转录组分类揭示分子子组患者的乙型肝炎病毒

文摘

乙型肝炎病毒(HBV)专门感染肝细胞,这可能会导致进行性肝纤维化和肝癌的风险显著增加。多项研究表明宿主基因、病毒学、免疫学因素可能会影响乙肝病毒感染。然而,这种现象的潜在机制参与了乙型肝炎病毒感染仍不清楚。基于基因表达数据的分析124名乙肝病毒的患者(GEO加入:GSE84044),分子子组的患者感染了乙型肝炎病毒被确认在这项研究中,包括C1, C2, C3组。年龄、纤维、化学和炎症程度和基因表达差异也在三个采样组相比。此外,肝脏指数计算93个肝脏特异性基因。乙肝病毒的肝脏特异性基因表达在不同的分子子组患者彻底分析,然后与纤维化和炎症的水平。结果表明,C2组是最小的和C3组最高程度的纤维化和炎症。富集分析表明,代谢相关途径主要是表达了C1和C2组,在癌症和炎症相关的通路和蛋白聚糖C1和C3组中高度表达。肝脏指数高于C1和C2组C3组C3组最低。 Macrophage M1/M2 and neutrophils were significantly different in the three groups. M1 was mainly abundant in the C3 group, and M2 and neutrophils were mainly abundant in the C2 group. This study provides novel information to understand the mechanisms of HBV infection in chronic hepatitis B (CHB) patients.

1。介绍

1966年发现的(1),乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个全球公共卫生威胁(2]。据报道,全球有2.4亿人感染乙型肝炎病毒(3]。乙型肝炎病毒感染导致进行性肝纤维化和肝癌的风险显著增加。大约有650000人死于与乙型肝炎病毒有关的肝硬化或肝癌(每年4]。中国的情况更严重,大约1.7亿HBV-infected人5,6]。因此,深入探索病理特点及发病机理是乙肝病毒的预防和控制具有重要意义。

如今,许多监管机构与乙型肝炎病毒相关研究,参与了乙型肝炎病毒的致病过程。全基因组关联研究(GWAS)已经被用来识别基因变异位于基因如HLA-C [7),新的高度8],TCF19 [9]。此外,HBx蛋白质增强肝癌侵袭转移关系在活的有机体内和体外(10),这种蛋白质的截断能启动hepatocarcinogenesis [11]。乙型肝炎病毒感染的治疗,抑制病毒复制是当前研究发现的主要方法和展品来减少病人的死亡率和发病率12,13]。值得注意的是,toll样受体(TLR)配体可以作为一个有前途的抗病毒药物靶点的乙型肝炎病毒感染(14]。具体来说,乙肝病毒疾病的病理学与慢性炎症密切相关,它是一个动态的过程策划的病毒复制和宿主免疫反应之间的复杂的相互作用[15]。和多个关键相关监管机构调节乙肝病毒感染和炎症,如IFI16 AIM2, p46 [15- - - - - -18]。

在过去的几十年中,一些抗病毒的药物靶点发现了乙肝病毒感染(19,20.]。例如,hnRNPK被调节乙肝病毒的复制的效率(19]。击倒hnRNPK导致减少乙肝病毒的病毒载量(19]。PLK1主机的一个关键因素是乙肝病毒复制的细胞(20.]。阻塞PLK1可以抑制HBV DNA生物合成和强烈抑制乙型肝炎病毒感染的小鼠模型20.]。然而,目前乙肝病毒治疗仍不能有效地根除该病毒从慢性乙型肝炎患者21,22]。乙肝病毒治疗方案只包括核苷/核苷酸类似物(NUCs)和免疫调节代理α干扰素(IFN -α)[23,24]。此外,乙肝病毒再活化的风险上升当病人接受免疫抑制或抗肿瘤治疗25]。因此,药物靶点的识别和潜在机制HBV-infected病人急需。在这项研究中,我们收集了转录组数据从公共数据库和数据进行了系统分析,旨在识别基因参与了乙型肝炎病毒感染和发现潜在的机制。

2。材料和方法

2.1。乙肝病毒患者的基因表达数据的集合

获得的基因表达数据从基因表达综合(GEO)加入GSE84044 [26》,其中包括124年慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者。总结了临床特征表1。基于这个点基因表达矩阵用于分析在这项研究。

2.2。共识的聚类算法

样本的共识集群GSE84044数据集是由ConsensusClusterPlus R包(27]。集群的数量取决于累积分布函数(CDF)和一致性的分数在所有集群(大于0.8)。

2.3。肝脏指数计算

我们执行single-sample基因集富集分析(ssGSEA)使用R gsva包(28)计算肝脏指数使用93肝脏特异性基因,这代表了正常肝代谢功能从先前的研究29日]。

2.4。差异基因表达分析

微分表达式分析是由R DESeq2包(30.]。基因与调整值< 0.05和 被视为差异表达。

2.5。评价肿瘤浸润免疫细胞

22肿瘤浸润淋巴细胞的比例在肝脏组织的计算是通过CIBERSORT子集(31日]。除此之外, 被认为是一个精确的免疫细胞分数,和细胞之间的比例由Wilcoxon-rank和测试组比较。

2.6。功能富集分析

基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路为每个选定的模块进行群体使用R clusterProfiler富集分析包(32]。项目与调整 被认为是重要的。肝脏特异性基因的富集分析是由基因集富集分析。基因被统计排名计算R DESeq2 [30.)包。

2.7。统计分析

学生的 - - - - - -测试是用来比较基因表达肿瘤和正常组织之间的差异。所有的数据都是通过使用R软件(版本4.0.2)。值< 0.05是设置为所有的分析具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。识别的分子子组患者的乙型肝炎病毒

基于基因表达数据的124乙肝病毒的患者(GSE84044),一致聚类算法被用来将所有样本划分为三类,即C1, C2, C3, 38, 57岁和29个样品分别(图1(一))。样品被分成三类根据累积分布函数(CDF)和一致性的分数。CDF实验组的分析表明,在三个类别,提供曲线下的面积没有增加显著(图1 (b));同时,一致性评分必须大于80%在每个集群(图1 (c))。最终,被选为下游分析三个方面。

3.2。三个子组有显著的年龄差异,纤维化和炎症的水平

进一步探索临床意义的样本分类、年龄、纤维化和炎症的三组样本进行比较。具体来说,的年龄年轻比C1和C2组C3组,但C1和C3组之间没有差异观察(图2(一个))。纤维化和验证的程度分为5个层次,从0到4分。得分越高,越严重纤维化。的比例高于5水平的C1, C2, C3组明显不同(数字2 (b)和2 (c))。具体来说,纤维化和炎症的程度比的C1和C2组轻C3组C3组最严重,其次是C1组。这些结果表明,C2可能有一个更高的等级在乙型肝炎病毒感染的发病的过程。

3.3。分子鉴定的分子子组

进一步探索每一组的分子水平上的差异,DESeq2包就业,三组相互比较。总共有2006个差异基因筛选( 和 ,补充表S1)。无监督聚类的2006个基因分类这些基因可以分为四个模块,名叫M1-M4(图3(一个)补充表S2)。通过基因集富集分析,发现M1主要是丰富的代谢途径和PPAR信号,这是主要表达在C1和C2组织;平方米,M4炎症相关的途径,主要是丰富的和M3的具体途径在癌症、蛋白聚糖和M2, M3, M4主要表达在C1和C3组。的高表达两组(图3 (b))表示,这两组患者的癌前病变有较高的倾向。

3.4。子群C2保护肝脏功能高于C1和C3

因为模块M1主要代谢途径和C2组织中高度表达,我们比较C2和C3 C1,发现liver-specifically表达基因(29日]在C2与C1和C3高纯度高表达基因(图4(一), )。结合single-sample基因集富集分析(ssGSEA)方法和93年liver-specifically表达基因,肝脏指数(肝指数)。结果表明,肝脏指数明显高于比C1和C2组C3组和肝指数的C3组最低(图4 (b))。同时,肝脏指数也高与纤维化和炎症水平负相关(数字4 (c)和4 (d))。

3.5。微分的免疫细胞丰度分子子组

随着C3组更高层次的炎症,CIBERSORT是用来计算每个样本的免疫细胞的相对比例。具体来说,M1 / M2巨噬细胞和中性粒细胞显示三组(图之间的显著差异5(一个))。值得注意的是,M1和M2高度负相关(图5 (b)),表明这两种细胞类型可能是互斥的。具体来说,M1主要是丰富的C3组和M2和中性粒细胞主要是丰富的C2组(图5 (c))。

4所示。讨论

全世界超过3亿人感染了乙肝病毒,感染率较高的发展中国家(33- - - - - -35]。特别是,乙型肝炎病毒感染的发生率超过8%在大多数亚洲地区(33]。此外,四分之三的人感染乙型肝炎病毒甚至不知道他们被感染33]。有一个显著的基因型差异之间的婴儿HBV-infected孕妇和那些没有乙型肝炎病毒感染(36]。这种因果关系可能HBV-driven [36]。与此同时,乙肝病毒被认为是人类致癌病毒,但其肿瘤发生的分子机制尚不清楚37]。在这项研究中,生物信息学方法被用来分析124名乙肝病毒患者的基因表达数据,进一步探索乙肝病毒的不同的分子子组患者,包括年龄、纤维化炎症程度,以及相关的通路。此外,肝脏指数计算93个肝脏特异性基因。乙肝病毒的肝脏特异性基因表达在不同的分子子组患者彻底分析,然后与纤维化和炎症的水平相比。

从124名乙肝病毒患者的基因表达数据,确定了三种类型的亚分子,即C1, C2, C3。结果表明,C2组是最年轻的和C3组最严重的肝纤维化和炎症。C1和C2组metabolic-related通路密切相关,在炎症和癌症相关的通路与C1和C3组密切相关。许多研究已经表明,一些途径HBV患者与正常人不同,乙肝病毒治疗也是一个起点。例如,HBV - stat3 mir - 328 - 3 - p - foxo4轴参与慢性乙肝病毒感染的发病机理(38]。乙肝病毒损害干扰素活动通过劫持干扰素/ JAK / STAT通路e抗原(39]。C2组的肝脏指数高于其他两组,和肝脏指数的C3组最低。同时,肝脏纤维化和炎症指数高度负相关,这与浓缩通路分析是相一致的。

值得注意的是,我们确定了2006个差异表达基因的三种类型中乙肝病毒的病人。使用无监督聚类分析,我们发现2006个基因可以分为四个模块,M1-M4命名。生物信息学分析表明这些模块相关调节多个乙型肝炎病毒感染和肝肿瘤发生的关键途径。例如,M1是丰富的代谢途径和PPAR信号。过氧物酶体proliferator-activated receptor-gamma共激活剂1α(PGC-1alpha),一个主要的代谢调节剂,被强烈coactivate乙肝病毒转录(40,41]。M3尤其参与调节蛋白聚糖在癌症。蛋白聚糖的特点是中央蛋白骨干与线性装饰硫酸粘多糖侧链。调节相关蛋白聚糖是生化和间质细胞外基质的机械性能。各种研究表明蛋白聚糖增强恶性转化和改变抗肿瘤治疗的反应42]。平方米,M4炎症相关的途径主要是丰富的,如IL-17信号和Th1、Th2细胞分化,参与调节乙型肝炎病毒感染和肝癌症恶化。例如,IL-17激活il - 6 / STAT3信号通路在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的扩散43]。乙型肝炎病毒抗原递呈细胞,引起肝损伤诱发IL-23生产通过IL-23 / IL-17轴[44]。

一些局限性也应该注意在这个研究。首先,本研究的结论是获得使用生物信息学分析,缺乏实验验证。我们将验证样本的临床意义分类通过收集临床样本。其次,几个中心信号通路被发现调节乙肝病毒感染,如PPAR信号、和炎症相关的通路。探索这个信号的影响HBV感染pathway-specific抑制剂可能会进一步加强本研究的发现。总之,我们的研究首次全面展示了乙肝病毒的潜在机制促进肝纤维化、肿瘤进展。

5。结论

总之,使用生物信息学完成和分析HBV患者的基因表达数据,得到了很多有用的信息,为进一步的理解提供了一个参考乙肝病毒的致病机理和预测价值。

数据可用性

之前报道基因表达和临床数据被用来支持这项研究和在基因表达综合(地理,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)。这些先前的研究(和数据)援引在文本里的相关位置的引用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

x l和h . s .本研究设计的。c . z和j·l·进行了数据分析和可视化和实验。c . Z。,L. Y., F. X., and J. L. contributed to the writing of the paper and setting of figures. Conghui Zhang and Jie Li contributed equally to this work.

确认

这项工作是支持的开放研究计划的中国病毒学国家重点实验室(批准号2019 kf004),优秀的领导人浦东上海卫生局的培训项目(批准号PWR12018-05),浦东的关键学科组建设项目上海卫生局(批准号PWZxq2017-15),重点实验室开放基金的浙江省消化系统肿瘤的诊断和治疗(批准号kfjj - 202007)。

补充材料

补充1。补充表S1: subgroup-specific基因在慢性乙肝患者的三个子组。

补充2。补充表S2:特定于模块的功能基因在慢性乙肝患者。

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