文摘

背景。氧化应激、炎症和髓核细胞(npc)椎间盘细胞凋亡参与发病机理(试管)变性(类)。富马酸二甲酯(DMF)被发现通过Nrf2有效抑制氧化应激和炎症通路。因此,本项目旨在探索如何DMF的潜在机制保护npc有限合伙人的影响的挑战。方法和结果。CCK8测定细胞凋亡和流式细胞术显示,DMF治疗减毒LPS-induced人大损伤。免疫印迹分析表明,DMF增强核factor-erythroid的表达式两个相关因子2 (Nrf2)和血红素oxygenase-1 LPS-challenged npc (HO-1)。DMF治疗显著降低活性氧的积累,表达下调炎性细胞因子(p-NF -κB, il - 1β和肿瘤坏死因子-α),ER跟压力凋亡蛋白(哔calpain-1、caspase-12 caspase-3,和伯灵顿)LPS-challenged npc。凋亡蛋白bcl - 2被提拔的水平DMF LPS-challenged npc治疗。谷胱甘肽(GSH)分析表明,DMF治疗改善减少氧化谷胱甘肽比LPS-challenged npc。此外,免疫印迹分析的结果表明,在LPS-challenged npc, DMF治疗改善基质降解酶的水平升高(MMP-13 aggrecanase 1)和I型胶原蛋白和基质成分的水平(II型胶原蛋白和能)。然而,Nrf2击倒废除这些DMF的保护作用。结论。我们的数据表明,治疗DMF减轻LPS-induced氧化应激,炎症,并通过Nrf2 ER跟压力在npc细胞凋亡/ HO-1信号通路,因此重温LPS-induced npc的障碍,这小说提供了一个潜在的药物治疗策略类。

1。介绍

椎间盘变性)(类)被认为是下腰痛的主要诱因,而困扰全世界大约有10%的人(1,2]。试管是由一个中央髓核(NP)和外部纤维环(AF)。NP是亲水凝胶状结构,含有大量的蛋白聚糖,主要由II型胶原蛋白(Col-II)和aggrecan(能)。房颤是胶原同心圆组成的I型胶原蛋白(Col-I) [3]。据报道,在类,能和col-II退化矩阵组成的基质金属蛋白酶(MMPs)然后aggrecanases Col-I所取代,导致功能障碍的试管4]。

尽管类的发病机理还不清楚,氧化应激,炎症,髓核细胞(NPC)细胞凋亡在椎间盘变性(扮演重要角色5]。大量活性氧(ROS)生成过程中氧化应激可以直接损害npc,增加基质金属蛋白酶的表达降低试管矩阵(6,7]。王等人表明,增加的炎性细胞因子的表达,如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α)和interleukin-1β(il - 1β),加速类诱导的过程能降解[8]。和npc引起的过度凋亡降低矩阵的合成,进而导致椎间盘变性(9]。因此,类药物治疗的最好方法是抑制氧化应激,炎症,和过度的npc细胞凋亡。

内质网(ER),作为一个细胞器蛋白质合成、信号转导和动态^{2 +}存储,扮演着一个重要的角色在决定细胞命运(10]。各种条件,如缺氧、饥饿、炎症、Ca^{2 +}氧化还原平衡,可以影响的功能,导致所谓的ER应激(11]。一般来说,长期的ER应激导致proapoptotic通路的激活,导致许多疾病的发病机制12]。研究已经证明,过度和持续的ER应激涉及炎症和细胞凋亡通路,从而导致矩阵退化和npc在椎间盘细胞凋亡13,14]。但具体机制还不清楚。Caspase-12是proapoptotic蛋白酶位于ER膜的外表面,由calpain激活,细胞内Ca^{2 +}端依赖半胱氨酸蛋白酶(15- - - - - -17]。ROS浓度增加Ca的ER促进开放^{2 +}频道,Ca^{2 +}随后进入细胞质,刺激calpain蛋白酶,劈开caspase-12,激活细胞凋亡通路(17]。因此,我们推测,LPS诱导ER stress-apoptosis在npc calpain-caspase-12相关的通路。

富马酸二甲酯(DMF),作为一个著名的核受体激动剂factor-erythroid两个相关因子2 (Nrf2)响应基因(18),一直被用作各种退行性疾病的药物。例如,DMF有助于通过激活Nrf2糖尿病伤口愈合,抑制下游炎症(19]。Nrf2扮演着一个重要的角色在抗氧化应激通过促进几种抗氧化基因的表达,如血红素oxygenase-1 (HO-1)和NADPH醌oxidoreductase-1 (NQO-1) [20.- - - - - -22]。此外,Nrf2可以赋予自适应保护炎症维持细胞内稳态,从而缓解后续下游proapoptotic通路(23,24]。结果表明,激活Nrf2压抑氧化stress-mediated ER应激,线粒体功能障碍,细胞凋亡在感染性肝损伤(25]。然而,Nrf2之间的关系,ER应激和凋亡类直到现在尚未阐明。

在这个研究中,我们评估了DMF的能力改善类诱导氧化应激,炎症和ER跟压力细胞凋亡在npc使用脂多糖(LPS)和探索可能的参与相关的信号通路。我们的研究结果提出了DMF可以显著减轻氧化应激和炎症通过Nrf2 LPS-induced npc / HO-1通路。重要的是,我们发现DMF也可以抑制ER stress-mediated通过Nrf2 / HO-1细胞凋亡信号通路。这些发现改善我们的理解底层机制DMF变弱类治疗策略的类,并提供新思路。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和治疗

人类npc买来ScienCell研究实验室(美国德克萨斯州4800 ScienCell)和髓核细胞培养基培养(美国德克萨斯州NPCM, ScienCell)孵化器有限公司为5%₂在37°C。每两天中被改变,细胞时亚文化融合达到90% ~ 95%。2 ~ 3段的细胞被亚文化在后续实验。有限合伙人和DMF从Sigma-Aldrich购买(达姆施塔特,德国)和储存在PBS溶液在-20°C。在新鲜培养基培养细胞为6个小时,然后用不同浓度的LPS刺激(0、0.4、0.8、1.2和2.0μg / ml)建立NP细胞损伤模型。同样,npc治疗与DMF浓度梯度0,10、20、50、100和200μm .治疗后24 h与有限合伙人或DMF, 48 h, 72 h, CCK8试验执行评估细胞的生存能力。

2.2。细胞生存能力(CCK-8)测定

约 npc被播种到96 -孔板。不同治疗后24小时、48小时和72 h, CCK-8的可行性测试套件(美国新泽西州MedChemExpress)。在细节中,细胞培养在NPCM含有10% CCK-8解决方案2小时,然后测试光密度(OD)值在450 nm使用Gen5标仪(美国佛蒙特州BioTek)。NP细胞治疗作为控制。

2.3。测量活性氧的生产

评价了细胞内ROS DCFDA细胞活性氧检测化验设备(Abcam,剑桥,英国)。对待NP细胞( )被播种在细胞幻灯片和培养48 h。然后,这些细胞的幻灯片是孵化10μM ROS工作解决方案在37°C 45分钟。接下来,细胞幻灯片和PBS洗。荧光显微镜下的细胞内ROS测量(德国徕卡DMI 3000 b)。分析了荧光强度的ImageJ软件8.0版(美国大力神Bio-Rad)。

2.4。谷胱甘肽测定

细胞内的相对变化减少谷胱甘肽(GSH)和氧化谷胱甘肽(GSSG)水平测定谷胱甘肽/ GSSG-Glo化验设备(美国WI Promega)。简单,细胞在哈佛商学院收集和resuspended缓冲区,然后镀在96 - luminometer-compatible板在10000个细胞/。25μl总谷胱甘肽裂解试剂或GSSG试剂添加到井,在室温下孵化瓶为5分钟。然后50μl刚做好的荧光素代试剂添加到每个好之后30分钟在室温下孵化。100年μl(荧光素检测试剂被添加到每个。孵化15分钟后,发光测量使用LUMIstarω微型板块光度计(BMG Labtech)。井没有细胞,只有哈佛商学院缓冲区用于背景荧光检测。谷胱甘肽水平相对发光单元(RLU)是由减去RLU RLU的GSSG总谷胱甘肽。GSH / GSSG比例计算公式如下。

2.5。免疫印迹

总蛋白提取里帕缓冲区(Beyotime、上海、中国)补充PMSF (Beyotime、上海、中国)。BCA蛋白质测定蛋白质浓度测定的工具包(美国沃尔瑟姆热费希尔)。然后,等量的蛋白质被加载在8 - 12% sds - page凝胶和转移到PVDF膜转移(微孔,麻萨诸塞州,美国)。阻止5%脱脂奶的解决方案后,一夜之间,膜被孵化与特定的抗体主要在4°C紧随其后进一步孵化二级抗体室温2 h。初级和二级抗体购自热费希尔(沃尔瑟姆,美国),包括反β肌动蛋白、anti-Nrf2 anti-HO-1, anti-p-NF -κB, anti-IL-1βanti-TNF -α,anti-calpain-2 anti-Bip anti-active caspase-12, anti-active caspase-3, anti-Bax, anti-Bcl-2, anti-ACAN, anti-Col-II, anti-Col-I, anti-MMP-13, anti-aggrecanase 1,二级抗体免疫球蛋白。最后,乐队的蛋白质被发现使用ECL +试剂(美国沃尔瑟姆热费希尔)及其微分析ImageJ软件版本8.0(美国大力神Bio-Rad)。与β肌动蛋白作为控制、总蛋白的表达是标准化的。

2.6。流式细胞术分析细胞凋亡

细胞凋亡率是评估使用膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测设备(Vazyme生物技术,南京,中国)。简单地说,细胞被播种到6-well细胞培养板( 细胞/)。各种治疗方法后,细胞被收集,用PBS洗净,resuspended在500年μl绑定缓冲。然后,5μl膜联蛋白V-FITC和5μl PI染色溶液添加到缓冲区,轻轻摇动,孵化在黑暗中在室温下10分钟。细胞分析流式细胞仪(美国加州贝克曼库尔特)在1 h。

2.7。转染的成分

人类Nrf2的shRNA慢病毒质粒(美国sh-Nrf2,圣克鲁斯生物技术)和控制shRNA Plasmid-A(美国特拉华州sh-NC,圣克鲁斯生物技术)转染到npc用Lipofectamine肝试剂加试剂(美国沃尔瑟姆热费希尔)。的击倒效率sh-Nrf2证实了免疫印迹和RT-qPCR。

2.8。RT-qPCR

总RNA收集使用试剂盒试剂(豆类、日本)。1μg的RNA收集作为模板,并使用PrimeScript相对地转录™RT大师混合(豆类、日本)。反向互补dna被用于以下RT-qPCR实验使用SYBR®绿色装备(豆类、东京、日本),和反应进行使用ABI 7500测序检测系统。RT-qPCR中使用的引物合成了GENEWIZ(苏州、中国)。引物序列显示在表中1。与GAPDH基因作为参考,Ct和2^−ΔΔCt值是用来计算mRNA水平。

2.9。统计分析

收集所有的数据从三个独立的实验和作为 。统计分析进行了使用GraphPad Prism8 (GraphPad软件,Inc .)。用单向方差分析组间差异进行评估。每组之间的差异数据进一步分析了Sidak多个对比测试,和平均差异表达的95%置信区间。值< 0.05被认为是统计上的显著差异,显示的数据 。 显示为 ,和< 0.001 ,分别。

3所示。结果

3.1。DMF在LPS-Induced npc细胞生存能力增加

在这里,我们使用有限合伙人的挑战与梯度浓度(0、0.4、0.8、1.2和2.0μ建立一个g / ml)在体外退行性npc的细胞模型。结果表明,npc的可行性是剂量依赖性的方式阻碍,和非凡的受伤是显示在LPS-challenged npc相比控制(0μg / ml)浓度时达到1.2μ克/毫升(图1(一))。因此,我们选择了LPS浓度为1.2μg / ml刺激npc下列实验,建立退化的npc模型。

之前比较cytoprotective效应退化的npc, DMF的剂量依赖性细胞毒性效应被CCK-8测量试验。结果表明,10 - 100μMDMF不是有毒npc和细胞生存能力明显增加10 - 50μM DMF处理(图1 (b))。后,扭转了DMF对LPS-induced npc损伤测量的影响。图1 (c)表明DMF缓解全国人大可行性降低LPS引起的剂量依赖性的方式。值得注意的是,全国人大可行性时几乎一致对照组DMF浓度是50μ米,这表明DMF治疗有效逆转LPS-induced细胞损伤。因此,我们选择了50μM DMF作为LPS-challenged npc获救的浓度。

3.2。Nrf2 / HO-1通路参与了改善LPS-Challenged npc细胞生存能力

进一步探索如何DMF保护LPS-challenged npc细胞损伤,免疫印迹分析应用于检测Nrf2及其下游效应HO-1水平。图2(一个)表明,有限合伙人政府抑制Nrf2 HO-1表达式,而其水平恢复在很大程度上在DMF治疗。随后,Nrf2的具体成分是用于进一步证实Nrf2 / HO-1退行性npc的角色。首先,Nrf2成分的可拆卸的效率被RT-qPCR和免疫印迹检测,而mRNA Nrf2水平降低了80%,Nrf2的表达水平降低了85%(图2 (b)可用),这意味着它是一个特定的shRNA Nrf2击倒。如图2 (c),Nrf2击倒废除HO-1的调节表达DMF LPS-challenged npc治疗。这表明HO-1 Nrf2下游所做的工作。此外,npc可行性确定使用CCK-8化验Nrf2击倒。图2 (d)显示LPS-challenged npc的可行性与DMF治疗增加,而Nrf2击倒显著的保护作用减弱了DMF LPS-challenged npc。这些结果表明,DMF对退行性产生保护作用通过触发npc Nrf2 / HO-1通路。

3.3。DMF LPS-Induced改善氧化应激和炎症细胞因子的表达在npc

在氧化应激,过量的活性氧生成促进椎间盘变性的过程(26]。如图3(一个)在npc,活性氧积累显著增加LPS诱导后与对照组相比,在DMF处理降低活性氧产量有限合伙人的挑战。Nrf2击倒逆转LPS-challenged npc的升高活性氧的生产。谷胱甘肽(GSH)被认为是至关重要的在保护细胞免受活性氧产量。因此,我们决定了细胞内谷胱甘肽形成的定量评估减少谷胱甘肽(GSH)氧化谷胱甘肽(GSSG)在npc luminescence-based化验(图3 (b))。结果显示,DMF显著提高而有限合伙人挑战特别是减少谷胱甘肽(GSSG的比率。和DMF显著逆转的比率在npc谷胱甘肽(GSSG LPS引起的挑战。然而,Nrf2击倒中和这LPS-challenged npc DMF的逆转作用。

在氧化应激反应,一系列的炎性细胞因子分泌的npc。因此,免疫印迹确定p-NF的表情——被处决κB, il - 1β和肿瘤坏死因子-α。显示在图3 (c)的表情p-NF -κB, il - 1β和肿瘤坏死因子-α与LPS组相比减少了DMF。同样,这些炎性细胞因子的水平在Nrf2击倒(图中恢复过来3 (c))。这些结果表明,DMF减毒LPS-induced氧化应激和炎症在npc Nrf2 / HO-1通路的激活。

3.4。DMF改善ER Stress-Mediated LPS-Challenged npc细胞凋亡

ER应激是NPC细胞凋亡的主要原因之一。在这里,我们表明,DMF处理降低ER应激水平的增加标记毕普LPS-challenged npc(图4(一))。然而,Nrf2击倒逆转毕普的增强表达有限合伙人在npc的挑战。这表明DMF处理抑制ER应激引起的有限合伙人通过Nrf2 / HO-1途径。

一般来说,过度或者长期的ER应激会引起细胞凋亡。免疫印迹结果说明活动caspase-3的表达式和伯灵顿提拔,而LPS-challenged npc的bcl - 2是降低水平与对照组相比(图4 (b))。Calpain-2涉及caspase-12激活依赖于Ca^{2 +}通量下ER应激(27]。我们的研究结果表明,calpain-2的表达式和活跃的caspase-12增加LPS-challenged npc与对照组(数字4(一)和4 (b))。这表明LPS诱导ER stress-mediated通过calpain-2 / caspase-12-dependent通路在NPC细胞凋亡,从而导致NPC细胞凋亡和随后椎间盘变性。然而,治疗DMF calpain-2的水平降低,活性caspase-12活跃caspase-3,伯灵顿和bcl - 2在LPS-challenged npc的水平增加。DMF的抵消这些影响Nrf2击倒(数字4(一)和4 (b)),建议DMF减毒ER stress-mediated通过激活细胞凋亡在LPS-challenged npc Nrf2 / HO-1通路。细胞凋亡被处决的流式细胞术,进一步证实了DMF对ER stress-mediated凋亡的影响(图4 (c)),与免疫印迹数据是一致的。

3.5。DMF缓解LPS-Challenged npc功能障碍

氧化应激、炎症和ER stress-mediated细胞凋亡在类发展合作。退行性椎间盘,蛋白聚糖的合成(能Col-II)减少,基质金属蛋白酶的表达基质金属蛋白酶和aggrecanases增加促进矩阵退化;然后蛋白聚糖被Col-I所取代。在我们的研究中,水平的MMP-13, aggrecanase 1和Col-I都得到了提高,同时能的水平和Col-II减少LPS-challenged npc与对照组相比。DMF处理MMP-13的水平下降,aggrecanase 1, Col-I但增加和Col-II能的水平。然而,也抵消这些影响Nrf2击倒(图5)。

4所示。讨论

当前的管理类只能缓解症状,但不能解决的基本病理变性。在临床治疗中,生长因子或蛋白酶抑制剂注入类组织应用于早期类但有限的治疗效果(28),而操作用于缓解神经压迫年末类但无助的恢复类的(29日]。因此,一个更好的策略是必要的。

在目前的研究中,我们调查了DMF能否减弱npc的退化。结果表明,DMF的保护机制是相关Nrf2 / HO-1信号通路的激活可以缓和LPS-induced氧化应激,炎症和ER stress-mediated npc细胞凋亡。它可能是一个新颖的治疗选项,可以用来减轻椎间盘变性。

Nrf2 / HO-1通路,抗氧化的主要细胞防御系统压力和抗炎反应,在保护中扮演不可或缺的角色从变性椎间盘24,30.,31日]。DMF, Nrf2催化剂,应用于治疗多发性硬化和银屑病(32,33]。氧化应激不仅提高矩阵退化和炎症,还能促进细胞凋亡的可行性和功能细胞微环境的试管(34]。许多抗氧化药物,如阿司匹林、fullerol和小檗碱,用于改善ROS类(26,35,36]。它证明了DMF激活Nrf2刺激生产谷胱甘肽(GSH),这是最重要的活性氧清除剂(33),因此,保护细胞免受ROS-induced细胞毒性。在这里,我们表明,DMF减少ROS的产生通过激活Nrf2 / HO-1信号通路。我们还观察到DMF-treated npc的谷胱甘肽产量增加,从而消除过多的活性氧产量LPS-challenged npc通过激活Nrf2 / HO-1信号通路。Nicolay等人证明了DMF下调NF -κB在皮肤t细胞淋巴瘤细胞,恢复细胞凋亡敏感性,抑制肿瘤的生长37]。我们的研究表明,DMF也下调p-NF——的表达κB在LPS-challenged npc。核易位NF -κB启动炎性细胞因子的转录。重要的是,肿瘤坏死因子-α和il - 1β移植基质降解基质金属蛋白酶的表达和两个主要aggrecanases (ADAMTS-4和ADAMTS-5)在npc (38,39]。在我们的研究中,促炎细胞因子(il - 1的表达β肿瘤坏死因子-α)、MMP-13和aggrecanase 1增加LPS-challenged npc。DMF促炎细胞因子的表达,使之抑制il - 1β和肿瘤坏死因子-α,通过激活Nrf2 LPS-challenged npc / HO-1信号通路,从而表达下调MMP-13 aggrecanase 1的表达,减少矩阵Col-II组成和退化和能改善试管恶化的过程。

它依靠ER函数的npc产生细胞外基质,以确保组织能够更好地承受静水压力增强和维护NP的正常功能(40]。蛋白质类流程,ER-related监护人毕普是调节在阀瓣13,41]。在这里,我们还表示,在LPS-challenged npc毕普的表达增加。持久的ER应激已经证明在类与NPC细胞凋亡有关,导致人大数量下降,随后盘矩阵的合成减少,但潜在的机制仍然难以捉摸。报告指出,受损的Ca^{2 +}体内平衡中扮演着重要的角色在糖化终产物——(年龄)介导的ER应激和随后的细胞凋亡在npc (42]。在这项研究中,我们发现,Ca^{2 +}端依赖蛋白酶calpain-1 LPS-challenged npc中却在增加。此外,其下游的活性效应caspase-12和蛋白质与细胞凋亡相关(caspase-3,伯灵顿)也增加了LPS诱导。DMF治疗减少这些高浓度LPS-challenged npc由于Nrf2 / HO-1通路的激活。这表明DMF治疗改善LPS-induced ER stress-mediated凋亡依赖calpain-1 / caspase-12通路,从而扭转其在椎间盘的损伤在npc。因此,全国人大细胞凋亡率和椎间盘的退化矩阵(Col-II能)也减少了DMF治疗。我们的研究提供了一种新的思想ER stress-mediated细胞凋亡机制的类。

结论在当前研究的基础上在体外结果。虽然人类的npc源自于椎间盘被用来模拟在活的有机体内条件在某种程度上,有限合伙人治疗不同于实际的生理或病理条件。此外,试管的氧化应激损伤和inflammation-mediated凋亡被广泛的研究,但ER stress-mediated细胞凋亡的具体机制还不清楚。在这里,我们表明LPS诱导ER stress-mediated凋亡依赖calpain-1 / caspase-12退行性npc的途径。角色的其他分支的ER应激介导细胞凋亡类过程中仍需进一步探讨。

5。结论

总之,我们证明了DMF有效缓解氧化应激,炎症,和ER跟压力通过Nrf2 / HO-1信号通路的激活细胞凋亡,改善类的过程在体外,这可能是一个潜在的小说类治疗的目标。

缩写

能:	Aggrecan
房颤:	纤维环
Col-I:	I型胶原蛋白
Col-II:	II型胶原蛋白
DMF:	富马酸二甲酯
呃:	内质网
的边后卫:	胎牛血清
谷胱甘肽:	谷胱甘肽
HO-1:	血红素oxygenase-1
il - 1β:	Interleukin-1β
试管:	椎间盘
类:	椎间盘变性
腰痛:	腰痛
NP:	髓核
NPCM:	髓核细胞中
npc:	髓核细胞
NQO-1:	NADPH醌oxidoreductase-1
Nrf2:	核转录因子、红细胞2 2
OD:	光密度
ROS:	活性氧
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

RW、DL、ZL和HH设计研究,进行研究,写论文。作者阅读和批准最终的手稿。

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