文摘

目标。前列腺癌(PCa)被认为是世界上最严重的癌症。然而,目前的生物标记的准确性,如病理分期,格里森评分,和血清前列腺特异性抗原(PSA)水平,是有限的。FOXO1是一个关键的下游效应器PTEN和PCA的肿瘤抑制,被广泛报道。然而,FOXO1在PCa的临床意义尚不清楚。方法。在这项研究中,我们第一次发现它的表达在四个公共数据库探索FOXO1的临床作用。验证的击倒效果FOXO1核是由实时PCR分析。变化在细胞生存能力评估使用细胞计数kit-8 CCK-8化验。此外,我们验证了影响FOXO1的PCa使用细胞周期测定细胞周期。结果。这里,我们发现FOXO1明显PCa的组织中表达下调,与格里森评分显著相关,年龄、生化复发(BCR),和淋巴结(LN)状态,而FOXO1表达独立的病理分期和术前PSA水平。kaplan meier生存分析显示,PCA FOXO1高表达患者不太可能发展BCR患者相比低FOXO1表达式。在功能方面,FOXO1抑制显著促进了PCa细胞的增殖和细胞周期的进展。结论。总之,我们的研究表明,FOXO1可能的预后因素之一描述为BCR PCa的风险。这些结果表明,FOXO1可能PCa的治疗目标。

1。介绍

前列腺癌(PCa)是一个男性恶性肿瘤,被诊断出患有全世界最高频率(1]。在中国,PCa发病率排名第七,和癌症相关死亡的主要原因之一,PCa(排名第十2]。目前,本地化的PCa,最常见的治疗属于根治性前列腺切除术(RP) [3]。不幸的是,对于一个长期RP后,生化复发(BCR)发生了大约25 - 60%的PCa患者(4,5]。格里森评分,病理阶段,血清前列腺特异性抗原(PSA)水平是主要的生物标志物的前列腺癌。然而,这些测试的准确性有一定的局限性6- - - - - -8]。因此,新的标志物的PCa对评估前列腺癌风险至关重要,复发,临床预后。

FOXO1,属于Forkhead框O (FOXO)蛋白质,在调节过程中生物过程很重要,含有葡萄糖体内平衡,细胞分化,细胞增殖、DNA损伤修复(9]。越来越多的证据表明,FOXO1 PTEN的主要下游效应器(10数组中)和人类的癌症包括前列腺癌(11- - - - - -13),胃癌14),和肺癌15),它作为肿瘤抑制基因。然而,FOXO1在PCa的临床意义尚不清楚。

本研究采用PCa的公共数据库探索FOXO1表达组织。接下来,FOXO1关系表达式与PCa患者不同的临床特征,包括年龄、病理阶段,LN地位,格里森评分,术前PSA水平和recurrence-free生存,TCGA统计评估基于数据集。我们也探讨了功能角色的FOXO1推倒在PCa的表达式。

2。材料和方法

2.1。数据源

本研究中使用的微阵列基因表达谱如下:GSE38241 [16],GSE55945 [17],GSE6919 [18]。

miRNA-seq数据和RNA-seq数据的下载提供的前列腺癌是癌症基因组图谱(TCGA,https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)数据门户。临床资料的情况下也收集,包括性别、解剖器官细分,定位肺实质,肿瘤状态,与肿瘤病理pT,与节点病理pN,与肿瘤病理阶段,与转移病理点,吸烟历史指标,表皮生长因子受体突变状况,针对有eml4 - alk易位地位,新的肿瘤事件dx指标,和重要的地位。

2.2。RNA干扰

购买特殊的小干扰rna (siRNAs)人类FOXO1 (sifoxo1 - 1461 5 - - - - - -CAATTCGTCATAATCTGTCCCTACA-3 ;sifoxo1 - 1325 5 - - - - - -CAACCTTCTCTCATCACCAACATCA-3 ;CAGAACGTCATGATGGGCCCTAATT sifoxo1 - 1731)和非特异性核(5 - - - - - -UAGCGACUAAACACAUCAA-3 )实现在GenePharma(上海,中国)。

2.3。细胞培养和转染

美式文化收集(马纳萨斯,弗吉尼亚州)提供了购买曲泽和LNCaP细胞,和他们确认是通过短串联重复序列(STR)分析。rpmi - 1640中用于培养细胞含有100 U /毫升青霉素,10%胎牛血清(Hyclone,南洛根,UT),和100年μg / ml链霉素,5%在37°C的环境有限公司2,这些细胞被培养。Lipofectamine 2000(技术)来帮助把这些细胞转染siRNAs。

2.4。实时rt - pcr

总RNA的提取完成后通过就业试剂盒试剂(表达载体)。完成了降级的cDNA通过PrimeScript RT试剂盒的性能(豆类、东京、日本)。根据制造商的协议,ABI棱镜7900平台(Bio-Rad大力神,CA)和SYBR绿色Supermix被用来放大cDNA样本。计算的相对表达水平与GAPDH是由利用水平 的方法。使用的引物序列如下:FOXO1(向前,5 - - - - - -TCGTCATAATCTGTCCCTACACA-3 和反向,5 - - - - - -CGGCTTCGGCTCTTAGCAAA-3 );GAPDH(向前,5 - - - - - -CTGGGCTACACTGAGCACC-3 和反向,5 - - - - - -AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 )。

2.5。细胞增殖实验

细胞生存能力的变化研究了通过CCK-8化验的性能。在96 -五千转染肿瘤细胞培养板。10μl CCK-8 (Dojindo、熊本、日本)已经被用来量化细胞的可行性。孵化后了两个小时,细胞生存能力在96 -孔板检测利用PowerWave XS标仪(美国BioTek Winooski, VT)。

2.6。细胞周期分析

转染48 h后,细胞持续了15分钟的孵化与PBS包含50 ng / ml propidium碘(π),0.03% Triton x - 100,然后100 ng / ml核糖核酸酶a, FACSCanto的流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)运行这些细胞的检测,和ModFit LT 3.0软件是用来分析细胞周期数据。

2.7。统计分析

显示的数据 (SD)不少于3决定。kaplan meier的分析来评价FOXO1之间存在的相关性和前列腺癌的预后,以及总体存活率。所有的测试都是双面的。这是统计学意义 低于0.05。并运用SPSS软件进行统计分析。

3所示。结果

3.1。FOXO1在前列腺癌表达下调

检测FOXO1的临床特征,本研究首先研究其表达在四个数据库(GSE38241, GSE55945 GSE6919, TCGA)。如图1与相邻的前列腺组织相比,在人类PCa组织,FOXO1 mRNA的表达水平明显降低。

(一)
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(b)
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图1
FOXO1在前列腺癌表达下调。对比FOXO1表达水平在正常前列腺组织和前列腺肿瘤所示四个基因表达数据,即GSE38241 (a), GSE55945 (b), GSE6919 TCGA (c)和(d),这些都是公开的意义如果 低于0.05 ( ; ; )。
3.2。减少表达FOXO1与PCa的积极进展

表1计算之间的相关性FOXO1 mRNA表达TCGA通过多样的特性。结果明确的下降表现之间存在相关性FOXO1表达式和年龄( ),BCR ( ),格里森评分( ),和LN状态( ),而没有发现关系之间存在FOXO1表达和病理阶段( )或术前PSA水平( )(所有表所示1)。

表1
PCa FOXO1表达和临床病理特征之间的相关性。
3.3。Downregulation PCa FOXO1与不良预后相关

如表所示1,FOXO1低表达患者经历BCR ( ;表1)。我们充分研究了影响FOXO1表情前列腺癌患者。在表2单变量提供的,有迹象表明Cox回归分析,相关性之间存在较高的格里森评分和FOXO1表达式和一个明显缩短生化recurrence-free生存(图2(一个))。

表2
多变量分析所有PCa BCR-free生存的病人。
(一)
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(c)
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(d)
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图2
kaplan meier曲线分析生化recurrence-free前列腺癌患者的生存。对比FOXO1表达水平在格里森评分( )前列腺肿瘤和格里森评分( )前列腺肿瘤TCGA所示(一个)。基于FOXO1的表达,FOXO1和格里森评分,和FOXO1和肿瘤pT(罪犯),分别为生化recurrence-free kaplan meier曲线在前列腺癌患者生存。意义是如果 低于0.05 ( ; ; )。

kaplan meier分析阐明,FOXO1-high患者相比,有较低的5年BCR-free患者存活率低FOXO1(图2 (b))。为了研究BCR的概率,我们还结合FOXO1表达与病理阶段。与那些FOXO1负面的言论相比,积极FOXO1染色有显著的BCR子集的概率 肿瘤和pT3/4(数据2 (c)和2 (d))。这些结果表明,高FOXO1表达可能是一个值得关注的PCa的预后指标。

3.4。击倒FOXO1促进前列腺癌的扩散

我们下一个验证的功能角色FOXO1 PCa细胞系。FOXO1 siRNA被用来降低其表达式。我们的研究结果表明,三个siRNAs反对FOXO1可以显著降低FOXO1 mRNA表达消极的控制(数据相比3(一个)和3 (c))。

(一)
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图3
细胞增殖在PCa细胞提升FOXO1击倒的。(a, c) FOXO1信使rna转染后的表达式表示siRNAs LNCaP PC-3cells。(b, d)细胞增殖在LNCaP (b)和曲泽(d)细胞提升FOXO1击倒的。每个实验进行了一式三份( )。数据记录的 ( ; ;学生的 - - - - - -测试)。

然后我们研究FOXO1涉及细胞增殖功能的曲泽LNCaP细胞通过CCK-8化验,发现击倒的FOXO1可以显著抑制前列腺癌的细胞增殖。( ;数据3 (b)和3 (d))。如果细胞生长可能揭示了细胞周期的数据,我们使用流式细胞术研究FOXO1 LNCaP的功能在细胞周期的资料(图4(一))和曲泽(图4 (b))细胞。在G1期细胞的比例放大,在S期( )公布了推倒FOXO1 LNCaP和曲泽细胞。这些研究结果显示,通过加强细胞周期进展,FOXO1提升曲泽和LNCaP细胞的增殖和生长。

(一)
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(b)
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图4
在PCa细胞细胞周期提升FOXO1击倒的。在LNCaP (a)和曲泽(b)细胞,细胞的百分比在G1期减少,S期增加了FOXO1击倒。意义是如果 低于0.05 ( ; ; )。

4所示。讨论

PCa是全世界严重的癌症。然而,目前的生物标记的准确性,如病理阶段,格里森评分,和血清PSA水平,有一定的局限性。在这项研究中,我们已经确定,FOXO1尤其是各个主成分分析PCa的组织中表达下调,相关病人的临床功能和不良的生存状况。我们还发现,击倒FOXO1大大促进了PCa细胞的扩散和发展。

越来越多的证据表明,FOXO1多种人类恶性肿瘤中表达下调包括宫颈癌(19],乳腺癌[20.],endometrioid子宫内膜癌(21]。然而,PCa FOXO1的临床相关性仍澄清。本研究研究FOXO1表达四个公开数据库和发现FOXO1特别是在PCa样本中表达下调。之间的相关性降低表达FOXO1表达式和BCR ( ),格里森评分( ),LN状态( ),和年龄( )(所有表所示1TCGA)已经证明了数据分析。这个分析也证实FOXO1表达式不相关的病理阶段( )和术前PSA水平( )(所有表所示1)。kaplan meier的结果,我们已经证明,与FOXO1-low患者相比,PCa患者高FOXO1表达式获得BCR潜力很低。

FOXO1 PTEN的主要下游效应,广泛报道作为一个肿瘤抑制PCa。在PCa其他监管机构,包括基于“增大化现实”技术的途径和microrna的,还可以抑制FOXO1的表达。黄等。22]表明,雄激素消极监管FOXO1表达式通过蛋白水解机制。最近,一系列microrna的报告还显示,包括mir - 182 (13和mir - 9612),促进了PCa过程通过抑制FOXO1表达式。也在这个研究中,我们评估的功能FOXO1击倒的主成分分析,发现FOXO1极大地推动LNCaP曲泽细胞增殖和进步,这符合先前的研究。

这项研究有一些局限性。首先,信使rna和蛋白质水平的FOXO1需要在临床样本验证。第二,要收集临床样本,进一步探索FOXO1的临床价值。在未来的研究中,我们将收集更多的前列腺癌患者样本探索FOXO1表达式之间的关系和临床参数(包括临床分期、年龄、和生存时间)。

5。结论

总之,我们的研究表明,FOXO1可能预后因子的预测BCR PCa的风险。此外,PCa的扩散和发展是提升显著FOXO1击倒的。这些结果表明可能FOXO1 PCa治疗的目标。

数据可用性

所有数据分析在本研究从发表文章或可从获得相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Ning杨、吴Jiawen和梁秦负责概念和设计。Jiawen吴、杨风扇和张他是负责开发的方法学。Ning杨和金燕邵负责样本集合。梁张他,秦,天成张负责数据的分析和解释。Ning,金燕邵,张他和梁秦负责写作,评论,和/或修改的手稿。Ning杨和吴Jiawen贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的闵行区卫生委员会(授予数量:2019 mw09;申请人:Jiawen Wu)和闵行区科委自然科学基金(授予数量:2020 mhz070;申请人:Jiawen Wu)。