文摘
客观的。的保护作用和机制探讨轻度体温过低的治疗治疗心肌缺血再灌注损伤。材料和方法。总共20 Sprague-Dawley (SD)老鼠分为4组:空白对照组,虚假的操作组,缺血再灌注组和轻度低体温(每个治疗组 )。一些指标检测。此外,oxygen-glucose剥夺/复氧损伤的心肌细胞模型建立了(OGD)。信使rna的表达il - 6和TNF -α和细胞凋亡的关键酶水平(cleaved-Caspase-3)和NLRP3 inflammasome / p53信号通路的模型被确定。结果。血清il - 6和TNF的表达α轻度低体温症治疗组明显低于缺血再灌注组。轻度低体温症治疗组也显著降低TUNEL细胞计数和NLRP3 p53比缺血再灌注组(所有磷酸化水平 )。体外温和 集团还显示显著降低mRNA的表达il - 6和TNF -α和水平的裂解Caspase-3、NLRP3和磷酸化p53蛋白比OGD组(所有 )。结论。总之,轻度低体温症治疗可以抑制细胞的凋亡,心肌炎症MI / R损伤诱导的大鼠和抑制的活动NLRP3 inflammasome通路和p53信号通路可能的机制。
1。介绍
心血管疾病是世界上死亡的主要原因,占全球所有死亡原因的25%在2010年和2016年全世界所有死亡原因的31%,和85%的心血管疾病造成的死亡是心脏病和中风(1]。在中国,心血管疾病也占据第一位的死亡原因,约占所有死亡原因的40%。作为一个人口众多的国家,中国是最大的国家之一世界上心血管疾病医疗负担(2]。急性心肌梗死(AMI)是一个心肌坏死的事件引起的不稳定心肌血液供应,是心脏病和中风的主要原因3]。AMI的病理生理机制如下:慢性动脉粥样硬化引起冠状动脉狭窄和动脉粥样硬化斑块中断然后导致斑块从血小板参与血液循环,导致血管的hypercoagulable状态和通过反馈触发其他不稳定斑块破裂,最终导致不可逆转的心肌细胞的坏死。目前,AMI治疗主要是通过及时恢复血液流动(包括溶栓治疗、经皮冠状动脉介入和冠状动脉旁路移植术)和减少心肌梗死面积4]。虽然手术治疗和药物治疗可以恢复血液流动在时间和大大降低AMI患者的死亡率,仍有25%的患者发展为心力衰竭甚至死亡(5,6]。
轻度低体温疗法是一种干预方法来控制病人的核心温度在32 - 35°C。轻度低体温可降低死亡率和当用于心脏骤停复苏后神经损伤。在一个心脏按压心脏骤停的情况下,复苏(ILCR)国际联络委员会建议病人的体温应冷却尺码°C时12 - 24小时心脏节律恢复最初的心室纤维性颤动(7]。近年来,对轻度低体温症治疗心肌梗死的研究仍然是有争议的。一方面,一些研究已经发现,轻度低体温症治疗可以提高患者的治愈率心脏按压心脏中风和保护他们的大脑功能(8,9]。另一方面,一些研究指出,轻度低温治疗不会降低心脏病的死亡率和不良心血管事件的发生率10]。此外,在基础研究方面,一些研究已经证实轻度低体温疗法可以降低AMI的心肌梗死面积在动物模型(11]。
初步临床试验的小样本,没有证据表明轻度低体温疗法可以采取积极的影响(12),但在另一个轻度低体温症治疗的多中心临床研究,人们已经发现,轻度低体温疗法可以减少心肌梗死面积(13]。对轻度低体温症治疗AMI荟萃分析表明,轻度低体温(34°C)治疗既有利于心肌梗死面积和心脏功能也不需要延长时间完成整个door-to-balloon和所需的时间首次经皮冠状动脉介入(PCI) (14]。
然而,在心肌轻度体温过低的特定角色,包括轻度低体温的影响心肌炎症和心肌细胞凋亡和特定的分子机制,尚未完全阐明。本研究旨在调查轻度体温过低的治疗方法进行心肌炎症和细胞凋亡的细胞在心肌梗死和其潜在的机制通过模拟缺血/ hypoxia-reperfusion损伤的病理生理变化在心肌梗塞使用大鼠心肌缺血再灌注模型(MI / R)损伤和培养胚胎心脏细胞的氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD)和采用轻度低体温干预模型。
2。材料和方法
2.1。研究材料
2.1.1。实验动物
总共20 Sprague-Dawley (SD)大鼠(200 - 250 g)从湖南SJA实验动物有限公司购买,牌照号码的SCXK(湘)2016 - 002。
2.1.2。主要试剂
大鼠胚胎心脏细胞(H9c2细胞系)(中国科学院)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒白细胞介素- 6 (il - 6)和肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)在大鼠(E-EL-R0015c E-EL-R0019c, Elabscience生物技术有限公司,武汉,中国),DNA / RNA /蛋白质co-extraction工具包(DP423, Tiangen生物技术有限公司,北京,中国),原位细胞凋亡检测设备(11684795910、罗氏集团、瑞士),快速准备工具,sds - page凝胶(P0012AC Beyotime生物技术有限公司,上海,中国),试剂盒(15596026,热费希尔科学,中国上海)、聚合酶链反应(PCR)工具包(YT379生物学实验室技术,北京),点头,远程雷达,pyrin domain-containing蛋白3 (NLRP3)抗体(美国Abcam公司ab214185)磷酸化p53(美国9284年,春秋国旅公司),Caspase-3抗体(9662年,春秋国旅公司、美国),和GAPDH抗体(美国Abcam公司ab181602)是主要的试剂。所有抗体的浓度是1:1000。
2.2。大鼠冠状动脉缺血再灌注模型创伤性AMI
在这项研究中,MI / R损伤的大鼠模型由冠状动脉闭塞采用刺激AMI后修改(15]。老鼠被随机分为四组:空白对照组(对照组),虚假的操作组(虚假的集团),缺血再灌注组(IRI组)和轻度低体温疗法组( )(每 )。老鼠加权和腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(80毫克/公斤)。在麻醉下,老鼠治疗皮肤准备他们的脖子和胸部和操作网站消毒,其次是皮肤的脖子。随后,每只老鼠与通过气管插管呼吸机,正压机械通气(潮汐卷:10毫升;通风机频率:90次;比例:1:1)。第四肋间隙的左侧胸骨的老鼠,皮肤是垂直切开,第三根肋骨被切断了打开胸腔,让心脏和老鼠是200 u /公斤肝素钠在冠状动脉闭塞,结扎左冠状动脉的前0.5%利多卡因。随后,一个6 - 0尼龙外科线程被插入针用于结扎现场距主动脉根约2毫米之间的下边缘左心房附件和肺动脉圆锥插入线程后约2毫米的宽度和深度。连接成功之后,有一个现象,左心室前壁的成为肉眼紫色或淡,较弱的脉动,有海拔在ST段连接心电图心肌缺血,这暗示成功建模的心肌缺血。轻度低体温症组老鼠立即放置在温度控制装置和温度是32°C。我们一个温度计插入直肠证实大鼠的体温是32°C,而大鼠缺血再灌注组被放置在室温下(没有体温干预)。 The visual operative field of thoracic surgery was covered with gauze wet by normal saline. After 30 min, the ligature was cut off to form reperfusion and the color of myocardium was analyzed. Afterwards, the muscle and skin were sutured in turn and again disinfected with povidone iodine. Finally, the heart of each rate was reperfused for 1 h and the rat was killed by carbon dioxide narcosis (euthanasia), followed by collection of serum and heart tissue for subsequent detection.
2.3。建设体外心肌细胞轻度低体温模型OGD干预
Rat-derived父心肌细胞系(H9c2细胞株)写明ATCC购买形式。他们培养high-glucose (4.5 g / L d -葡萄糖)完成杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)含胎牛血清(的边后卫)有限公司(10%)2(5%)孵化器在37°C。实验小组由4组:空白对照组(对照组),轻度低体温症组(轻度低体温症组),OGD集团 体温过低文化集团( 低体温症组)。在对照组,心肌细胞培养在孵化器包含high-glucose DMEM培养基有10%的边后卫和5%的公司2在37°C 24 h和轻度低体温症组心肌细胞培养在轻度低体温孵化器包含高与10%的边后卫和5%葡萄糖DMEM培养基中有限公司2在32°C 24 h。此外,心肌细胞的 在DMEM培养基培养低体温症组(低葡萄糖,1 g / L d -葡萄糖)包含10%的边后卫。我们把这些心肌细胞轻度低体温three-gas孵化器(32°C,含有0.5% O2,5%的公司2,94.5% N26小时。然后,这些心肌细胞培养在一个孵化器包含high-glucose DMEM培养基的边后卫10%和5%股份有限公司2在37°C 24 h。从中提取RNA,紧随其后的是测定il - 6和TNF的表达α。蛋白质从细胞中提取,apoptosis-related的表达裂解Caspase-3 Caspase-3, NLRP3蛋白质磷酸化p53蛋白和总p53蛋白测定。
2.4。测定血清il - 6和TNF -的水平α通过ELISA
心脏灌注后,老鼠的血液采样通过心包穿刺术,室温下放置1小时,和离心液12000 g·rpm 5分钟收集血清。血清il - 6和TNF -α被量化,使用相应的ELISA试剂盒按照设备指令。样品的光学密度为450 nm使用标计算血清il - 6和TNF -α每组中表达。
2.5。从心脏组织提取蛋白质
心脏组织(1 g)抽样从每个老鼠,和组织的蛋白质提取使用DNA / RNA /蛋白质共萃取设备和量化使用bicinchoninic酸(BCA)方法。
2.6。免疫印迹(WB)测定
10% sds - page凝胶制备使用工具包快速准备的sds - page凝胶(Beyotime生物技术有限公司、上海、中国),和样品的装载量蛋白质是20μg。样品蛋白进行电泳在80 V 30分钟,其次是电泳在120 V 1 h。随后,蛋白质被转移到PVDF膜通过湿转移方法以恒定电流350毫安的1 h和膜堵塞在5%脱脂牛奶/ TBST室温1 h和洗TBST和抗体GAPDH(内部参考控制)被稀释5%脱脂牛奶1:1000,然后一夜之间在4°C的环境。后来,膜清洗TBST和孵化与相应的二次抗体(山羊anti-rabbit(1: 1000)和山羊anti-mouse(1: 5000)在室温下1 h。最后,相应蛋白的强度检测的电化学发光TBST洗涤后(ECL)方法。乐队使用ImageJ强度分析软件(美国国家卫生研究院)。
2.7。TUNEL染色石蜡的心肌组织
心肌组织和10%多聚甲醛固定石蜡和嵌入。心肌的石蜡包埋组织块切成4μ米厚的部分,和原位细胞凋亡检测是使用染色根据末端脱氧核苷转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)设备指令。TUNEL-positive细胞的数量在每组心肌部分免疫荧光显微镜下进行了分析和比较。
2.8。RNA提取和普通PCR /琼脂糖凝胶电泳
细胞的RNA提取使用试剂盒(16),是相对地转录成RNA cDNA使用PCR试剂盒。PCR反应条件是94°C 3分钟,94°C 15秒,30秒和60°C。四十个周期的反应进行了StepOnePlus检测系统(ABI、美国),和方法被用来计算基因表达。使用的引物序列如下:il - 6引物序列(上游引物:CCACCCACAACAGACCAGTA-3 ;下游引物:5 - - - - - -GGAACTCCAGAAGACCAGAGC-3 );肿瘤坏死因子-α引物序列(上游引物:5 - - - - - -ACGTCGTAGCAAACCACCAA-3 ;下游引物:5 - - - - - -AAATGGCAAATCGGCTGACG-3 );β肌动蛋白引物序列(上游引物:5 - - - - - -TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3 ;下游引物:5 - - - - - -AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3 )。所有的引物合成了热费希尔科学(上海)。
2.9。统计分析
由SPSS20.0实验数据进行了分析。比较分析了组间方差分析图基紧随其后。 表示差异显著。
3所示。结果
3.1。轻度低体温疗法降低模型大鼠血清炎症因子水平的AMI
血清炎症因子的表达il - 6和TNF -α是由ELISA检测(图1)。缺血再灌注组(IRI),血清il - 6和TNF -的水平αAMI都明显高于对照组(控制)和虚假的集团(假的),il - 6和TNF -α水平轻度低体温症组( )缺血再灌注组显著低于(il - 6, ;肿瘤坏死因子-α, )。
(一)
(b)
3.2。轻度低体温干预减弱的AMI大鼠心肌细胞凋亡的模型
采用TUNEL确定模型大鼠心肌细胞的凋亡水平的AMI。在图2在对照组,心肌细胞凋亡是罕见的和虚假的组(用绿色荧光标记细胞凋亡细胞),在缺血再灌注组心肌细胞凋亡数显著增加(图2(一个))。轻度低体温症组凋亡细胞的数量明显低于缺血再灌注组( ,图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。轻度低体温调节心肌炎症和细胞凋亡的抑制Inflammasome NLRP3 / p53信号通路
为了进一步调查轻度低体温的调节机制治疗大鼠炎症水平和心肌细胞凋亡的心肌梗死,我们发现NLRP3蛋白质的表达水平和p53分子的磷酸化水平在心肌组织inflammasome WB化验。如图3、缺血再灌注组的磷酸化水平NLRP3和p53在心肌组织明显高于对照组和虚假的集团,而NLRP3和p53的磷酸化水平轻度低体温症组明显低于缺血再灌注组(NLRP3: ;p53: )。
(一)
(b)
3.4。轻度低温抑制体外心肌细胞的炎症水平的OGD模型
为了进一步探索轻度低体温对心肌细胞的影响,我们建立体外培养的心肌细胞模型OGD模拟缺血再灌注损伤时心肌梗死。il - 6和TNF -α信使rna表达决心使用PCR /琼脂糖凝胶的方法。在图4与对照组相比,OGD组显示显著增加mRNA表达il - 6和TNF -α(包括 ),并与OGD集团 低温组显示显著降低mRNA的表达il - 6和TNF -α(il - 6: ;肿瘤坏死因子-α: )。
(一)
(b)
3.5。轻度低温抑制体外心肌细胞的炎症水平和细胞凋亡模型OGD通过干扰Inflammasome NLRP3 / p53信号通路
轻度低体温的影响水平的变化反映了裂解Caspase-3 / Caspase-3蛋白质后OGD体外心肌。如图5(一个)试验表明,裂解Caspase-3 / Caspase-3比OGD组显著高于轻度低体温症组和对照组,但明显低于 低温组( )。
(一)
(b)
(c)
(d)
进一步调查轻度低体温的机制在调节心肌细胞凋亡和炎症水平,我们探索的表达inflammasome NLRP3 / p53的心肌细胞模型OGD信号通路。如图5NLRP3蛋白和p53蛋白的磷酸化水平在OGD组明显高于轻度低体温症组和对照组和温和的磷酸化水平明显下降 组比OGD组( )。
4所示。讨论
目前,治疗轻度低体温对病人有明确的神经保护效应在复苏,但其对AMI的临床优势仍在调查之中。初步临床试验的小样本,没有证据表明轻度低体温疗法可以减少不良心血管事件(12]。对轻度低体温症治疗AMI荟萃分析表明,轻度低体温(34°C)治疗不利于心肌梗死面积和心脏功能也不需要延长时间完成整个door-to-balloon和所需的时间首次经皮冠状动脉介入(PCI) (14]。然而,它被发现在另一个轻度体温过低的多中心临床研究治疗轻度低体温症治疗可以减少心肌梗死面积(13)和轻度低体温疗法可以发挥心脏保护效应只在缺血期,没有证据表明它能在再灌注期起到积极作用17]。治疗轻度低体温症的临床优势的差异可能是由于不同的目标温度用于各种研究和不同的冷却方法,这使得它很难控制病人的核心温度在32 - 35°C没有变化。另一个原因可能是有一些机制,限制轻度体温过低的治疗效果的。例如,临床试验患者亚组分析表明,心肌梗死前显著小于其他地区轻度低体温症治疗后心肌梗死(10]。因此,治疗轻度低体温对AMI的影响需要进一步探索。
先前的研究显示,轻度低体温干预器官对缺血再灌注损伤的保护作用。例如,轻度低体温疗法可以减轻炎症反应在大鼠缺血再灌注损伤的模型18),它可以产生更强的保护作用比瘦老鼠肥胖老鼠的肝脏(19]。轻度低体温疗法研究在脑缺血性损伤。低温可以减轻缺氧/复氧诱导的氧化应激损伤的大脑血管屏障(人脑微血管内皮细胞、星状细胞和周围细胞)模拟通过体外培养和提高抗氧化能力20.),它还可以抑制谷氨酸的积累,中介excitotoxic脑损伤,减少氧自由基的生成,并削弱神经元细胞凋亡和细胞自噬死亡减少apoptosis-promoting蛋白质如p53蛋白的生成,伯灵顿,贝克和NAD (21]。至于心,一些研究人员使用34°C干扰大鼠的左冠状动脉缺血再灌注损伤模型和对模型与缺血30分钟和再灌注24小时。原来轻度低体温干预可以减少心肌梗死面积和嗜中性粒细胞浸润和可以减少心肌细胞凋亡22),增加心肌细胞自噬流,线粒体自噬和线粒体质量减轻心肌纤维化程度(23]。轻度低温治疗的保护作用不仅减少心肌梗死面积,而且保护缺血后心肌收缩功能,防止微血管循环没有回流阻塞,防止左心室重构(24]。轻度低体温症的分子机制不仅是抑制细胞代谢消耗也激活保护细胞信号转导途径,如Akt / ERK1/2信号通路和PI3K / mTOR信号通路(24,25]。尽管上述信号通路上的深入研究,发现一个Akt抑制剂或mTOR抑制剂仍有限的心肌保护和更多upstream-specific信号机制需要发现为了更好地配合轻度低体温症治疗的临床应用。
心脏缺血再灌注损伤是一个重要的病理生理变化在心肌梗死。先前的研究大多认为氧化应激、钙超载、血管内皮损伤,心肌细胞凋亡的机制进一步MI / R过程造成的心肌损伤(20.,26- - - - - -28]。近年来,它已成为一个研究热点,以缓解心肌梗死损伤通过干预心肌细胞凋亡。NLRP3是一种形式和细胞内受体激活NLRP3 inflammasome收到微生物信号后,外源性危险信号,和环境压力信号。的组装和激活NLRP3 inflammasome导致Caspase-1-dependent的释放促炎因子(il - 1β和地震),也可以诱导细胞凋亡由蛋白质gasdermin D [29日]。的角色NLRP3 inflammasome MI / R损伤已被广泛研究,但它仍然是有争议的。一方面,一些研究发现NLRP3调节在大鼠心肌缺血再灌注模型30.],NLRP3 inflammasome水平减少了药物可以减轻心肌损伤(31日]。此外,它已经发现,NLRP3 inflammasome糖尿病肾病模型大鼠被激活,这可能加剧MI / R介导心肌细胞凋亡(伤32]。NLRP3 inflammasome可以与多种细胞的细胞通路相互作用,这可能是上游效应的一种蛋白激酶/ ERK1/2信号通路(33]。另一方面,一项研究显示,MI / R损伤小鼠NLRP3基因缺陷更严重比野生型小鼠和相信NLRP3 inflammasome对MI / R损伤具有保护作用[34]。恶化的MI / R损伤过程中由于高脂肪和高果糖饮食,NLRP3 inflammasome被激活,促进myocardial-protective风险/ HIF-2的激活α信号通路(35]。然而,NLRP3的角色在MI / R损伤inflammasome温和低温治疗尚未报道。
在这项研究中,我们构建了体内和体外心肌梗死模型,AMI模型引起的心肌缺血再灌注,心肌细胞模型OGD和模拟心肌梗死的病理生理变化在动物水平和细胞水平。我们干预模型与轻度体温过低和探索轻度低体温症的病理生理过程和机制干预心肌梗塞。体内,轻度低体温症治疗可以显著降低心肌TUNEL-positive细胞计数和血清TNF -α和il - 6水平。肿瘤坏死因子-α和il - 6 mRNA表达和裂解Caspase-3蛋白表达在体外心肌细胞模型OGD轻度低体温干预后明显低于那些在心肌细胞OGD模型,表明轻度低体温干预antiapoptosis和抗炎效应在体内和体外心肌细胞。为了进一步探索轻度低体温症治疗的分子机制在心肌保护,我们进行了文献回顾从相关炎症和细胞凋亡的机制,发现NLRP3 inflammasome信号通路在调停MI / R损伤中发挥着关键作用。因此,这一发现为切入点,我们推断,轻度低体温疗法抑制心肌细胞的凋亡和炎症水平抑制NLRP3 inflammasome信号。NLRP3的蛋白质水平的检测在体内和体外模型显示,NLRP3水平明显增加心肌细胞缺血再灌注损伤模型和OGD模型,虽然轻度低体温干预后明显下降。此外,蛋白质的磷酸化水平p53与NLRP3蛋白质的变化趋势是一致的,这表明p53可能调节心肌细胞凋亡的下游的监管信号NLRP3 inflammasome。
目前,轻度低体温疗法在临床应用的限制温度快速冷却和维护的心。一个先前的研究降低AMI区域通过有针对性的冷却通过PCI在孤立的猪的心脏冠状动脉(36),并有相应的计算模型来预测所需冷却时间根据生理盐水的温度和水流速度注入冠状动脉(37]。药物诱导体温过低(PIH)可以避免不良反应等生理反馈患者的颤抖和低温引起的血管收缩38]。轻度低体温疗法可以更好地应用于治疗AMI患者如果实施问题解决。
综上所述,本研究与MI / R损伤和心肌hypoxia-reoxygenation干预模型通过探索轻度低体温轻度低体温的影响心肌细胞的凋亡和炎症水平,发现轻度低温治疗对心肌细胞的保护作用,同时还显示,轻度体温过低可能会减少心肌细胞炎症水平,抑制心肌细胞凋亡,抑制NLRP3 inflammasome通路和p53信号通路,为临床提供可靠的证据使用轻度体温过低的治疗AMI患者。
数据可用性
所有的原始数据可以通过联系相应的作者如果合格的研究人员需要访问。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由黑龙江省高校基础研究业务费用研究项目(2017 - qykyywf - 0761)。