文摘
背景。防治(NAC)施加抗氧化和抗炎效应对慢性阻塞性肺病(COPD)患者。然而,它的作用在调节白介素- 18 (IL)并不完全理解。本研究旨在评估NAC的具体机制调节的地震。材料和方法。共有112名慢性阻塞性肺病患者和103个健康个体中招募了研究。患者血清中细胞因子水平测定,酶联免疫吸附试验(ELISA)。COPD小鼠模型建立了政府的脂多糖(LPS)和香烟。细胞因子的表达被ELISA和流式细胞仪测量。通过免疫印迹Inflammasome-related蛋白测定。结果。NAC能有效改善慢性阻塞性肺病患者的免疫状态以及慢性阻塞性肺病小鼠模型的表达下调proinflammation和炎症细胞因子il - 1β,干扰素(IFN)γ,肿瘤坏死因子(TNF)α和地震。它也有能力抑制合成的地震在巨噬细胞抑制干扰素的分泌γ从自然杀伤(NK)细胞通过影响inflammasome-related巨噬细胞的蛋白质。结论。NAC能有效地抑制生产的地震-通过抑制NLRP3巨噬细胞中表达降低干扰素的生产γ在NK细胞。
1。介绍
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种常见的慢性呼吸道疾病,它是由几个经典的临床特征,如慢性气流阻塞,通常进步,几乎不可逆转,吸入造成的慢性支气管炎,和小气道损伤。这种致命的疾病的患病率在世界范围内急剧增长,预计将死亡的第三大原因,让一个伟大的世界的疾病经济负担1,2]。
防治(NAC)是一种黏液溶解的和抗氧化剂药物也可能影响一些炎症通路。它提供了含巯基的组织和行为减少谷胱甘肽的前体,直接活性氧(ROS)清道夫,从而调节细胞的氧化还原状态。口服NAC已经证明它对减少氧化和炎症的影响在肺癌和外周血和呼气呼吸冷凝,以及减少COPD恶化的速度(3- - - - - -5]。
近年来,越来越多的研究倾向于阐明COPD的炎症相关的机制,特别是复杂的细胞因子的调控机制。细胞因子发挥重要作用形成的炎症和气道阻塞的病理生理机制哮喘和慢性阻塞性肺病。肿瘤坏死因子-α是一个经典的促炎的分子参与了COPD的发展和支气管哮喘(BA) (3,6]。在目前阶段,实验数据和临床研究结果的可能参与phlogogenic分子如IL-17和地震成因的气道阻塞性疾病出现(6- - - - - -8]。Interleukin-17(以前称为IL-17A)是一种促炎细胞因子。众所周知,IL-17扮演核心角色激活中性粒细胞和巨噬细胞在COPD患者肺和严重的BA (3,7,8]。地震是il - 1的11个成员国之一β家庭,像il - 1β,它主要是由单核细胞和巨噬细胞分泌,有能力快速应对外部因素和触发大促炎反应(3]。超表达地震的航空公司在COPD患者已被证明会导致肺气肿,纤维化的发展肺部的支气管和血管,和肺动脉高压的形成7,8]。由于其辅助2型细胞(th2)诱导功能,地震也可以参与炎症和代哮喘和呼吸道的促进嗜酸性粒细胞的航空公司的招聘9- - - - - -12]。另一方面,地震将进一步诱导免疫细胞产生大量的炎性因素加剧疾病(13,14]。因此,着重研究地震在慢性阻塞性肺病是相当重要的。
报道,口服NAC是古典医学治疗老年慢性阻塞性肺病患者;溶解粘液等多重效果,抗氧化、抗炎。然而,南汽是否会影响地震尚未完全阐明。在这项研究中,我们探索了NAC对慢性阻塞性肺病患者的治疗效果是否会抑制地震和进一步调查背后的机制。
2。方法和材料
2.1。参加研究的患者
共有112名慢性阻塞性肺病患者和103年健康个体从金山医院,复旦大学,从2019年5月到2020年3月。所有慢性阻塞性肺病患者进入治疗的口服NAC(乙酰半胱氨酸片、海南ZangBang制药有限公司,中国)(1200毫克/天),和药物治疗持续了大约100天(89 - 112天)。所有参与者签署书面知情同意。这项研究是按照有关规定进行法规由上述伦理委员会。我们的研究是研究伦理委员会批准的复旦大学附属金山医院,中国(批准文号:金山医学伦理学研究2019-13-02)。
慢性阻塞性肺病的诊断是基于慢性阻塞性肺疾病:慢性阻塞性肺病诊断和管理,分级进行按照黄金标准(15,16]。入选标准是显示如下:(1)患者确诊为慢性阻塞性肺病和稳定的时期;(2)病人收到任何抗生素、糖皮质激素、氧气疗法,和茶碱药物治疗前2周内进入研究;和(3)患者签署知情同意自愿参与研究。排除标准如下:(1)急性发作患者可能影响细胞因子的自然过程;(2)患者伴有肺间质纤维化、肺结核、支气管肺炎、肺癌;和(3)主要非呼吸道系统疾病患者,如严重的心血管疾病,脑血管疾病和神经系统疾病或肝脏和肾脏功能障碍,以及各种肿瘤。
2.2。细胞因子的测定酶联免疫吸附试验(ELISA)
病人的血样后立即离心收集为了分离血清,和大约1.5 - 2毫升每个病人的血清收集。分离后,血清样本立即存放在−80°C。细胞因子浓度水平取决于使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(嘉汉生物,中国)。执行的测试是根据制造商的指示。
老鼠血液立即被吸引后小鼠腹腔麻醉与硫喷妥钠(70毫克/公斤)和安乐死横切腹主动脉,离心得到血清。老鼠细胞因子测定的酶联免疫试剂盒(嘉汉生物,中国)。执行的测试是根据制造商的协议。
2.3。动物
雄性老鼠C57BL / 6(6 - 8周大)被用于这项研究。老鼠被分为五组,每组包含10老鼠:组1-control组;2组动物model-cigarette烟(CS)(红塔烟草公司、中国)(每天20支香烟,每会话60分钟,每周6次)+脂多糖(LPS) (Abcam、英国)(5μg / /鼠标,1次/周,从第三周8周)组;第三组动物型号c + LPS + NAC (Abcam、英国)(40毫米的饮用水、南汽管理从第三星期到实验的最后)组;组的动物型号c + LPS + anti-IL-18组;和组计次收费动物型号c + LPS + IgG2A组。动物实验持续了8周。所有组的标准食物喂养的老鼠,可以免费获得水。动物实验程序的协议研究的伦理委员会批准的人类和动物的研究复旦大学医学院。
2.4。流式细胞术分析
支气管肺泡灌洗液(BALF)获得通过气管插管洗老鼠气道腔与PBS。然后,BALF立即在1500转离心5分钟细胞颗粒。细胞类型进一步测量并由流式细胞术。数据分析进行FlowJo(美国BD生物科学)。immunofluorescent抗体用于研究显示如下:CD45-V500, CD11b-PerCP, F4/80-PE, CD206-BV421, CD3-FITC, NK1.1-APC(美国BD生物科学)。以下是老鼠巨噬细胞:CD45+CD11b+F4/80+CD206+。自然杀伤细胞(NK)如下:CD45+CD3- - - - - -NK1.1+。同形像的相关抗体作为消极的控制。结果分析与FlowJo 10.6.2(美国BD生物科学)。
2.5。Immunodepletion的地震
的anti-mouse地震-抗体注射删除小鼠内的地震(50μ美国研发系统g /鼠标)。控制老鼠注射一种特异性的抗体(IgG2A、研发系统、美国)。
2.6。免疫印迹
实验项目(如前所述)(17]。细胞溶解产物混合物resuspended 40μl Laemmli加载缓冲区包含beta-mercaptoethanol (Bio-Rad实验室,CA)在免疫印迹分析。蛋白质分离,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)在80 V转移聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(绘画纸Protran, 0.45μ米)在80 V(1.5小时在4°C)。膜被封锁1小时在室温下用1 xtbst 0.5%脱脂牛奶。膜孵化了16个小时在4°C的主要抗体(1:1000),后跟一个小时孵化1:10000稀释二级抗体。墨迹是使用增强化学发光(ECL)工具包(表达载体)。
2.7。组织病理学分析
左上肺灌注小鼠从每组与5%福尔马林固定24小时,和four-micrometer-thick切片苏木精和伊红染色进行分析。结果是评估两个调查人员盲目,基于组织病理学评分系统,正如前面提出的(18]。
2.8。统计分析
IBM SPSS软件分析的数据(20.0,美国)。结果的意义是由双向方差分析测试使用GraphPad Prism 7.0 (GraphPad软件,圣地亚哥,CA)。所有数据都显示为代表 一式三份(SD)从三个独立的实验。对比组由独立样本进行了分析 - - - - - -测试。 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。病人的临床特征和健康个人注册
共有112名慢性阻塞性肺病患者和103个健康个体参与这项研究。没有这两组临床特征区别。的基本信息如表所示1。
3.2。细胞因子表达在慢性阻塞性肺病患者在健康个体相比发生了巨大的变化
我们测量了血清炎症相关的细胞因子在慢性阻塞性肺病患者和健康个体,包括TGF -β,il - 1β干扰素-γ、il - 6、il - 10, TNF -α和地震。结果表明,il - 1的内容β肿瘤坏死因子-α干扰素-γil - 6, TGF -βCOPD患者的血清中,地震增加了与健康个体相比,il - 10在减少(图1(一))。NAC治疗后,il - 1的水平β干扰素-γ肿瘤坏死因子-α,地震在慢性阻塞性肺病患者的血清减少,il - 10是相反地增加;TGF -没有明显的变化β并观察il - 6(图1 (b))。进一步研究表明,在慢性阻塞性肺病患者接受治疗之前,地震已经与干扰素-正相关γ( ),il - 1 ( ),和肿瘤坏死因子-α( )和负相关,il - 10 ( );此外,与其他细胞因子(图没有相关性1 (c));结果表明,地震与干扰素-有很大联系γ。
(一)
(b)
(c)
3.3。南汽减少干扰素-γ慢性阻塞性肺病和地震- CS和LPS引起的小鼠模型
我们使用C57BL / 6小鼠建立COPD小鼠模型。吸烟暴露和有限合伙人被用来开发COPD小鼠模型。为了验证多种细胞因子的表达在慢性阻塞性肺病患者。后的血清中细胞因子测定小鼠死亡。结果表明,干扰素-的内容γ和地震增加COPD与对照组相比,小鼠,与慢性阻塞性肺病患者的结果是相一致的。另一方面,地震与干扰素-被发现呈正相关γ(图2(一个))。南汽的治疗后,地震和干扰素-γ显著降低(图2 (b))。
(一)
(b)
(c)
为了进一步爆发地震和干扰素-之间的联系γanti-IL-18用于删除内的地震在慢性阻塞性肺病老鼠(消除效率是通过ELISA测定)。结果表明,在小鼠慢性阻塞性肺病消除地震之后,干扰素-γ也大大减少(图2 (c))。上面的实验结果可能会给假设NAC可以降低干扰素的表达γ通过令人沮丧的地震水平老鼠肺部。
3.4。南汽和Anti-IL-18缓解小鼠肺组织炎症和损伤的治疗CS和有限合伙人
下评估模型以及南汽的治疗效果和anti-IL-18的炎症反应的治疗CS结合有限合伙人在一只老鼠的肺。如图3分析了组织切片,与对照组相比,CS和有限合伙人治疗组提出更多的肺损伤和炎症;的免疫细胞浸润肺组织和气管也大。与南汽,然而,当老鼠cotreated炎症显著下降,同样的现象也被观察到的老鼠注射anti-IL-18,而老鼠注射IgG2没有明显的变化。组织病理学变化进行评估由两个调查员盲目基于组织病理学评分系统(18]。结果证实,南汽和anti-IL-18可以减轻炎症和损伤引起的小鼠肺CS和有限合伙人。
(一)
(b)
3.5。地震在巨噬细胞的表达增加慢性阻塞性肺病BALF的老鼠
流式细胞仪是用来评估地震的表达在小鼠肺巨噬细胞。BALF的老鼠了,细胞被流式细胞仪立即收集和分析。如图4地震是在慢性阻塞性肺病老鼠巨噬细胞明显高于正常对照组。NAC治疗后,地震在巨噬细胞明显减少。与此同时,干扰素-γ自然杀伤细胞(NK)也减少了。anti-IL-18组,也观察到相同的现象,这可能表明,NK细胞的活化和释放干扰素-γ地震引起的从巨噬细胞释放,NAC可以抑制地震-减轻肺部炎症和免疫平衡状态的老鼠。
3.6。NAC压制地震-表达小鼠巨噬细胞通过下调NLRP3
流式细胞术被用来排序BALF巨噬细胞形式。人类反应的蛋白质含量inflammasome (NLRP3, AIM2, NLRC4)裂解半胱天冬酶1和地震-巨噬细胞被免疫印迹(图进一步评估5)。与LPS结合CS治疗、NLRP3裂解半胱天冬酶1和地震-巨噬细胞急剧增加。然而,NAC治疗后,NLRP3,裂解半胱天冬酶1和地震有显著下降,表明NAC可以有效改善免疫状态显示NLRP3巨噬细胞抑制地震的合成,激活干扰素-这是一个至关重要的γ。
4所示。讨论
慢性阻塞性肺病是一种慢性呼吸疾病,它变成了一个主要公共卫生问题在21圣世纪,因为它的高患病率,发病率和死亡率19]。如今,一些病理理论和相关治疗慢性阻塞性肺病深入调查,其中炎症和相关细胞因子是强调在临床治疗20.]。许多免疫细胞及其介质参与疾病的炎症过程,其中巨噬细胞炎症COPD的发病机制中起到了至关重要的作用。先前的报道表明,地震主监管机构推动破坏性和重塑过程在COPD患者的肺21,22]。因此,在这项研究中,我们测量了水平地震和其他炎症细胞因子在慢性阻塞性肺病患者和鼠标COPD模型。事实揭幕,在COPD患者中,肺部的炎症是持久化以及在老鼠模型中。与此同时,我们发现地震-一个伟大的连接与其他炎症细胞因子,尤其是干扰素-γ,这表明,地震是一个重要的因素在推动干扰素-γ响应和发布。因此,为了进一步研究地震和干扰素-之间的关系γ在肺组织中,我们建立了慢性阻塞性肺病的小鼠模型,利用抗体消灭老鼠的地震。注射后,炎症和肺损伤小鼠的肺松了一口气,干扰素的表达水平γ显著下降。另一方面,干扰素的表达γ在NK细胞减少。一些研究显示,地震是一个独特的因素参与各种免疫细胞的激活,包括T细胞和NK细胞,通过同时激活的NF -κB通路(12,23,24]。其他的研究报告说,当地震-它的受体结合,形成地震/ IL-18Rα/ IL-18Rβ复杂,它可能诱发的磷酸化STAT3在NK细胞和p38激酶途径地图在中性粒细胞(25- - - - - -27]。我们的研究表明,地震在炎症队伍确实发挥了重要作用,并能抑制肺部炎症减少地震的表达水平,这可能是一种有效改善慢性阻塞性肺病患者的炎症状态的方法。
地震有一个相当广泛的生物效应和展品多向性的属性的免疫反应。高表达在呼吸道的地震已被证明在COPD患者和BA (3,6- - - - - -8,25]。地震作为代数余子式发展的辅助1型(Th1)和Th2细胞,也可以增加细胞NK活性和Fas-ligand表达式(25,26]。表明,这种细胞因子展品品质的一个强大的指挥,加强各种促炎细胞因子的激活,包括IFN-g、干扰素-γgm - csf, TNF -α,IL8 IL-13 IL-17, IL-5 [23,24]。考虑到多方面的促炎的地震活动的性质,发现血清浓度升高的细胞因子表明地震中扮演一个重要的角色在实现系统性炎症的慢性阻塞性肺病和BA和asthma-COPD重叠(ACO)。IL-17显示血清水平之间的相关性,地震,TNF -α和肺功能参数的检查病人可能意味着这些细胞因子的影响发展的病理生理机制在这些阻塞性疾病(6,23- - - - - -27]。NAC是一种加压法氨基酸和抗氧化剂,可以作为一个经典药物治疗慢性阻塞性肺病等多种疾病,容易在许多国家。它提供了含巯基的组织和行为减少谷胱甘肽的前体,直接活性氧(ROS)清道夫,因此调节细胞的氧化还原状态,从而影响许多炎症通路(28]。可渗透的报道表明,NAC可以直接影响一些信号通路如NF -κB p38 ERK1/2 SAPK /物,c-Jun, c-Fos调整免疫状态(29日- - - - - -32]。然而,NAC能否影响巨噬细胞和地震尚未完全阐明。作为il - 1家族的一员,处理地震前驱细胞内半胱天冬酶1到18 kDa的生物学上成熟的分子(33]。众所周知,慢性炎症已被证明是一个关键球员在慢性阻塞性肺病的不同阶段,并突出对急性和慢性炎症信号通路的激活半胱天冬酶1 inflammasomes,报告为一组的胞质蛋白复合物形成调解微生物感染的宿主免疫反应和细胞损伤,其中NLRP3, AIM2, NLRC4重视在慢性阻塞性肺病的活动调节免疫反应(34- - - - - -36]。在我们的研究中,在南京,地震在血清和巨噬细胞在慢性阻塞性肺病小鼠显著下降,组织切片显示炎症和肺损伤有效平息。同时,inflammasomes的蛋白质和裂解半胱天冬酶1巨噬细胞被免疫印迹测量之前和之后的小鼠慢性阻塞性肺病南汽。结果表明,NAC可以在巨噬细胞表达下调NLRP3的表达,从而减少地震的合成。总之,不知何故,NAC可能干预巨噬细胞产生的地震的能力表达下调的表达inflammasomes改善COPD患者的肺的炎症。
总之,我们的论文是第一个找到南汽的作用在抑制巨噬细胞释放的地震。这个假设基于鼠标COPD模型进一步证明。NAC可以影响巨噬细胞的inflammasomes表达下调的合成的地震,从而提高免疫和炎症状态(图6)。当然,需要进一步调查充分描述南京的具体机制在调节巨噬细胞inflammasome-related蛋白质。
数据可用性
所有的数据可以通过电子邮件访问请求的通讯作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
发源地刘和陆Xufeng并且构思和设计实验。发源地刘进行研究,并且进行了数据分析,和写的手稿。发源地刘和胡Zhixiong并且导致了临床数据收集。陆Xufeng修订后的手稿和协调的研究团队。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。
确认
这项工作是支持的科学研究青年项目上海金山地区卫生委员会(jskj - ktqn - 2018 - 04),上海金山地区卫生系统第四“优秀青年人才”培训项目(JSYQ201907),上海市卫生委员会和科学研究青年项目(20204 y0172)。作者感谢参与本研究的患者和米切尔从梨纹Bianji伤势,Edanz集团中国http://www.liwenbianji.cn/ac),编辑英语文本草案的手稿。