文摘

慢性炎症能刺激动脉粥样硬化斑块的形成和发展,增加斑块的脆弱性。然而,很少有研究在治疗颈动脉炎性斑块的变化。我们的研究试图调查使用的超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPION)超声成像检测血管细胞粘附的表达molecule-1 (VCAM-1)患者颈动脉斑块的影响并分析SPION超声成像在炎症斑块可视化效果。SPION微泡造影剂具有良好的体内和体外成像效果。我们共轭VCAM-1蛋白质微气泡包裹在SPIONs形成SPIONs携带VCAM-1抗体。观察SPIONs携带的信号强度VCAM-1抗体动脉炎斑块。结果表明,SPION造影剂携带VCAM-1抗体有更高的峰值灰度视频强度比其他两组造影剂没有携带VCAM-1抗体。这表明SPIONs在超声成像出色的成像效果,可以评估动脉斑块病变的炎症反应,具有重要意义,研究颈动脉炎性斑块的变化。

1。介绍

颈动脉斑块(CAP)是脂肪和钙的沉积内壁的颈动脉,颈动脉粥样硬化的一个重要表现。动脉粥样硬化斑块的破裂会导致血栓形成,导致心血管和脑血管事件(1]。高脂血症帽疾病密切相关。炎症会导致斑块形成和加速斑块形成的速度(2]。因此,炎症斑块的识别在心血管和脑血管事件的发生起着重要的作用在心血管和脑血管疾病的预防和诊断。

临床动脉粥样硬化斑块成像技术检查主要包括数字减影血管造影(DSA),血管内超声成像(IUI)、磁共振血管造影(MRA)、彩色多普勒超声血管检查(CDF),和计算机断层扫描血管造影(CTA) [3- - - - - -5]。DSA是检测帽的“黄金标准”,但DSA是一种侵入性检查和高成本,并发症。它只能判断动脉血管腔的狭窄程度,不能显示动脉血管壁的组成和动脉粥样硬化斑块。CTA和MRA可以确定颈动脉狭窄的程度,也可以评估脆弱的斑块,但由于审查过程复杂,成本高,他们没有被广泛应用于临床实践。超声成像的优点是实时的,没有损伤,没有放射性,等等。这是目前的首选影像学诊断。

虽然传统的超声造影剂在诊断准确性并不差,很难满足精度的要求,目标,同时和特异性6]。超声造影剂的不断发展,超声成像技术取得了很大的进步在组织灌注的内部器官,肿瘤诊断,检测炎症。然而,由于其低空间分辨率,成像结果的性能并不完美(7]。因此,寻求最佳成像效果的对比剂是具有重要意义的准确检测颈动脉斑块。

磁性纳米颗粒是一种新型的示踪材料用于成像近年来诊断。磁性纳米颗粒的表面改性时由特定有机/无机聚合物,其功能更有区别。例如,基团的粒子可以跟踪一些生物活性分子,能具体地绑定到粒子表面(8]。当磁性材料在外部磁场的作用下,最初的磁矩将面向,因此表现出顺磁性(9]。超顺磁性意味着它的顺磁磁化率远远高于一般的顺磁材料在外部磁场的作用下。超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)是常用的转基因生物相容性的纳米颗粒和经FDA批准用作造影剂(10]。SPIONs可以改变纵向和横向弛豫时间增加图像对比度和提高分辨率(11]。SPIONs主要报道在磁共振成像,但很少在超声成像。因此,本文研究了成像SPIONs对颈动脉斑块超声成像的影响。

2。材料和方法

2.1。制备SPIONs

纳米铁₃O₄(铁₃O₄)是由solvothermal合成反应。菲₃O₄h·6₂O(1.089克,4.0更易),柠檬酸三钠(1.0克,3.4更易)和醋酸钠(2.4克,2.9更易)被添加到混合的45毫升的乙二醇和二甘醇15毫升。快速搅拌3 h 22°C。由此产生的黄色的解决方案被转移到100毫升压力锅内衬聚四氟乙烯和加热在200°C 10 h。然后,自然冷却到22°C。获得产品与乙醇和超纯水洗3次。最后,磁粉真空烘箱中干燥60°C和再分散在水中作进一步的使用。磁粉溶液均匀的分散1毫升15毫升的水。然后,添加50毫升mercaptopropyltriethoxysilane和150毫升氨(最终的浓度1.5%)。摇瓶的混合物在2000 rpm 1分钟。商店在22°C 18个小时。 Use a magnet to collect the lower layer, and disperse it in 5 mL of water. Methoxypolyethylene glycol maleimide (5 mg) was mixed in the solution. After incubating for 5 hours, the suspension was separated, collected with a magnet, and washed 3 times to obtain PEGylated magnetic nanoparticles. The particle size is 50 nm, and the concentration is 0.1 mol/L.

2.2。制备微气泡包裹在SPIONS

聚乳酸(PLA), )和聚乙烯醇(PVA的程度 , )从Sigma-Aldrich购买。溶解在10毫升CHCl3 0.5 g解放军。SPION解决方案和解放军的解决方案是混合均匀,然后,1毫升的双重蒸馏水和0.01毫升的跨越- 80被添加到解放军的解决方案。中国人民解放军的解决方案是引入N2(4毫升/分钟)以恒定速率,并在这个过程中,超声空化与振动计用于2分钟(功率200 W / s)来获取乳化微气泡。乳液微气泡涌入50毫升的5.0% PVA水溶液和搅拌在3000 r / min 22°C 2 h获得双乳液微气泡。在1500 r / min后离心5分钟20°C, SPION微泡造影剂。如图1(一),微型气泡封装SPIONs,和图1(b)是一个局部放大微泡膜壳封装SPIONs的照片。SPIONs均匀分布在聚合物膜壳。

2.3。SPION炎性粘连分子VCAM-1抗体

SPION微气泡分散在双重蒸馏水,在离心机在1000转3分钟,和上层的丢弃。SPIONs分散了0.1 mol / L MES缓冲区(pH值6.0),这是放置在一个离心机在1000转3分钟,和上层的丢弃。SPIONs再次分散0.1 mol / L MES缓冲区(PH6.0)。SPIONs与偶联剂添加EDC / NHS (PLGACOOH: EDC: NHS摩尔比1:10:20)和孵化了30分钟。冲洗2次,MES缓冲区(pH值6.0),然后用MES冲洗一次缓冲区(pH值8.0),在1000转3分钟离心机,丢弃上层清液。对比剂分散在MES缓冲区(pH值8.0)和添加anti-VCAM-1抗体过剩(美国Abcam)。anti-VCAM-1抗体的摩尔比率:造影剂是50:1和孵化2 h在室温下。与PBS缓冲液冲洗两次,除去游离anti-VCAM-1抗体。冲洗两次pH值7.0 PBS缓冲,离心机在1000转3分钟,丢弃浮层保持较低的层,并添加PBS驱散。

2.4。体外对比度增强超声成像

体外实验SPION微气泡进行使用白手起家的乳胶管。首先,准备脱气水,把去离子水超声波清洁2小时,和转让获得的脱气水水箱。医用乳胶管放置低于脱气水的表面。接下来,超声成像系统的探测是放置在液体表面和面临的乳胶管。用注射器吸取SPION微气泡的不同浓度( 粒子/毫升),慢慢地注入乳胶管的一端。比较脉冲序列对比模式的纵切面观察乳胶管。对照组注射生理盐水。

2.5。动脉粥样硬化大鼠模型

载脂蛋白E (ApoE)基因敲除老鼠被用来构造一个大鼠动脉粥样硬化模型。我们购买了6周大男性的载脂蛋白e基因敲除老鼠从Zhishan(北京)健康医学研究所。总共20大鼠体重200 - 250克被用来构建动脉炎斑块大鼠模型。所有的老鼠被安置在一个SPF动物房间22°C,在那里他们可以自由吃喝。光illumination-dark周期12-12 h。D12492高脂肪饲料用于鼠饲料;主要的公式含有60%的脂肪,20%的蛋白质、20%的碳水化合物。每日定期喂养,分别喂食时间是16周。此外,20流行男性正常老鼠相同的重量作为正常对照组和美联储购买一个普通饲料。

2.6。的表达在颈动脉VCAM-1被对比度增强超声检查

模型大鼠被分成组A和B组(10大鼠)使用SPIONs携带VCAM-1抗体,观察颈动脉血管造影的结果,和B组大鼠(10)使用不属预定目标的SPIONs观察颈动脉血管造影的结果。对比剂注入到老鼠后,每个时期的图像记录在1分钟,5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、2 h, 4 h, 8 h。Origin8.0软件被用来画time-intensity曲线。

2.7。血清脂类的决心

血液从尾静脉在实验前和实验后16周。上血清被送往测试总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(低密度脂蛋白)的老鼠。

2.8。病理检查

老鼠全身麻醉前给吸入异氟烷诱导麻醉。老鼠安静后,大鼠腹腔内注射麻醉了0.1毫升的1% thiopentone注入(稀释0.9%生理盐水和维护麻醉约20分钟)。麻醉成功后,老鼠是固定在解剖台上。常规消毒毛巾老鼠的脖子和传播。颈部皮肤的老鼠被纵向暴露颈动脉。颈动脉完全剥落后,很快就与4%多聚甲醛固定的解决方案。染色后,观察颈动脉斑块并与超声波的指数对比的结果。

2.9。统计分析

SPSS23.0软件被用来分析数据。机密数据被表示为(%),测试使用。定量数据是由( ),使用一个 - - - - - -测试。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。体外超声成像效果

不同浓度的SPION造影剂被用来执行体外超声成像的纵切面乳胶管。图2(一个)显示,与对照组相比,SPIONs乳胶腔有明显斑点状回声,回声继续增加对比剂的浓度增加(见图2 (b))。建议SPION对比剂在体外具有良好的成像效果,所以我们将分析SPION的成像效果对比剂在大鼠颈动脉斑块。

3.2。评价体内超声成像的影响

体内超声成像的超声波频率为5.0 MHz,获得51,MI≤0.10。通过尾静脉注射后SPION造影剂的老鼠,结果表明,颈动脉成像是完整,轮廓清晰,对比度增强是统一的,颈动脉斑块明显(见图3)。

3.3。对比度增强超声检查颈动脉炎症VCAM-1粘附分子的表达

从理论上讲,VCAM-1靶向造影剂具有特定的亲和力炎症斑块内,并且可以有效地坚持和驻留在炎症组织。造影剂没有VCAM-1没有炎症的具体关联。因此,我们观察到的信号强度SPIONs携带VCAM-1抗体模型大鼠。结果表明,模型具有较高的一组峰值灰度视频强度和较长的持续时间比其他两组(见图4)。这表明SPION造影剂携带VCAM-1抗体可以用来评估动脉粥样硬化病变的炎症反应。

3.4。大鼠的血清脂质水平

通过检查大鼠的血清TC和低密度脂蛋白水平,结果表明,TC水平和低密度的模型组明显高于对照组( ,参见图5)。结果表明,模型组的胆固醇是在高级别上,加速斑块的形成和发展。

3.5。老鼠的病理检查

他染色观察显示,对照组的颈动脉是清楚的。平滑肌是正常的,均匀的厚度。没有出现动脉粥样硬化斑块(图6(一))。在大鼠模型组的颈动脉,明显的动脉粥样硬化斑块在腔中伸出,成为小(图6 (b))。

3.6。讨论

为了研究SPIONs的超声波成像效果,首次评估体外超声成像的影响。我们用乳胶管模拟血管和注入脱气水和SPION对比媒体,分别观察SPIONs成像的影响。结果表明,脱气水注入到乳胶管的时候,只看到墙上的回声管腔,没有回声。SPION对比剂注射时,有明显的乳胶管腔点状强回声,SPION对比剂浓度的增加,回声增强。为了观察SPION的成像效果对比剂在大鼠颈动脉,我们使用的载脂蛋白e基因敲除大鼠模拟人类颈动脉炎性斑块的病理模型(12]。颈动脉粥样硬化是缺血性心血管疾病(CVD)的主要危险因素。ApoE是研究最多的蛋白质与心血管疾病的关系和脂蛋白的结构完整性至关重要,在脂质代谢中起着重要的作用,并负责改变循环胆固醇。APOE基因位于染色体19 q13.2,多态,和三个最常见的蛋白亚型E2、E3和E4。一般来说,ε2等位基因对应的意思是血浆胆固醇水平和较低的ε4个等位基因具有较高的水平。载脂蛋白e多态性似乎没有颈动脉斑块的发展的一个重要风险因素,但是先前的文献已经证明了一个重要的载体状态之间的关系ε4等位基因和颈动脉内膜中层厚度(cIMT’)12]。

后SPION造影剂通过尾静脉注射,观察大鼠的颈动脉与颈动脉斑块。结果表明,颈动脉与清晰的轮廓和完整统一的对比度增强。它表明SPION造影剂显示更好的对比度增强效果。SPIONs有良好生物相容性的优势,简单的表面改性等,在临床医学中有着广阔的应用前景。据相关文献报道,各种SPIONs已经批准用于磁共振成像(13),但很少有报道超声成像。因此,在这项研究中,我们装载SPIONs表面的聚合物微泡膜壳构建SPION微泡造影剂,可以实现超声成像的效果。和发现SPION微泡造影剂的浓度增加,发展继续增加。

目前,常用的生物标志物对于动脉粥样硬化的研究主要关注与炎症有关的指标,如细胞间粘附分子(ICAM-1)和血管内皮细胞粘附分子1 (VCAM-1),并与胶原蛋白分解。标记包括金属蛋白酶- 1、MMP-2、MMP-3 MMP-7, MMP-8, MMP-9 [14- - - - - -16]。VCAM-1结合其他粘附分子免疫监测和调节炎症反应(17- - - - - -19]。VCAM-1的表达是由细胞因子诱导的肿瘤坏死因子α和βinterleukin-1, adipokine visfatin,硬化的氨基酸同型半胱氨酸,患高血糖(20.- - - - - -23]。因此,为了探索识别SPIONs对颈动脉斑块炎症的影响,然后结合VCAM-1蛋白质,特别是结合微气泡的炎性粘连分子包裹在SPIONs形成抗体携带VCAM-1 SPIONs。和微泡超声造影剂携带VCAM-1抗体应用于颈动脉炎性斑块在老鼠身上的研究。我们观察到的信号强度SPIONs携带VCAM-1抗体动脉炎斑块。结果表明,SPION造影剂携带VCAM-1抗体有更高的峰值灰度视频强度和较长的持续时间比其他两组对比的代理没有携带VCAM-1抗体造影剂。这证明SPION造影剂携带VCAM-1抗体可以用来评估动脉粥样硬化病变的炎症反应。巴拉et al。24]VCAM-1作为目标,用氟18放射性标记的,使用正电子发射断层扫描观察VCAM-1的表达在动脉粥样硬化小鼠模型。结果表明,探测器的识别能力的表达VCAM-1与本文的结果是一致的。另一项研究表明,VCAM-1显示明显高于表情高风险(症状)和低风险的无症状的颈动脉斑块。VCAM-1能够维持高剪切的超声造影剂轴承配体附件,可以用于识别病人谁更激进的治疗是必要的25]。然而,舒马赫等人发现了类似的症状性斑块或低VCAM-1表达式;然而,他们的手稿不显示VCAM-1staining评价,他们不评价颈动脉斑块,最重要的是,他们正在评估总VCAM-1表达式而不是只有内皮表达式(26]。

为了验证模型大鼠的血脂水平是否处于高水平喂养16周后,我们检查了TC水平和低密度的老鼠。结果表明,TC水平和低密度的模型组显著高于对照组,在更高的层面,并可用于下一个实验。在这个实验中,为了验证是否老鼠与颈动脉炎性斑块的超声成像结果与实际结果一致,我们进行病理检查颈动脉的老鼠。他染色结果表明,动脉粥样硬化斑块突出的颈动脉的腔模型大鼠组与超声波成像的结果一致。限制是,我们通过设计,包括体内那些从他们的颈动脉疾病症状,也许不是结论性的考虑我们的研究模型是也不代表整个谱系疾病的严重程度,将质疑我们的研究结果的普遍性。颈动脉疾病患者应该在后续研究中探索。

4所示。结论

我们证明SPION微泡造影剂具有良好的成像效果体内和体外。我们观察到的信号强度SPIONs携带VCAM-1抗体动脉炎斑块。结果表明,SPION造影剂携带VCAM-1抗体有更高的峰值灰度视频强度比其他两组造影剂没有携带VCAM-1抗体。我们的数据都表明,SPIONs在超声成像出色的成像效果,可以评估动脉斑块病变的炎症反应,具有重要意义,研究颈动脉炎性斑块的变化。

数据可用性

所有的原始数据可以通过联系访问相应的作者如果任何合格的研究员需要他们。

的利益冲突

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