文摘
本研究旨在研究当归多糖(ASP)的影响从Lixinshui处方中提取大鼠的心脏疾病引起的高血压。建立了心血管疾病的老鼠模型,测量和相关因素。数据显示ASP治疗射血分数、短轴缩短率增加,同时减少LV舒张末期直径、LV收缩末期直径、LV舒张末期容积、左室收缩末期容积大桶老鼠。ASP的表达水平下调TGF -β1,alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma),胶原蛋白我、纤连蛋白、波形蛋白,伯灵顿,caspase-9裂解,裂解caspase-3和调节bcl - 2的表达水平在LV大桶的老鼠。与此同时,ASP增加超氧化物歧化酶(SOD)的活性和谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)和丙二醛(MDA)水平,降低组织内源过氧化氢(H2O2)、活性氧(ROS)。我们的研究结果表明,ASP可以通过抑制心肌纤维化预防高血压心脏病,抑制心肌细胞凋亡,减轻氧化应激。
1。介绍
心血管疾病(心血管病)是第一个引起的死亡率和发病率。与此同时,高血压是心血管疾病的主要危险因素发展(1]。根据世界卫生组织(世卫组织)估计,全球高血压人口的数量将达到11.3亿2]。高血压常常仍然没有得到诊断或治疗的很长一段时间。然而,高血压可能引起心肌结构和功能的变化。这些变化包括心肌细胞凋亡、氧化应激增加,左心室肥大。所有这些会导致心脏衰竭(3]。不过,甚至高血压患者也明显高于高血压心脏病发病率和死亡率的影响从当前标准药物治疗高血压指南有清楚的好处在左心室肥大的回归。
最近,越来越多的中国传统中药(中药)作为治疗心血管疾病的应用研究[4,5]。例如,SINI汤(SND)是用来预防和治疗心血管病(6]。作为有效成分淫羊藿,icariside II改善左心室重构(7)和缓解内质网压力——(人)诱导心肌细胞凋亡在自发性高血压大鼠(月)8]。Lixinshui处方是由主任医师曾Xuewen改善慢性心力衰竭患者的心脏功能状态(心脏水肿综合征)。这个处方研究倾向于改善心室重构(9]。Lixinshui处方是由人参、黄芪,朱昱,Gui智,与平板电脑、当归、Chuanxiong lepizi,灵芝。当归多糖(ASP)的主要生物活性成分提取当归的根展品有益的抗氧化功能在治疗多种疾病引起的氧化应激(10,11]。例如,王先生和他的同事们发现,ASP的小鼠肝损伤伴刀豆球蛋白(处理12]。陈和他的同事的研究表明,ASP促进神经发生通过增强抗氧化和抗炎能力和延迟衰老的速度通过保护神经干细胞(nsc) [13]。然而,ASP高血压心脏病的潜在作用需要进一步探讨。
在目前的研究中,我们建立了一个高血压心脏病(大桶)大鼠模型根据前面的研究(14]。ASP的潜在效应从Lixinshui处方中提取对高血压心脏病评估通过测量左心室的各种超声心动图参数,检查心脏组织的病理特征,研究肝纤维化、细胞凋亡相关基因的表达,和评估左心室的心肌抗氧化状态的组织。我们的研究结果表明,ASP, Lixinshui处方的活性成分,是一个很好的候选人高血压心脏病。ASP可以通过抑制心肌纤维化预防高血压心脏病,抑制心肌细胞凋亡,减轻氧化应激。这些可以促进传统中草药在现代医学的发展。
2。材料和方法
2.1。植物材料
Lixinshui处方中药从当地商店。多糖的提取和纯化进行报道(12]。ASP的分子量(MW)为72.9 kD。糖含量约为95.1%,没有蛋白质和核酸检测的内容。阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖是ASP的成分,和三个单糖的摩尔比率是1:2.5:7.5。最后,ASP是冻干的存储。
2.2。动物实验
本研究进行了实验动物伦理委员会的同意。所有程序都按照指南进行的护理和使用实验动物。
特定的无菌男性Sprague-Dawley (SD)老鼠被用于这项研究。老鼠夫妇安置和维护相对湿度( )和温度环境( )12小时的光/暗周期。所有的老鼠实验之前需要七天的适应时期。
24老鼠(体重200 - 220克)是诱导高血压心脏病(大桶)由一个八周高脂饮食治疗(HFD)(标准饮食添加20%的脂肪与猪油,20%蔗糖、10%的蛋白质,1%的胆固醇,和0.5%钠脱氧胆酸盐)。大桶大桶8周治疗后,大鼠随机分为四组:三个ASP-treated组(80、160和320毫克公斤−1每天分别命名为LASP,圣保罗,博物馆和搭扣)和一个vehicle-treated组(模型)。ASP是溶解在蒸馏水和通过口服。老鼠喂食普通饮食和口头管理蒸馏水(10毫升公斤1每天)被设置为正常对照组(控制)。所有的老鼠被允许自由进入标准的饮食在实验期间或高脂肪的饮食。
2.3。左心室功能的检测
(描述的测量左心室功能8在实验的最后。简单地说,老鼠被固定在一个动物麻醉后操作平台。然后,各种超声心动图参数测量与三峰PET / SPECT / CT扫描仪。参数包括左心室射血分数(EF)、左心室短轴缩短率(FS)、左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期直径(LVESD)和左心室收缩末期容积(LVESV)。所有计算结果与连续多个心脏周期的方法。
2.4。测量的抗氧化状态
每个大鼠的左心室组织(0.1 g)被添加到0.9毫升无菌生理盐水和均质。在12000 g离心后10分钟在4°C,每组聚集的上层清液进行进一步分析。五氧化和抗氧化参数包括谷胱甘肽过氧化物酶的活性(氧化酶)和超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)的内容,内源过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)测定的样品根据装备的细节(南京建成生物工程研究所、中国)。
2.5。组织学检查
大鼠左心室组织被移除,在福尔马林固定。组织是用自来水清洗,使用分级脱水乙醇(75%,95%,95%,100%,100%),由二甲苯(两次)玻化,嵌在石蜡中。接下来,左心室石蜡包埋组织块分为4毫米厚的幻灯片。幻灯片被浸没deparaffinized二甲苯,其次是补液与酒精梯度(100%、100%、95%、95%和75%)。最后,幻灯片是沾)(中国Beyotime C0105)或马森的三色的染料(中国Solarbio G1340)观察病理变化在左心室组织在显微镜下400 x放大。肌肉纤维和心肌纤维化(红色)或胶原蛋白(蓝色)量化使用ImageJ (National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。
2.6。免疫荧光分析
柠檬酸的水化幻灯片恢复抗原检索解决方案通过使用高压蒸汽锅炉2分钟。然后,幻灯片被封锁在PBST解决方案(PBS添加0.3% Triton x - 100) 1% BSA在室温下1小时。接下来,幻灯片孵化了αsma和TGF -β1抗体稀释PBST一夜之间解决方案与1% BSA在4°C,分别。FITC山羊anti-rabbit免疫球蛋白(ZSGB-Bio,中国)作为二级抗体稀释在PBST解决方案。幻灯片是二级抗体孵育免受光1小时,其次是与DAPI染色另一个10分钟。最后,幻灯片应用荧光显微镜成像400 x放大。
2.7。TUNEL染色
患者左心室组织幻灯片关于细胞凋亡活动进行评估与比色TUNEL细胞凋亡测定工具包(中国Beyotime C1098)根据指令。短暂,从每一组幻灯片与PBST permeabilized冰5分钟和混合末端转移酶(TdT)酶2小时,其次是反应停止与PBST溶液1% BSA 10分钟。然后,幻灯片是孵化anti-digoxigenin-conjugated合为30和diaminobenzidine (DAB)解决方案为20分钟,随后。民建联与HRP-labelled样本反应生成不溶性色(棕色)衬底的DNA碎片。细胞核被苏木精复染色。最后,TUNEL-positive细胞荧光显微镜下计数为400 x放大。 。
2.8。定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)
总RNA提取左心室组织根据手册试剂盒(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript RT试剂(豆类、日本)。RT-qPCR是执行检测的相对表达水平mRNA使用7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,CA)。引物序列表中列出1。RT-qPCR分析使用方法。
2.9。西方墨点法
左心室组织匀浆中收获裂解缓冲区,把样品放在冰了30分钟,并收集在12000 rpm的上层清液离心4°C 30分钟。上层清液中蛋白质浓度测定采用增强的BCA蛋白质分析工具包(Beyotime P0010S,中国)。30μg总蛋白质的12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶上分离。接下来,蛋白质是电转移到PVDF膜(微孔)。膜是孵化与脱脂奶粉1% PBST方案1小时。然后,孵化了膜抗体针对胶原蛋白,αsma、纤连蛋白、波形蛋白,caspase-3裂解,裂解caspase-9, bcl - 2、Bax一夜之间在4°C。与此同时,β肌动蛋白是用作标准控制。膜是洗4次PBST和二次抗体孵育1小时。最后,乐队的蛋白质是可视化增强化学发光孵化体系(ECL)另一个5分钟。蛋白质水平量化使用ImageJ (National Institutes of Health),马里兰州贝塞斯达)。
2.10。统计分析
GraphPad棱镜(Windows版本6.01)使用统计软件进行统计分析。学生 - - - - - -测试是用来比较组之间的显著差异。对重复测量方差分析用于社会团体内部的分析。统计学意义是 。
3所示。结果
3.1。当归多糖能改善高血压大鼠心脏功能
老鼠喂养8周的HFD诱导高血压心脏病;然后,老鼠口服接种剂量的ASP(80、160和320毫克公斤−1每天过去6周)或蒸馏水。大桶老鼠的身体重量(模型、LASP圣保罗,博物馆和搭扣组)均明显高于正常大鼠的体重(对照组)在实验过程中。然而,搭扣组大鼠的体重在最后6周低于模型组大鼠(图1(一))。与此同时,在大鼠左心室功能被安乐死。结果表明,EF和FS在大桶显著降低大鼠与正常大鼠相比。这些表明大桶大鼠心室重构和功能障碍。ASP显著增加EF和FS剂量依赖性的方式相比,模型组大鼠(图1 (b))。同时,LVEDD, LVESD LVEDV,在大桶和LVESV显著增加大鼠与正常大鼠相比;ASP显著降低LVEDD, LVESD LVEDV, LVESV剂量依赖性的方式相比,模型组大鼠(图1 (b))。这些数据表明,ASP可以恢复心脏功能障碍引起的高血压大鼠。
(一)
(b)
3.2。当归多糖抑制高血压大鼠心肌纤维化
首先,我们执行)和马森的三色的染色检查ASP的组织学的影响心。H&E-stained组织切片显示,正常老鼠的心有序,使制备心肌细胞。然而,我们观察到无序排列在大桶老鼠心肌细胞。和ASP显著缓解无序排列的方式相比,模型组大鼠存在剂量依赖的相关性。同时,马森trichrome-stained组织切片显示,发现了显著增厚的肌肉纤维和显著的心肌纤维化模型组大鼠的心肌间质,这心肌纤维化是剂量依赖性降低ASP治疗(图2 (b))。然后,我们采取了免疫荧光测定,RT-qPCR,免疫印迹分析检测改变细胞基因表达相关矩阵的心脏组织。免疫荧光分析的结果显示,αsma和TGF -β1中在模型组大鼠,大鼠中的表达水平降低与APS治疗,与趋势以及ASP剂量的增加(图2 (c))。同时,RT-qPCR和免疫印迹分析的数据显示,两种胶原蛋白mRNA和蛋白表达水平的我,αsma、纤连蛋白和波形蛋白在大桶增加老鼠,与正常大鼠相比。相比之下,ASP的表达水平降低剂量依赖性的方式相比,模型组大鼠(数据2 (d)和2 (e))。除此之外,左心室质量指数(LVMI)的测量在不同组大鼠4和8周表明,LVMI明显高于在大桶大鼠与正常大鼠相比,和ASP显著减少的变化LVMI剂量依赖性的方式(图2 (f))。综上所述,我们发现ASP可以抑制心肌纤维化引起的高血压大鼠。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.3。当归多糖抑制高血压大鼠心肌细胞凋亡
接下来,进一步评估ASP的缓解效应在大鼠心脏功能障碍引起的高血压,我们评估由TUNEL染色法测定心肌细胞凋亡,凋亡的关键组件的量化表达式。TUNEL染色检测组织切片分析显示显著的心肌细胞凋亡在大桶大鼠与正常大鼠相比,和ASP显著减少心肌细胞凋亡在剂量依赖性的方式相比,模型组大鼠(图3(一个))。mRNA和蛋白表达水平是衡量RT-qPCR和免疫印迹分析,显示增加伯灵顿的表情,caspase-3裂解,裂解caspase-9和减少在大桶老鼠bcl - 2的表达。这些结果表明HFD刺激后细胞凋亡的发生。相比之下,不同剂量的ASP干预明显减少伯灵顿的表达,caspase-3裂解,和caspase-9裂解,同时增加bcl - 2的表达较模型组大鼠(数字3 (b)和3 (c))。以上结果表明,ASP可能抑制降在大鼠心肌细胞凋亡。
(一)
(b)
(c)
3.4。当归多糖减轻氧化应激在高血压大鼠心肌细胞
最后,我们评估了ASP的保护效果与降在大鼠心肌细胞氧化应激。氧化应激标志物的检测表明,H2O2在大桶和MDA水平明显升高大鼠与正常大鼠相比,在氧化酶的活性和SOD明显降低。然而,这些变化是由ASP治疗,缓解和减轻一个ASP方式存在剂量依赖的相关性(图4(一))。除此之外,更高的大桶老鼠测量左心室的ROS水平比正常的老鼠。和ASP显著降低ROS水平剂量依赖性的方式相比,模型组大鼠(图4 (b))。上述结果表明,ASP缓解降在大鼠氧化应激。
(一)
(b)
4所示。讨论
心血管疾病,特别是肥大心脏疾病,死亡率和发病率的主要原因是在全球的世界。高血压心脏病导致死亡是高血压患者最常见的并发症之一(2]。一项研究表明,过程中高血压、高血压会增加心脏负担,改变心肌结构和功能的特点。这些变化包括心肌细胞凋亡,心肌细胞的氧化应激和左心室肥大。所有这些可以发展为心力衰竭3]。因此,预防高血压心脏病的治疗通过改善心室重构,抑制心肌细胞凋亡可能是重要的战略,以减少高血压病人的发病率和死亡率(15,16]。
众所周知,EF和FS的减少表明,(月)表现出自发性高血压大鼠心室重构和功能障碍8]。在这项研究中,我们建立了一个HFD-induced大桶鼠模型根据以前的报告(14]。EF和FS减少检测的大桶老鼠表示心室重构和功能障碍。然后,我们探讨了ASP的潜在影响提取Lixinshui处方在大桶大鼠心脏功能。经过政府的低、中或高剂量的ASP, EF和FS增加大桶老鼠。除此之外,左心室功能的测量表明,ASP可以减少LVEDD, LVESD, LVEDV, LVESV大桶老鼠。众所周知,LVEDD LVESD增加在慢性心力衰竭大鼠2]。我们研究的数据与ASP的角色在改善HFD-induced高血压大鼠心脏功能,预防高血压心脏病。
纤维化通常被认为是一个主要因素的改造和加强17]。心肌纤维化(MF)是心血管疾病的重要病理生理过程,往往导致恶性心律失常、心力衰竭,甚至猝死18]。心肌纤维化的病理基础包括心脏成纤维细胞(CFs)的增殖和细胞外基质(ECM)过度沉积组件(19]。在目前的研究中,发现他走时,马森trichrome-stained组织显示无序排列心肌细胞和心肌间质显著增厚的肌肉纤维的大桶老鼠。同时,ASP显著缓解肌肉纤维的无序排列方式存在剂量依赖的相关性。
以前的研究报道,增加αsma和胶原蛋白表达水平是肝纤维化的重要标志20.]。TGF -β1,作为主要纤维发生的因素,可以促进epithelial-mesenchymal过渡(EMT)和肺fibroblast-to-myofibroblast分化转移(21]。纤连蛋白和波形蛋白是成纤维细胞的标记和EMT过程中发挥重要作用,肿瘤发生在结肠直肠癌22]。协调小组- 001据报道减弱心肌纤维化和抑制alpha-smooth肌肉肌动蛋白、纤连蛋白,胶原蛋白我表达和II-induced心脏肥大大鼠(23]。我们的研究表明,ASP逆转的过度αsma, TGF -β1,胶原、纤连蛋白和波形蛋白的老鼠喂HFD。此外,我们研究了左心室心肌细胞的凋亡使用TUNEL染色。结果表明,阳性细胞的数量增加了HFD集团虽然减少了ASP-treated组。除此之外,RT-qPCR和免疫印迹分析的结果显示,不同剂量的ASP干预伯灵顿的表达减少,caspase-3裂解,和caspase-9裂解,同时增加bcl - 2的表达。这些结果表明,ASP改善左心室重构通过抑制心肌纤维化和抑制心肌细胞凋亡。
氧化应激与血管功能障碍和心血管重塑相关典型[24]。氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡的氧化剂活性氧引起的过度积累(25]。生理上,ROS刺激心脏成纤维细胞的增殖导致ECM重塑(26]。在这项研究中,我们发现ASP可以减少H的水平2O2MDA和氧化酶的活性升高SOD大桶的老鼠。同时,ASP可以减少ROS水平剂量依赖性的方式。综上所述,这些研究结果表明,ASP可以抑制心肌纤维化和抑制心肌细胞凋亡,减轻氧化应激。
遗憾的是,我们的实验没有进行验证研究ASP在其他类型的高血压模型的函数。我们的研究结果表明ASP在预防高血压心脏病的影响在活的有机体内。在未来的研究中,我们将关注ASP的潜在机制高血压心脏病预防、ROS还参与多种因素诱发心血管疾病。
5。结论
ASP提取Lixinshui处方可以防止高血压心脏病通过改善心脏功能,抑制心肌纤维化,抑制心肌细胞凋亡,减轻氧化应激。我们的研究结果表明,ASP的,作为一个Lixinshui处方的活性成分,是一个很好的候选人高血压心脏病。这些发现将促进传统中草药在现代医学的发展。
数据可用性
本研究中所有生成的数据或分析包括在发表的这篇文章。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作得到了江苏省中医药科技发展计划项目(没有。YB201968)。