后增加,促进toll样受体(TLR) 4 / NF-1κB通路介导炎性因子生产和T细胞激活(6]。同时,一些研究表明,基因和TLR4之间有密切的关系。因此,本研究研究了抑制TLR4通过调节PDK1-induced代谢重编程和抑制炎症反应在炎症性肠病(IBD) m6A-dependent的方式。
2。方法
2.1。建立DSS模型大鼠结肠炎
葡聚糖硫酸钠(DSS)的分子量5000年是溶解在蒸馏水和准备5% DSS的解决方案。BALB / c小鼠被允许自由饮用7天建立小鼠急性结肠炎模型。日期的建模、体重、活动、饮食、大便特点,血液和粪便的老鼠每天观察(粪便隐血检测到联苯胺法),和老鼠的疾病活动指数(DAI)是得分7]。
2.2。结肠的分数
之日起7天内建模后,老鼠被颈部断裂和位错方法和剖腹手术,肛门被送往的第一部分肠梗阻的结肠,结肠是减少纵向肠系膜的边缘。洗后预冷生理盐水,观察小肠的一般形态在解剖显微镜下(8]。
2.3。通过结m6A-Modified甲基化芯片
两组肠组织样本被小肠镜活检时,用0.9%氯化钠溶液洗净,放入EP管含有RNA保护解决方案,在液态氮冷却,并存储在冰箱里在-80°C。m6A m6A修改的变化进行检测甲基化芯片(9]。
2.4。rt - pcr检测
从小鼠结肠组织中提取总RNA,后测量吸光度( )值在260 nm和280 nm)分光光度计下带RNA样品a260 / A280 1.8 ~ 2.0,并根据指令的cDNA第一链合成cDNA合成装备。实时逆转录聚合酶链反应是由使用说明书中所描述的步骤的荧光定量检测装备,和反应是由PCR仪。三个多井为每个样本对应的相同基因实时rt - pcr (10]。
2.5。统计分析
本研究中所有实验数据表示为 。两组数据比较由一个独立的样本 - - - - - -比较的数据测试和多个组单向方差分析。所有统计分析被GraphPad棱镜8软件完成。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。观察小鼠的一般状态
DSS喝水后第一天,每个鼠标在模型组体重增加,喝更多的水,吃更多的食物。后第三天喝DSS,老鼠的体重减少,他们的头发是乏味的,喝酒和吃显著降低,他们的粘液是稀疏的,其中一些在粪便隐血阳性,症状逐渐加重;4 th-5th天DSS喝水后,一些老鼠更严重的症状,如血便,明显的减肥,松散的头发,懒惰,精神抑郁。老鼠死于建模的第六天。的实验中,模型组的两只老鼠死了。在实验中,小鼠的正常对照组大便正常,体重增加,闪亮的头发,饮食,活动,和精神状态,不会死亡。
3.2。凳子上的变化特征
在管理的过程中,对2模型组小鼠在政府后,第二天便溏4小鼠黄色绿色或淡黄色便溏或半便溏第三天,其中3老鼠正大便隐血,2小鼠血腥的粪便和血液在肛门第四天,然后,症状逐渐恶化。至少3小鼠血液在肛门的观察。结合不同的分数,这是证明了建模是成功的。
3.3。体重变化
如表所示1没有显著差异,在每组小鼠的体重在实验之前。实验后,喝DSS模型组小鼠的体重显著下降,和重量差异(实验前和实验后的区别)明显不同于正常对照组小鼠。
3.4。m6A的表达式
与空白组相比,有11个m6A修改不同m6A DSS组,包括7修改调节和4修改表达下调。
3.5。基因的表达和TLR4被rt - pcr检测
与空白组相比,基因的表达下调,TLR4的表达显著调节数字1和2。
4所示。讨论
炎症性肠病(IBD)是一种慢性复发性非特异性肠道炎性病变,包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。它的发病机制目前尚不清楚(11- - - - - -14]。动物模型的应用起着重要的作用在其发病机理的深入研究。葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎最常用的动物模型之一。从这个实验可以看出,BALB / c小鼠开始减肥,枯燥的头发,显著降低吃吃喝喝,宽松的粘液,和一些有积极的粪便隐血3天后免费饮用5%葡聚糖硫酸钠(DSS)。在饮酒后第四天DSS,一些老鼠血便,明显的减肥,松散的头发,懒惰的运动,精神抑郁。之后,喝的时候5%葡聚糖硫酸钠(DSS)逐渐延长,上述症状逐渐加重。上述结果也证明的结肠炎模型葡聚糖硫酸钠(DSS)在小鼠体内成功,这再次验证了BALB / c小鼠可以喝5% DSS自由,这是更好的动物模型研究的炎症性肠病(15,16]。
肠黏膜炎症和免疫系统异常的主要机制是炎症性肠病(17,18]。通过RNA序列和功能富集分析,差异表达基因mettl3击倒后炎症反应密切相关的信号通路(19,20.]。M6A可以调节关键因素的表达参与天然免疫与适应性免疫的过程中通过调节RNA拼接,稳定,和其他机制,影响免疫细胞的功能,并导致异常的过程中免疫调节。先天免疫反应是肠道粘膜免疫的第一防线,包括树突细胞、巨噬细胞和其他免疫细胞白介素(IL)和肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子α)),和其他细胞因子,包括核因子-κ核因子B (κB (NF -κB))。一系列的信号转导因子如MAPK、雅斤/激酶,Jan信号激酶被激活。各种各样的非特异性炎症介质和促炎细胞因子在IBD患者的结肠显著增加。树突状细胞(dc)是抗原递呈细胞,协调身体的保护性免疫和免疫耐受。他们的迁移和活化异常加重肠道粘膜炎症21- - - - - -27]。发现m6A甲基化促进了DCS的激活,m6A修改的水平增加了在DCS的成熟,和信使rna的转录和翻译表达CD40, CD80、适配器和人数/ il - 1受体蛋白质m6A修改后增加,促进toll样受体(TLR) 4 / NF-1κB通路介导炎性因子生产和T细胞激活(28]。M6A可以参与调节DCs的迁移从外围到淋巴结。刘等人。29日)发现,非编码RNA (LNC-DPF3) m6A修改。后m6A脱甲基,LNC-DPF3的表达增加,抑制DCS迁移和炎性反应的影响糖酵解途径由缺氧诱导因子- 1。
PIP3 PI3K被认为是产生的胰岛素的第二信使。PIP3不能直接激活一种蛋白激酶/ PBK但总Akt PBK细胞膜,改变结果。PI3K和基因上游和下游通路在细胞30.,31日]。他们是密切相关的关键环节各自的代谢调节。PIP3由PI3K可以激活的基因和总Akt蛋白在细胞膜上。基因的作用下,磷酸化丝氨酸磷酸化网站437 (ser437)和苏氨酸磷酸化网站308 (thr308) Akt蛋白和Akt信号通路(32]。
作为一种重要的模式识别受体,通常可以感觉到病原微生物的存在和产生的免疫炎症反应及时认识到相应的病原体相关分子模式(pamp),最后激活获得性免疫系统(33]。通常的重要作用人体的免疫反应被许多学者认可。最近,它也被认为是一种肠道免疫反应的物质,也扮演着重要的角色在维护肠膜体内平衡。目前,一些学者认为,环境(肠道菌群,肠粘膜屏障,食物抗原,等等),人体的免疫反应,与遗传易感性作为一个整体共同影响的功能通常在肠膜扩张。当之间的相互调节关系三个是不平衡的,它将导致异常TLR信号转导,最终导致急性和慢性炎症的发生和发展的结肠炎症性肠病(34]。一些学者还认为,炎症性肠病是免疫耐受的不平衡引起的肠道免疫系统正常肠道菌群变化的环境因素在易感个体33- - - - - -35]。这个实验发现TLR4的表达显著增加结肠癌的DSS老鼠。
5。结论
TLR4的表达和PKD1基因在DSS结肠炎小鼠的结肠膜是相关的和一致的,这表明他们可能发挥协同作用DSS诱导小鼠结肠炎的发生和发展,共同促进和加剧炎症反应的发生和持久性。我们推测TLR4在炎症性肠病引起的炎症反应是由m6a抑制。
数据可用性
使用的数据集和分析在当前研究可从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。