文摘

背景。很多lncRNAs被发现,监管因素各种肿瘤的发生和发展,但仍有少的角色研究lncRNAs神经胶质瘤恶性进展的。方法。生物信息学分析分析了微分TCGA基因(度)的数据库。MTT、流式细胞术和Transwell化验进行测试增殖,细胞凋亡,细胞迁移和入侵。存在和免疫印迹检测进行RNA和蛋白质的表达每个基因,分别。基因芯片分析验证绑定关系。CRNDE鱼化验地下室二层位置,在裸鼠异种移植了在活的有机体内验证。结果。CRNDE调节神经胶质瘤细胞,过度CRNDE促进恶性神经胶质瘤细胞的发展。CRNDE监管通过CRNDE-ETS1-GPR17轴神经胶质瘤的发生和发展。GPR17 ETS1被证明目标子地区。过度的CRNDE促进了绑定GPR17 ETS1和启动子之间的地区,因此,促进GPR17的转录,而沉默GPR17抑制促进CRNDE增殖,神经胶质瘤细胞的迁移和入侵。结论。这些结果表明CRNDE监管GPR17绑定ETS1表达,转录因子,从而影响神经胶质瘤的发展。研究结果还表明,CRNDE可以作为一个可能的治疗目标和神经胶质瘤的预后的生物标志物。

1。介绍

神经胶质瘤是一种激进的原发性脑瘤,早期浸润性生长和转移(1]。多形性胶质母细胞瘤(GBM)是主要的亚型的所有类型的神经胶质瘤存活率一般小于5年2]。神经胶质瘤的复发率高,治疗低效率导致预后不良。虽然手术切除、放疗、化疗和靶向治疗已经发展近几十年来,神经胶质瘤的治疗,尤其是“绿带运动”,仍是不满意的3]。神经胶质瘤的发展是复杂的,这是通过多基因相互作用和multimolecule监管(4]。是至关重要的神经胶质瘤的分子机制研究神经胶质瘤的有效途径和预后的方法。

lncRNAs已成为一个研究热点,由于其异常表达在不同的组织,特别是在肿瘤组织(5- - - - - -8]。最近的研究显示,lncRNAs参与人体不同的生物过程,如转录激活的细胞,细胞内运输,热休克反应,和基因组印记9- - - - - -11]。lncRNAs与各种恶性肿瘤和肿瘤存在致癌基因和prooncogenic因素(12]。也有一些报告lncRNAs在神经胶质瘤增殖和转移的影响。燕等人发现lncRNA FlvCR1-AS1调节E2F2水平的竞争吸附mir - 4731 - 5 - p,进一步促进增殖和转移的神经胶质瘤(13]。的差别李等人的研究表明,对这些LINC00174可以抑制抗temozolomide神经胶质瘤细胞的分子机制,即LINC00174可以海绵mir - 138 - 5 - p,影响的表达SOX9,进一步提高了抵抗temozolomide和神经胶质瘤细胞的增殖14]。除了作为龙头、进一步规范神经胶质瘤的生物学功能通过microrna的竞争吸附,lncRNAs还可以直接调节基因的表达与转录因子结合影响神经胶质瘤的发展。Lv等人发现lncRNA PVT1能促进神经胶质瘤细胞的增殖和迁移表达下调的表达UPF1 [15]。然而,lncRNAs的具体分子机制在神经胶质瘤进展,特别是lncRNAs结合转录因子的调控胶质瘤进展,需要进一步探讨。

lncRNA, CRNDE施加一个至关重要的角色,在各种癌症。太阳等人报道,通过调制miR-29c-3p CRNDE促进成神经管细胞瘤细胞的化学敏感性水平(16]。白等人证明CRNDE宫颈癌的致癌原因可以通过增加CCNB1促进宫颈癌的发展水平,竞争性吸附mir - 183 (17]。这些报告证实CRNDE癌症发展的重要性。神经胶质瘤CRNDE功能发展。李等人提出,CRNDE龙头、促进发展的“绿带运动”通过调制mir - 136 - 5 - p / bcl - 2 / Wnt2信号轴(18]。江先生等人发现,神经胶质瘤CRNDE功能在促进发展,而促进作用是由表皮生长因子受体信号(19]。这些神经胶质瘤的研究已经证明CRNDE在神经胶质瘤的影响,但CRNDE调节神经胶质瘤的具体分子机制仍需进一步的研究,特别是能否结合相关转录因子调控下游基因,因此,影响神经胶质瘤的发展。

这项研究致力于研究CRNDE和神经胶质瘤的发展之间的关系,并探讨CRNDE对神经胶质瘤细胞的生物学行为的影响及可能的分子机制CRNDE结合转录因子调控下游基因,以揭示为神经胶质瘤靶向治疗。在这项研究中,我们利用生物信息学方法证明CRNDE之间差异表达正常和肿瘤组织和受CRNDE筛选可能的下游基因。ETS1 / GPR17被选中作进一步研究。最后,lncRNA-TF-mRNA监管CRNDE轴被生物信息学和相关实验验证。我们的研究可能为神经胶质瘤的发病机制提供新的见解和发现新的治疗目标。

2。材料和方法

2.1。生物信息学分析

神经胶质瘤来自有关lncRNAs LINCDISEASE (http://www.rnanut.net/lncrnadisease/index。html), lncRNAs实验和实验检测方法/预测被保留。神经胶质瘤的表达芯片GSE50161(正常:13;从地理(获得的肿瘤:34)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO/)。微分分析被完成通过使用R包“limma”与正常样本的控制。 和值< 0.05被用作筛选标准微分lncRNAs (DElncRNAs)和mrna (DEmRNAs)。CRNDE、ETS1 GPR17水平TCGA-LGG通过GEPIA检索(http://gepia2.cancer-pku.cn/指数)。下游转录因子和三联体CRNDE调节基因的低级神经胶质瘤(LGG)预测使用lncMAP (http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/lncMAP /生存。JSP)。碧玉数据库是用来预测结合位点ETS1和下游基因的启动子区域。

2.2。细胞和细胞培养

细胞系中列出的信息表S1。正常来细胞和神经胶质瘤细胞T98G、A172 SNB19, U251准备在一个完整的杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM;σ,含10%胎牛血清(美国)的边后卫;美国纽约)和100 U /毫升的青霉素和链霉素(美国纽约康宁)在标准条件下在一个孵化器。

2.3。细胞转染

全身CRNDE克隆,序列和向量CRNDE过度(oe-CRnDE)和空白pcDNA3.1 (oe-NC)是由GENECHEM,上海。Sh-ETS1及其控制(sh-NC) sh-GPR17及其控制(sh-ctrl)序列从RiboBio访问(中国)。T98G和U251细胞转染48 h进行后续分析。pLent-CRNDE和pLent-NC向量从Vigene购买生物科学(美国)和过表达CRNDE用于慢病毒转导。慢病毒载体转染到T98G细胞和1毫克/毫升嘌呤霉素处理以获得稳定的细胞系。细胞转染完成Lipofectamine 3000(美国表达载体L3000015)。

2.4。中存在

从组织和细胞总RNA隔离每个小组完成使用试剂盒(表达载体)遵循制造商的指导方针。的PrimeScript™RT试剂盒(豆类、志贺、日本)推荐的反向互补脱氧核糖核酸。存在是ABI 7900 ht仪器(美国应用生物系统公司)。定量PCR是SYBR预混料Taq交货(豆类,大津,志贺,日本)。CRNDE与36 b4内生控制规范化。ETS1和GPR17规范化与GAPDH内生控制。引物是列在表中S2。目标基因的相对水平的差异相比,对照组和实验组2^{- - - - - -ΔΔCt}价值。试验是在3进行复制。

2.5。免疫印迹

细胞转染48 h后在不同的团体,他们冲洗冷PBS(美国热费希尔)一式三份和细胞溶解在冰上整整10分钟,蛋白质溶解产物。蛋白质量化是用BCA定量工具(美国热费希尔)。10μL加载缓冲区是补充,蛋白质在95°C煮10分钟。进行了sds - page 100 V。电泳后,马被转移到NC膜蛋白在100和120分钟,密封与5% BSA / TBST 60分钟,其次是孵化主要抗体在4°C过夜。孵化后,膜清洗在振动台 解决方案(Solarbio,北京) *在室温下。山羊anti-rabbit免疫球蛋白和辣根过氧化物酶标记用于杂交在室温下为120分钟。膜用TBST洗净了 次,。然后,发光反应了ECL工具包(Solarbio,北京)。蛋白质印迹被拍照观察。在三个复制进行了分析。抗体信息展示在表S3。

2.6。染色质免疫沉淀反应(芯片)的测定

T98G U251细胞用于芯片分析。EZ-Magna芯片(微孔)装备在芯片分析建议。实验简要描述如下。首先,1%的甲醛溶液应用于细胞诱导交联。然后用140毫米甘氨酸的交联就熄了。后天核酸蛋白质复合体当时细胞溶解到200 - 500个基点的DNA片段和免疫沉淀反应实验抗体或免疫球蛋白。在4°C一夜之间,DNA交联的移除,目标片段级通过存在化验。中使用的引物分析表S2。抗体测定中使用的信息表S3。

2.7。MTT试验

T98G和U251细胞的增殖( )是通过MTT试验来衡量的。每个处理由三个重复。细胞培养24小时后,48岁,72年,96年和120 h,肝癌和无菌溶液(Beyotime)被用来评估细胞增殖。在450纳米波长吸光度是化验标(CA桑尼维尔,美国)。

2.8。细胞凋亡检测

T98G 6-well板和U251细胞培养。文化的48 h后,细胞被胰蛋白酶消化(没有EDTA)然后re-suspended PBS (4°C)。离心后1000 rpm和4°C到删除PBS,细胞resuspended通过绑定缓冲(1×)。膜联蛋白V-FITC (Biovision K101)和propidium碘(π)染色悬挂补充道。细胞的反应是在黑暗进行了15分钟,由流式细胞术和细胞凋亡的比例是化验(BD生物科学)。

2.9。Transwell迁移和入侵检测

T98G U251细胞对数生长期和饥饿24 h,在第二天,消化细胞离心和resuspended。最终的细胞浓度 细胞/毫升。Transwell上院补充0.2毫升悬挂,并降低室挤满了700μL DMEM加上10%的边后卫。细胞在常规条件下是准备在文化室。24小时后,细胞上插入与湿棉签擦洗。然后,细胞受到修复与甲醇30分钟和0.5%结晶紫染色了20分钟。在入侵检测中,最终细胞浓度 细胞/毫升,Matrigel-coated上院是推荐的。DMEM加上10%的边后卫被用来填补下议院。在37°C细胞培养48 h为20分钟,然后用结晶紫染色。染色细胞这两个化验用PBS和干翻了个底朝天。然后,细胞在倒置显微镜下拍摄。五个字段被随机选择计数细胞。

2.10。荧光原位杂交(FISH)和亚细胞分离

鱼实验,首先,荧光探针合成CRNDE,这是购自RiboBio(广州)。之后,日博鱼工具包和日博lncRNA探针组合工具被用来执行鱼化验(RiboBio、广州、中国)对大脑神经胶质瘤组织依照指令。试验后,荧光显微镜用于观察结果(美国热费希尔)和拍照。的细胞核和细胞质T98G和提取U251巴黎设备根据设备规格(美国生活技术,卡尔斯巴德)。分离后,CRNDE和参考基因的表达(U6和GAPDH)在细胞核和细胞质通过存在化验。

2.11。统计分析

数据由SPSS 22.0(美国芝加哥,IL)。测量数据被表示为 。两组之间的比较 - - - - - -测试和多个组之间的比较是单向方差分析。卡方检验是用于CRNDE和临床病理的参数。 表示一个统计上的显著差异,而 和 表示一个极其显著性差异。

3所示。结果

3.1。在神经胶质瘤CRNDE表达增加

为了寻找与神经胶质瘤相关DELncRNAs, 142 glioma-related lncRNAs LINCDISEASE数据库的筛选。37 DelncRNAs是通过limma微分分析GSE50161芯片从地理数据库。五DElncRNAs包括MEG3 CRNDE、XIST AgAP2-AS1,神经胶质瘤相关LINC01116都获得通过的交集DElncRNAs和glioma-related lncRNAs(图1(一))。通过分析这些5的表达差异lncRNAs在正常样本和神经胶质瘤的肿瘤样本GSE60161芯片,CRNDE显著调节肿瘤样本(图1 (b)),是最重要的区别与正常样本(相比 )(表S4)。CRNDE报道促进大肠癌的发生,乳腺癌和其他癌症(20.,21]。但是,没有研究CRNDE对神经胶质瘤的影响及分子机制已报告,所以我们选择了后续研究CRNDE为研究对象。因为没有正常组织数据的GBM TCGA数据库,我们比较临床表现数据的CRNDE GEPIA数据库。结果展示,CRNDE显著调节LGG肿瘤样本(图1 (c)),这与CRNDE趋势基本上是一致的地理数据库。

来CRNDE水平细胞和神经胶质瘤细胞T98G, A172, SNB19, U251通过存在化验。CRNDE的结果是显著高表达在所有4神经胶质瘤细胞系相比来细胞(图1 (d))。这些结果显示CRNDE调节神经胶质瘤细胞。T98G和U251细胞系具有最高和最低4癌症细胞系CRNDE表达式,分别,所以他们选择以下在体外细胞实验。

3.2。过度的CRNDE调节增殖,凋亡,神经胶质瘤细胞的迁移和入侵

从CRNDE水平临床组织和细胞,它可以得出结论,CRNDE水平呈正相关,肿瘤的发生。因此,推断,迫使神经胶质瘤细胞中表达CRNDE会促进增殖、迁移和入侵癌细胞。来验证这种可能性,我们检查的影响迫使CRNDE表情T98G和U251细胞恶性行为。MTT和细胞凋亡分析表示,执行CRNDE表达明显提升生存能力,增长能力,抑制细胞凋亡的细胞(数字2(一个)和2 (b))。此外,我们还证实,CRNDE正在表达的癌组织和细胞的细胞核和细胞质使用鱼试验和核/等离子体分离实验,和核中的表达水平显著高于在细胞质中(图2 (c))。因此,CRNDE可能调节下游转录因子。我们进一步检查的影响CRNDE神经胶质瘤细胞的迁移和入侵后被显著增强CRNDE过表达(图3(一个))。免疫印迹被用来检测入侵和移民相关蛋白质,结果还显示,N-cadherin的表达水平,波形蛋白,MMP9, MMP2 CRNDE后增加钙粘蛋白的同时减少过度(图3 (b))。综上所述,CRNDE可以充当prooncogenic因素调节增殖、迁移、侵袭性,和神经胶质瘤细胞的凋亡特性,以及EMT过程。

3.3。CRNDE促进GPR17表达式通过促进绑定ETS1 GPR17启动子区域

后确定CRNDE促进恶性神经胶质瘤细胞的发展,下游转录因子和有针对性的mrna的CRNDE调节神经胶质瘤细胞进行了探讨。我们使用了lncMAP数据库预测的监管三联体lncRNA-TF-mRNA CRNDE大脑神经胶质瘤和获得30下游调控转录因子。四个候选人转录因子,ETS1, MYC NR3C2, FOXP2基因,通过交叉这些30转录因子显著DemRNAs GSE50161(图4(一))。通过分析这四个转录因子的表达差异GSE50161芯片在正常样本和神经胶质瘤肿瘤样本,指出ETS1是显著调节在肿瘤样本(图4 (b)),与正常样本相比最突出的差异( )(表S4)。此外,我们比较了mRNA表达数据的ETS1 GEPIA数据库,结果显示ETS1明显调节肿瘤样本的LGG(图4 (c))。同时,GPR17获得通过十字路口DElncRNAs GSE50161 mrna,预测的结果lncMAP三联体(图4 (d))。GPR17 GSE50161芯片和GEPIA数据库中表达的临床数据显示,GPR17高度表达的肿瘤样本(数据4 (e)和4 (f))。

CRNDE-ETS1-GPR17监管途径后,通过生物信息学分析,发现了多个实验来验证他们的绑定关系。存在检测显示,迫使CRNDE表达式将促进癌细胞(图GPR17水平5(一个))。为了研究ETS1是否绑定到启动子区域GPR17 GPR17调节转录,我们使用ETS1 Jaspar数据库预测结合位点和GPR17启动子区域,和芯片存在分析被用来证明ETS1可以绑定到GPR17启动子区域(图5 (b))。然后,细胞被分成 , ,和 组。蛋白质和mRNA的表达GPR17每组中被检测到,分别。发现沉默ETS1抑制的促进作用在两个神经胶质瘤细胞过表达GPR17(数字5 (c)和5 (d))。这些结果表明CRNDE-ETS1-GPR17的相互约束力,建议CRNDE可能通过调节ETS1促进GPR17的表达式。

3.4。CRNDE调节GPR17调节神经胶质瘤肿瘤细胞的表型

为了证明CRNDE调制神经胶质瘤的生物学功能通过调制GPR17的表达,我们进行了救援T98G和U251细胞实验。基于MTT测定的结果,细胞活动后显著增加CRNDE的过度表达,同时促进能力CRNDE超表达显著抑制GPR17抑制(图的时候6(一))。细胞凋亡的结果与扩散的结果。细胞的凋亡率 组明显高于在 组(图6 (b))。在细胞迁移和入侵,过度CRNDE和抑制GPR17会抑制CRNDE的促进作用超表达在细胞(图6 (c))。免疫印迹分析水平的入侵,移民相关蛋白质,结果还显示, 扭转的能力overexpressing CRNDE单独调节蛋白表达。N-cadherin换句话说,蛋白质含量,波形蛋白,MMP9, MMP2减少,钙粘蛋白增加反向组(图6 (d))。总之,CRNDE可能通过促进GPR17促进神经胶质瘤细胞的发生和发展水平。

4所示。讨论

神经胶质瘤是一种破坏性和侵入性脑瘤,在成人中枢神经系统肿瘤死亡的主要原因,早期诊断和治疗的仍然是医学问题。在肿瘤的研究,lncRNAs参与不同流程的肿瘤生成和发挥监管作用在肿瘤的发生和发展。同样重要的是要知道lncRNAs的生物功能的肿瘤抑制致癌作用和肿瘤。CRNDE猜测,调节大脑神经胶质瘤细胞的增殖和转移生物信息学预测。生物信息学预测和存在披露,CRNDE被调节,调节恶性神经胶质瘤细胞的行为。这里,CRNDE调节神经胶质瘤细胞。因此,我们研究了CRNDE对神经胶质瘤的功能的影响,结果表现出的强制表达CRNDE明显促进增殖,迁移,入侵,antiapoptosis神经胶质瘤细胞。这些结果都证实CRNDE prooncogenic因素在神经胶质瘤和有一个显著的促进影响肿瘤细胞的功能。

众多报道解释了监管lncRNAs对神经胶质瘤的生物学功能的影响,神经胶质瘤和大多数研究关注lncRNAs可以结合小分子rna作为内生骗取小rna或竞争内源性rna(龙头)和调节功能(22,23]。除了作为龙头,lncRNAs结合转录因子调控下游基因影响神经胶质瘤的功能也受到关注。李等人报道,lncRNA HOTAIRM1促进增殖和转移的“绿带运动”移植HOXA1 G9a和抑制HOXA1的绑定/ EZH2 Dnmts复杂(24]。范等人发现lncRNA SNHG3促进神经胶质瘤的恶性进展通过招募zeste同族体2剂在催化剂KLF4和p21 [25]。我们解开CRNDE调制通过绑定ETS1 GPR17水平,以促进神经胶质瘤恶性进展。这一结果进一步证实lncRNAs神经胶质瘤可能影响神经胶质瘤的发展通过绑定一些转录因子,进一步调节下游mrna的表达。

作为ETS家族的一员,ETS1在人体的作用已被广泛研究由于其表达在不同的细胞类型。在肿瘤中,它的功能作用于基质细胞和肿瘤细胞在肿瘤组织。ETS1培养生长的肿瘤细胞和基质细胞在肿瘤组织的发展各种肿瘤(26- - - - - -29日]。尽管一些研究调查ETS1在神经胶质瘤的作用,以前的相关研究也证明ETS1功能促进神经胶质瘤的癌症。加布勒等人提出,ETS1功能促进癌细胞生长的恶性神经胶质瘤和LGG [30.]。在这项研究中,我们发现ETS1可能受CRNDE促进下游mrna水平和增强神经胶质瘤细胞的恶性表型。一方面,这些结果证明ETS1 prooncogenic作用的神经胶质瘤。另一方面,ETS1被证明作为转录因子在胶质瘤中扮演重要角色。

GPR17 G-protein-coupled受体(GPCR)绑定到胃肠道单元,主要局限于少突细胞谱系细胞。GPR17是至关重要的在少突胶质细胞髓鞘形成的时间(31日]。GPR17癌症的作用很少被报道。在这项研究中,人们发现GPR17位于调节lncRNA-TF-mRNA CRNDE-ETS1-GPR17轴心在神经胶质瘤生物信息学。进一步的实验表明,GPR17能够促进神经胶质瘤细胞的恶性进展,及其由CRNDE-ETS1控制调节的影响。这些结果显示首次GPR17发挥了prooncogenic作用在神经胶质瘤和监管在神经胶质瘤的分子机制也被证明。

这项研究瓦解,CRNDE提升神经胶质瘤细胞的发展。CRNDE调节GPR17表达式结合ETS1培养增殖,迁移,入侵,阻碍神经胶质瘤细胞的凋亡。本研究产生更深的理解的角色CRNDE在神经胶质瘤和寻求新的神经胶质瘤靶向治疗奠定了基础。我们将收集临床样本,建立小鼠模型在活的有机体内调查之间的关系的调节轴和clinicopathology神经胶质瘤患者或与肿瘤转移的关系在活的有机体内。

数据可用性

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的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

华郭设计和构思实验;燕胡锦涛和海涛罗进行实验;华郭和朱Xingen试剂和材料。燕胡锦涛和海涛罗的贡献同样这项工作。

补充材料

表S1:细胞株用于实验。表S2:实验中使用的引物序列。表S3:抗体实验中使用的信息。表S4:微分表达式筛选DElncRNAS和转录因子。(补充材料)