文摘

甲状腺癌(TC)是最常见的内分泌恶性疾病发病率逐年上升。积累的研究表明,小分子核糖核酸(microrna)发挥监管作用在各种肿瘤的进展,但mir - 196 a的分子调控机制在TC - 2仍然是未知的。存在是用来衡量mir - 196 a - 2的表达和NRXN1 mRNA在TC细胞,在免疫印迹检测NRXN1的蛋白表达。CCK-8、集落形成和流式细胞术分析是用来衡量TC细胞的细胞增殖和细胞凋亡。Dual-luciferase报告基因分析是用来预测和验证目标绑定关系mir - 196 - 2和NRXN1。我们的研究结果显示,mir - 196 - TC - 2戏剧性的过表达在细胞,当NRXN1低表达。mir - 196 - 2可以促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的TC。此外,mir - 196 a - 2也可以目标和抑制NRXN1的表达。沉默NRXN1可以逆转的抑制效果上差别mir - 196 a - 2对这些细胞增殖的TC,以及促进对细胞凋亡的影响。在结论中,我们发现mir - 196 a - 2可以促进细胞增殖和抑制细胞凋亡的TC瞄准NRXN1。 Therefore, miR-196a-2/NRXN1 is potential to be a molecular therapeutic target for TC.

1。介绍

甲状腺癌(TC)主要是由甲状腺结节癌变引起,和它的发病率占所有癌症的2.5%和90%的内分泌肿瘤(1]。据统计,TC的检出率以每年4.5%的速度增长,近年来(2),严重影响人类的健康。当前TC的治疗方法主要有手术、放疗、化疗。虽然在这些治疗取得了很大的进步,肿瘤复发和转移的患者的结果仍不满意,和年存活率仅为59%3,4]。因此,有必要推出TC进展的机制和发病机理,从而为我们提供一个完整的和先进的TC治疗方案。

小分子核糖核酸(microrna)是一类非编码小RNA分子,可以绑定到mRNA的互补的区域调节信使RNA降解或翻译(5,6]。证据存在,许多microrna表达异常在TC组织,他们是肿瘤发病机制的关键。例如,王等人表示,mir - 497在TC表达下调,mir - 497可以抑制生长和转移的TC针对脑源性神经营养因子(BDNF) (7]。赵等人还透露,mir - 96 - 3 - p是调节在TC, mir - 96 - 3 - p可以直接目标复杂iron-sulfur琥珀酸脱氢酶亚基B (SDHB)促进肿瘤转移8]。吴et al。9)发现mir - 429抑制细胞生长和凋亡的人类TC细胞通过针对锌指E-box-binding同源框1 (ZEB1)。傅et al。10)发现mir - 196 - TC - 2是调节和作为一个独立的TC的不良预后因素。唐et al。11)发现mir - 196 a - 2 TC患者总生存期呈负相关。因此,mir - 196 a - 2是否发挥作用在TC进程和它的功能需要验证。在这项研究中,mir - 196 a - 2的表达在TC决心和mir - 196 a - 2的影响细胞增殖和细胞凋亡。此外,mir - 196 a的分子机制在TC - 2研究最终提供一个理论依据mir - 196 a - 2为TC分子治疗目标。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

这三个人类TC细胞系TPC-1 (BNCC338689) KTC-1 (BNCC340144), ftc - 133 (BNCC337959),正常的人类甲状腺细胞线HTori-3 (BNCC338687)。HTori-3和KTC-1细胞株培养F-12k介质(BNCC341829)。ftc - 133细胞株培养在罗斯威尔公园纪念研究所1640 (rpmi - 1640)中。TPC-1细胞株培养在l - 15 (BNCC341687)媒介。所有媒体都补充10%胎牛血清的边后卫。细胞培养在湿润孵化器有限公司为5%2在37°C。所有的细胞系和媒介购买从希伯来文名字文化集合(BNCC)(中国)。

2.2。细胞转染

mir - 196 a - 2模拟(miR-mimic), mir - 196 a - 2抑制剂(miR-inhibitor) sh-NRXN1,及其对应的负控制(NC-mimic、NC-inhibitor sh-NC)都从GeneChem访问(上海,中国)。Lipofectamine 2000(美国卡尔斯巴德英杰公司)在50 nM是用来使转染miR-mimic, miR-inhibitor, sh-NRXN1,相应的数控TC细胞ftc - 133。细胞转染48 h后,进行后续研究。

2.3。实时定量聚合酶链反应(存在)

细胞总RNA是孤立的指令试剂盒试剂(表达载体,热费希尔科学,Inc .)。与TransScript互补DNA(互补)是合成第一链cDNA合成SuperMix工具包(TransGen生物技术,北京)协议。最后,执行中存在7500年应用生物系统公司检测系统使用TransStart绿色qPCR SuperMix (TransGen生物技术,北京)制造商的指示。相对表达规范化了2- - - - - -ΔΔCt与U6 GAPDH和应用方法,内部参考mir - 196 - 2和NRXN1,分别。实验重复三次。引物序列详细表1。

表1
引物序列中存在。
2.4。免疫印迹

细胞细胞溶解与里帕裂解缓冲(美国马热费希尔科学)冰10分钟获得总蛋白质,蛋白质含量和量化了BCA试剂盒(美国沃尔瑟姆热费希尔)。此后,30μg蛋白样品被钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page) 90分钟,与分离蛋白质顺序加载到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(圣克鲁斯生物技术公司,美国)。阻塞在5%的脱脂牛奶60分钟后,细胞膜是孵化主要抗体兔子反NRXN1或兔子反GAPDH一夜之间在4°C,紧随其后的是添加辣根过氧化物酶,(合)共轭二次抗体山羊anti-rabbit免疫球蛋白g h和l 1 h在室温下的杂交。最后,ECL工具包(Solarbio,北京)是用于检测细胞膜上的蛋白质信号根据指令。本研究中使用的所有抗体来自Abcam(英国剑桥)。实验重复了一式三份。

2.5。细胞计数Kit-8 (CCK-8)测定

CCK-8试验来评估TC ftc - 133细胞的增殖能力。100年μl ftc - 133细胞( 细胞/毫升)接种到96孔板,然后板是安排在湿润孵化器有限公司为5%2在37°C为0,24、48和72 h。在指定的时间点,10μl CCK-8试剂(Dojindo分子技术,Inc .,熊本,日本)提供了细胞培养在37°C 2 h。最后,光密度(OD)值的每个测试在450 nm标仪(型号550;Bio-Rad实验室、Inc .、大力神、钙、美国)。每个实验重复三次。

2.6。集落形成实验

执行一个集落形成试验,ftc - 133细胞( )被接种到6-well板,6-well板放置在一个孵化器有限公司5%2细胞培养的37°C。媒介在井每4天更换一次,可见菌落出现后丢弃。殖民地和4%多聚甲醛固定在室温下15分钟,其次是与0.1%结晶紫染色法在室温下10分钟。之后,井中的残余结晶紫与PBS冲走,和殖民地形成的井的数量计算。实验重复三次。

2.7。细胞凋亡检测

细胞凋亡实验被用来观察TC ftc - 133细胞的凋亡率。首先,2毫升的ftc - 133细胞( 细胞/毫升)被播种在6-well板,然后种植在湿润环境中有5%的公司2在37°C 24 h。然后,细胞受到荧光染色根据指令的FITC膜联蛋白V凋亡检测设备(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国),和流式细胞仪口径(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国)是用于检测细胞凋亡。实验重复了三次:Q1(机械死细胞(%)),Q2(晚期凋亡细胞(%)),第三季(早期凋亡细胞(%))和第四季度(活细胞(%))。公式如下: 。

2.8。Dual-Luciferase报告基因分析

dual-luciferase检测、放大变异或野生型NRXN1 3 - - - - - -UTR (NRXN1-Mut或NRXN1-Wt)被克隆到psiCHECK-2 dual-luciferase向量(Promega,麦迪逊,WI)。在100年转染μl TC细胞ftc - 133 ( 细胞/ ml)接种到96孔板,然后,NRXN1-Mut / NRXN1-Wt和miR-mimic / NC-mimic cotransfected到使用Lipofectamine 2000 (ftc - 133细胞表达载体;热费希尔科学,Inc .)。48小时后,萤火虫,Renilla荧光素酶测定荧光素酶活动的记者分析系统(美国Promega)和实验重复了三次。

2.9。统计分析

数据管理和分析处理GraphPad棱镜6 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。提出了测量数据 。多个组之间的差异是由单向方差分析评估(方差分析)显著性检验,然后,学生 - - - - - -测试是用于事后测试。比较两组学生的 - - - - - -显著性检验的测试。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。mir - 196在TC - 2是调节细胞

积累资料表明,microrna在各种肿瘤恶化起着至关重要的监管作用。结合相关参考文献,我们选择mir - 196 - 2,很少被报道为研究对象。存在应用于观察mir - 196 a - 2表达水平在正常甲状腺上皮细胞HTori-3和TC细胞ftc - 133, TPC-1, KTC-1。发现mir - 196 a - 2的表达明显高于在TC细胞比HTori-3细胞,和表达差异是最重要的在ftc - 133细胞(图1(a))。因此,ftc - 133细胞被选为后续实验。上述实验照亮,mir - 196 a - 2在TC细胞高表达。


图1
mir - 196 - TC - 2是调节。(a)中存在发现mir - 196 a - 2的表达在HTori-3交通- 133,TPC-1, KTC-1。 。
3.2。沉默mir - 196 a - 2抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的TC

进一步验证mir - 196 a - 2可以促进TC的恶性进展,miR-inhibitor首先转染成TC ftc - 133的细胞,它证实了存在的转染miR-inhibitor可能下调mir - 196 - 2的表达在ftc - 133细胞(图2(一个))。然后,沉默的影响mir - 196 a - 2在ftc - 133细胞的增殖和凋亡是通过观察细胞生物功能实验。CCK-8和集落形成化验的结果,沉默mir - 196 a - 2可以显着地抑制ftc - 133细胞的增殖和集落形成能力(数据2 (b)和2 (c))。也发现沉默mir - 196 a - 2可以显著促进细胞凋亡ftc - 133就是明证流式细胞术(图2 (d))。通过以上实验,发现mir - 196 a - 2能促进细胞增殖,减少细胞凋亡的TC。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图2
沉默mir - 196 a - 2抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的TC。(a)的影响上miR-inhibitor mir - 196 a - 2的表达在ftc - 133细胞中检测到存在;(b)的影响沉默mir - 196 a - 2在ftc - 133细胞的增殖CCK-8探测到;(c)的影响沉默mir - 196 a - 2在ftc - 133细胞的集落形成能力由集落形成实验检测;(d)的影响沉默mir - 196 a - 2 ftc - 133细胞凋亡观察到细胞凋亡测定; 。
3.3。的直接目标是NRXN1 mir - 196 - a - 2

机制的进一步研究mir - 196 - TC - 2促进恶性发展,NRXN1有针对性的结合位点的mir - 196 a - 2终于发现(图3(一个))。确认监管关系mir - 196 - 2, NRXN1 NRXN1的表达在细胞首先发现。结果表明NRXN1在TC的表达显著下调(数字3 (b)和3 (c))。接下来,NRXN1在ftc - 133细胞的表达和沉默mir - 196 a - 2评估中存在和免疫印迹。结果了,沉默mir - 196 a - 2显著调节NRXN1在ftc - 133细胞的表达(数字3 (d)和3 (e))。最后,有针对性的绑定关系mir - 196 - 2和NRXN1被dual-luciferase验证报告基因分析。结果显示,mir - 196 a - 2模拟不会影响NRXN1-Mut组的荧光素酶活性,但它会降低NRXN1-Wt组的荧光素酶活性(图3 (f))。基于上述研究,确认,mir - 196 a - 2可以直接调节NRXN1的表达。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图3
的直接目标是NRXN1 mir - 196 - a - 2。(一)结合位点之间mir - 196 - 2和NRXN1;(b, c)中存在和免疫印迹检测到的表达在HTori-3 NRXN1, ftc - 133, TPC-1, KTC-1细胞;(d, e)的影响沉默mir - 196 a - 2 mRNA和蛋白表达的NRXN1 ftc - 133细胞中检测到存在和免疫印迹;(f)目标绑定关系mir - 196 - a - 2和NRXN1被生物信息学分析和预测了dual-luciferase报告基因分析; 。
3.4。mir - 196 a - 2调节细胞增殖和细胞凋亡的TC瞄准NRXN1

进一步证实,mir - 196 a - 2促进针对NRXN1 TC的恶性进展,NC-inhibitor + sh-NC miR-inhibitor + sh-NC和miR-inhibitor + sh-NRXN1转染到ftc - 133细胞,分别。然后,存在和免疫印迹被探测的表达NRXN1在每组ftc - 133细胞。结果出现,NRXN1的表达显著下调细胞转染和miR-inhibitor sh-NRXN1相比在细胞转染miR-inhibitor(图4(一))。然后,细胞生物功能实验被用来观察细胞增殖和细胞凋亡。CCK-8化验的结果和集落形成试验表明,抑制miR-inhibitor对细胞生存能力和集落形成的影响的TC可以逆转sh-NRXN1(数字4 (b)和4 (c))。细胞凋亡分析也表明,sh-NRXN1逆转细胞凋亡的促进miR-inhibitor TC(图4 (d))。这些研究结果显示,mir - 196 a - 2目标NRXN1刺激细胞增殖和抑制细胞凋亡的TC。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
图4
mir - 196 a - 2调节细胞增殖和细胞凋亡的TC瞄准NRXN1。(a) NRXN1表达检测到存在和免疫印迹;CCK-8 (b)检测细胞增殖能力;(c)集落形成数由集落形成实验检测;(d)细胞凋亡检测到细胞凋亡测定。 。

4所示。讨论

积累报告显示,microrna可以作为致癌基因或肿瘤抑制,和microrna表达异常通常观察到在不同肿瘤(12]。目前,许多microrna分子癌症治疗的目标识别。例如,mir - 122 - 5 - p可以抑制细胞增殖和胆管癌的入侵目标ALDOA,显示其巨大的潜力作为分子治疗目标治疗胆管癌(13]。miR-16-5p可以调节Smad3的表达抑制脊索瘤细胞增殖和转移,而且它也被证明成为脊索瘤的分子治疗目标(14]。mir - 196 - 5 - p可能发挥关键作用epithelial-mesenchymal过渡(EMT),入侵和转移的结直肠癌细胞通过针对我κBα,这对临床治疗有一定的指导意义的人类大肠癌(15]。mir - 196增加胃癌的促进细胞增殖p27 (kip1)抑制,这可能是胃癌的治疗目标,进一步发展成为一个潜在的预后因子(16]。mir - 196 - a - 2的一个亚型mir - 196——一个位于染色体12 HOXC 10和HOXC 12之间,并没有相关实验验证,mir - 196 - 2可以调节肿瘤进展到目前为止(6]。我们的结果验证,mir - 196在TC - 2是调节细胞。沉默mir - 196 a - 2可以抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的TC。这些结果证明的致癌作用mir - 196 - 2,这是一个潜在的人类TC在临床治疗目标。NRXN1是突触前神经元粘附分子,可以与抑制性突触的神经营养因子在大脑中参与突触的形成和维护(17,18]。一些证据表明NRXN1致病基因相关精神疾病,和击倒NRXN1将导致减少星形胶质细胞产生的神经干细胞,从而导致自闭症和精神分裂症(19]。通过文献回顾,透露,很少有研究的作用和机制NRRX1癌症细胞,只有少数研究报道,NRRX1基因相关癌症恶化通过生物信息学方法。例如,太阳et al。20.)透露,NRXN1与总生存期的结直肠癌患者通过全基因组甲基化和表达谱识别、和结直肠癌NRXN1可能是一个有前途的生物标志物。研究Yotsumoto et al。21体现,NRXN1小说可以成为一个潜在的目标抗体药物配合在小细胞肺癌。基于生物信息学的方法,我们发现之间的绑定关系mir - 196 - 2和NRXN1证实NRXN1在TC低表达。此外,发现mir - 196 a - 2表达下调NRXN1和刺激细胞增殖,抑制细胞凋亡的TC,这在TC发挥了致癌作用。

这些观察首次集体展示,mir - 196 - TC - 2是调节,可以目标和抑制NRXN1的表达,从而促进TC的恶性发展。因此,我们的研究奠定了理论依据mir - 196 - a - 2 / TC NRXN1成为分子治疗目标,产生新颖的见解,为TC提供新的策略。尽管如此,mir - 196 a的具体机制在TC - 2需要进一步探索。此外,动物实验在活的有机体内需要做验证的致癌影响mir - 196 - 2,从而提高我们的调查。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。数据和材料在当前的研究中可从相应的作者以合理的要求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

决断力和乔丹为研究设计做出了贡献。LY进行文献搜索。ZZ获得数据。YZ写了这篇文章。全科医生进行数据分析和起草了手稿。决断力和乔丹修改这篇文章。DJ给提交版本的最终批准。耀华风扇和范MingJian贡献同样这项工作。

确认

这项研究得到了民生科技创新研究嘉兴城市,2020 ad30121。